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à‰tude comparative d'un Test de Diagnostic Rapide du paludisme (TDR) avec la Goutte Epaisse (GE) a l'hôpital régional de Bafoussam au Cameroun( Télécharger le fichier original )par Norbert TANKE DONGMO Université Dschang - Cameroun - Master en biologie (option parasitologie) 2012 |
3. Clinique du Paludisme.Cliniquement, on distingue de façon globale le paludisme simple et le paludisme grave ou compliqué.
Le type classique est celui décrit dans la physiopathologie du paludisme simple avec la triade successive frissons - chaleur - sueur accompagnés de fièvres périodiques. (Tierce ou quarte). En absence de traitement deux évolution sont possibles : Splénomégalie et anémies ou alors en cas de P. falciparum, le passage vers un tableau critique : le paludisme grave. (ANOFEL, 2002). Dans la pratique, le paludisme simple ne manifeste pas toujours de façon classique. Ses principaux signes en plus de la fièvre sont :
Selon l'OMS (2006), On parle de paludisme grave lorsqu'un malade avec une parasitémie des formes asexuées de P. falciparum, présente une ou plusieurs caractéristiques cliniques ou biologiques suivantes
Source : (OMS, 2006)
Le paludisme viscéral évolutif ; de la fièvre bilieuse hémoglobinurique sont des formes particulières assez graves de Paludisme à P. falciparum mais non classées comme paludisme grave (ANOFEL, 2002). La néphrite quartane est une néphropathie glomérulaire chronique d'origine palustre survenant chez l'enfant avec syndrome néphrotique. Elle est le fait de P. malariae, (ANOFEL, 2002) Les enfants < 5ans et les femmes enceintes sont les deux groupes les plus vulnérables au paludisme en zone d'endémicité palustre. Ceci s'explique pour les premiers par le fait que le paludisme profite de la disparition de la protection du nouveau-né par les anticorps maternels vers l'âge de 3 mois. L'enfant doit alors se défendre avec ses propres armes. Il lui faut alors du temps pour élaborer ces armes et pendant ce temps la maladie fait des dégâts. S'il ne meurt pas, il acquiert progressivement une immunité labile et incomplète, au prix de nombreux accès palustres graves. Le traitement de cette tranche d'âge est urgent et vital (OMS, 2006). En ce qui concerne la femme enceinte, elle est exposé au risques de paludisme grave surtout vers le 3ème trimestre de la grossesse avec des risques sérieux d'avortement, d'accouchements prématurées, de mort in utéro et de bébé de faible poids à la naissance. Le paludisme et l'infection à VIH/SIDA sont deux problèmes majeurs de santé publique, notamment en Afrique subsaharienne. L'infection par le VIH augmente l'incidence des accès palustres d'autant que l'immunodépression est profonde (OMS, 2006) 4. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME. Pour souligner l'importance de cette partie, rappelons cette citation d'un imminent spécialiste des maladies tropicales, le Professeur Pierre Aubry (2010) : « Nos connaissances sur le paludisme doivent être simples mais leur application doit être rigoureuse. Il n'existe pas de signe pathognomonique du paludisme. Il n'existe pas de manifestations cliniques du paludisme sans parasitémie. ». C'est dire si le diagnostic de certitude du paludisme est avant tout parasitologique ! Les arguments indirects basé sur les variables cliniques (fièvre...) et biologiques (anémie, hyperleucocytose, thrombopénie, hypoglycémie ...), n'ont qu'une valeur orientative même si dans certains cas (enfants < 5ans et cas graves en région de forte endémicité), on doit s'y fier (WHO, 2004 : WHO, 2006 ; WHO, 2008) Le diagnostic du paludisme commence d'abord et avant tout par une symptomatologie clinique fortement évocatrice qui conduit vers la recherche de l'agent causal qui est le Plasmodium. Cinq méthodes ou techniques sont aujourd'hui utilisées dans le domaine de la recherche ou en diagnostic de routine pour la détection des différentes espèces de Plasmodium dans le sang.
C'est la méthode de référence selon l'OMS. Elle implique la réalisation de 2 techniques complémentaires dans l'idéal à savoir la Goutte épaisse (GE) et le Frottis mince (FM). Dans les deux cas, une goutte de sang est étalée sur une lame (goutte plus fine pour le FM). Les étalements sont colorés ensuite selon des méthodes codifiées et validées et après séchage, ils sont examinés au microscope à fort grossissement. Différentes espèces de Plasmodium peuvent ainsi être identifiées et quantifiés à différents stades de leur développement (trophozoïtes, schizontes, gamétocytes) par un microscopiste formé (OMS, 1994)
Elles sont basées sur la détection des antigènes (Ag) spécifiques de Plasmodium spp dans le sang à partir des anticorps (Ac) monoclonaux spécifiques d'une ou plusieurs espèces de Plasmodium. Trois protéines spécifiques de certaines formes parasitaires de plasmodium appelées Ag pour la circonstance sont détectées par les TDR avec en général apparition de deux bandes rouges (P. falciparum seul) ou trois bandes rouges (P. falciparum et autres Plasmodiums) selon les tests, témoignant ainsi de la présence d'une ou de plusieurs espèces de plasmodium dans le sang à tester. Ces tests ont l'avantage d'être simple d'usage, permettent de rendre les résultats dans un délai relativement court (moins de 20 minutes), permettent une meilleure standardisation des résultats. Leur sensibilité varie selon fabricants et les études mais certains ont une sensibilité et une spécificité que l'OMS (2006) juge acceptables (> 95%). Mais ils ne sont pas quantitatifs et ont des caractéristiques liées aux types d'Ag ciblés dont on devrait tenir compte au moment du choix du type de TDR.
Les exemples les plus connus sont le QBC® (Quantity Buffy Coat) et plus récemment le Cyscope®. Le QBC® fonctionne sur le principe suivant : Le sang est prélevé dans un tube micro-hématocrite contenant un fluorochrome (acridine orange) et un flotteur. L'acridine se fixe alors sur l'ADN des différents Plasmodiums. Après une centrifugation à grande vitesse, ce flotteur qui se trouve dans la zone de densité correspondant à celle des hématies parasitées ne laisse qu'un film d'hématies entre lui-même et la paroi du tube, ce qui permet d'examiner cette zone à l'aide d'un dispositif adapté comme le microscope à fluorescence Sa sensibilité est bonne ; elle permet de poser le diagnostic d'espèce. Mais il nécessite un appareillage (microscopes et réactifs) coûteux et demande un certain entrainement du technicien.
Elle consiste à amplifier l'ADN du Plasmodium spp à partir d'un échantillon de sang prélevé afin de le rendre détectable. Ce sont donc des méthodes très sensibles et très spécifiques mais leur mise en place est limitée par leur coût élevé et la nécessité des compétences particulières des techniciens (Snounou et al, 1993).
Elles consistent à rechercher les anticorps spécifiques des espèces plasmodiales par différentes techniques telles que l'ELISA, l'Immunofluorescence Indirecte (IFI) etc. Elles peuvent avoir un intérêt épidémiologique dans les régions où le paludisme est sporadique mais ne sont pas d'usage dans les régions d'endémicité où la plupart des habitants sont relativement immunisés.
5. TRAITEMENT ET PROPHYLAXIE DU PALUDISME. Ø Le traitement du paludisme simple au Cameroun comme dans la plupart des pays touchés par le paludisme, notamment celui à P. falciparum est calqué sur les recommandations de l'OMS (2006). Il préconise l'utilisation des différentes combinaisons d'Artemisinin based Combination Therapy (ACT) en trois jours de prise en association avec un antipyrétique (Paracétamol® ou Aspirine®) à des doses convenables (OMS, 2006 ; MSP, 2007). Quatre ACT sont actuellement recommandées.
Ø La prise en charge du paludisme grave est une urgence. Le traitement de choix ici l'administration de la quinine par voix parentérale (généralement en perfusions de glucosée 5% ou 10%). Les dérivés de l'artémisinine (Paluther®) par voie injectable aussi sont recommandés surtout quand le patient est allergique à la quinine. Il faut noter que les monothérapies antipaludéennes à base de chloroquine, de Sulfadoxine-Pyriméthamine (n'est pas considéré par l'OMS comme une bi-thérapie), et bien d'autres restent d'usage dans certaines régions. Ø Faute de vaccins disponibles, la prophylaxie antipaludéenne associe à la fois des actions individuelles et collectives notamment, la lutte anti-vectorielle, l'utilisation des moustiquaires imprégnées d'insecticides (MII) et des répulsifs, le traitement préventif intermittent (TPI), réservé aux femmes enceintes, l'assainissement de l'environnement y compris la destruction des gîtes larvaires et la prévention chez les voyageurs par une chimio-prophylaxie appropriée et l'utilisation des répulsifs. (OMS, 2006 ; MSP, 2007). 6. PROTOCOLES DU DIAGNOSTIC PARASITOLOGIQUE DU PALUDISME EN ROUTINE Les deux méthodes en usage pour le diagnostic parasitologique du paludisme sont l'examen au microscope optique classique et les tests de diagnostic rapide (TDR) (Wongsrichanalai et al, 2008). L'examen microscopique a l'avantage d'être peu coûteux, très sensible et très spécifique lorsqu'il est utilisé par un personnel rompu à son usage et dans les conditions idéales. Les TDR qui servent à la détection des antigènes parasitaires sont généralement plus coûteux, mais les prix de certains de ces produits ont récemment baissé dans des proportions qui font que leur déploiement est rentable dans certaines situations. Leur sensibilité et leur spécificité sont variables et leur vulnérabilité aux températures élevées et à l'humidité est un inconvénient important (WHO, 2008)
Le prélèvement doit se faire au moment de l'acmé thermique dans la mesure du possible soit par ponction capillaire (Pulpe du doigt, gros orteil etc.) avec confection immédiate du frottis mince (FM) et de la goutte épaisse (GE), soit par ponction veineuse sur anticoagulant approprié (par exemple l'EDTA) et réalisation secondaire des étalements sur lames. C'est acte de soins et à ce titre sa pratique doit respecter les règles de bonnes pratiques de prélèvements notamment en ce qui concerne les mesures à prendre pour éviter tout accident d'exposition au sang (AES) . Les plus importantes sont le port équipements de protection personnelle (gant et blouse) et l'utilisation d'un matériel à usage unique.
Ø Confection d'une GE.
Ø Confection d'un frottis mince.
Figure 4. : Etalements sanguins prêts pour la coloration. Source : www.bioltrop.org Ø Coloration des GE : (Annexe 5) Ø Coloration des FM : (Annexe 4) La coloration de référence des FM est celle au May Grünwald-Giemsa (MGG)
La lecture de la GE se fait à l'objectif 100 et à immersion. Les hématies ayant été presque toutes détruites, on observe surtout les plaquettes et les leucocytes ratatinés. Les différentes formes plasmodiales (trophozoïtes surtout) auront l'aspect de points rouges plus ou moins entourés de demi-anneaux bleus ! (Figure 5 ; au centre). C'est une technique de concentration pour la recherche de parasites dans le sang. En routine, il faut lire au moins 100 champs (MSP, 2006) ; mais en cas de négativité, l'idéal voudrait qu'on aille jusqu'à 400 champs (OMS, 1991), ce qui est vraiment fastidieux. La lecture des GE prend du temps et comme le FM une expertise est requise. (20 minutes sont recommandées par l'OMS pour la lecture par un microscopiste expert d'un frottis avant de le rendre négatif). Elle est qualitative (permet de faire difficilement le diagnostic d'espèce) et quantitative. La parasitémie peut s'estimer ici alors en pourcentage de parasites comptés par rapport aux globules blancs (GB). Ce qui permet par simple règle de trois de déterminer la parasitémie/uL, si l'on connait le nombre de GB/uL (Numération Formule Sanguine). Mais en général de nombreuses littératures s'accordent à calculer cette parasitémie sur la base de 8000GB/uL pour les adultes (Moody, 2002 ; WHO, 2008). La valeur sera alors moins précise que celle obtenue sur FM. § La lecture de la GE exige un effort de concentration et un minimum d'expertise technique car la confection de la GE a entrainé la destruction de la quasi-totalité des GR ainsi que la déformation des plaquettes, des GB et des Plasmodiums. Tout ce qui complique un peu le diagnostic d'espèce. De plus, la coloration des cellules sur GE dépend du pH du liquide de dilution du Giemsa qui doit être de préférence neutre. Ainsi, à l'observation microscopique à l'objectif x100, on peut observer sur fond légèrement bleu des leucocytes, des plaquettes éventuellement et surtout des trophozoïtes de Plasmodium spp. se présentant sous la forme de noyaux rouges pourpre entourés chacun d'un cytoplasme bleu (Figure 5, au centre). Un liquide de dilution acide, favorise la domination des colorants acidophiles (figure 5, à gauche) tandis qu'un liquide basique, favorise la domination des colorants basophiles (Figure 5, à droite).
§ La durée d'exécution des GE est plus longue en absence de dispositif de séchage Figure 5 : Différents aspects microscopiques d'une GE en fonction du pH de l'eau de dilution du Giemsa. (obj.x100) Source : (PNLP, RD-CONGO, 2008)
§ Pour de diagnostic du paludisme, la lecture durera 20 minutes au minimum (OMS)
§ Elle permet d'observer tous les éléments figurés du sang (hématies, leucocytes, Plaquettes) y compris les éventuelles hémoparasites comme les Plasmodiums (forme trophozoïte surtout ; mais aussi gamétocytes ...). A l'observation microscopique (Objectif x100), les trophozoïtes sont intra-érythrocytaires et se présentent en bague de chaton (Noyau rouge excentré et cytoplasme bleu) (Figure 6.) Figure 6 : Trophozoïtes intra-érythrocytaires de P. falciparum sur FM Source : (ANOFEL, 2002) § On peut déterminer la charge parasitaire en estimant la proportion des globules rouges (GR) parasités pour 1000 GR si on connaît le nombre de GR/uL de sang. § Si cette estimation donne par exemple 20 GR parasités pour 1000. et que le patient a 4000 000 de GR/uL (NFS), La parasitémie pour le plasmodium en cause sera = 4000 000x20 /1000= 80 000/uL. § 1. Trophozoïte jeune 2. Trophozoïtes avec pigment malarien R : Rosace (Rares) G : Gamétocytes Le fait que les hématies soient restées intactes permet d'observer les différentes formes parasitaires ainsi que caractéristiques des hématies parasitées qui orienteront le diagnostic d'espèce.
Figure 7 : Différentes formes de P. falciparum sur FM Source : (ANOFEL, 2002)
Il est basé sur la détection d'antigènes (Ag) ou d'anticorps (Ac) de Plasmodium sp dans le sang (hématies ou plasma) du sujet examiné (WHO, 2000). En général, il s'agit de membranes en plastique sur lesquelles ont été fixés les Ac spécifique des Ag à détecter (zone de réaction). Les Ag lorsqu'ils sont présents dans le sang, se fixent sur des Ac combinés à une poudre colorée (Conjugué) avant d'être entrainée grâce à un tampon le long de la membrane en plastique. Au passage sur la zone de réaction (T), les complexes Ag-Conjugué se fixent aux Ac spécifiques. D'où l'apparition d'un trait rouge. L'excédent de conjugué poursuit son parcours jusqu'à la zone contrôle(C) où, il se fixe formant un deuxième trait rouge (Figure 8).
Figure 8. Principales étapes (1, 2 et 3) de réaction d'un TDR Source : (OMS, 2008) Trois (03) groupes d'antigènes plasmodiaux détectés par les TDR disponibles dans le commerce: - la protéine HRP2 (histidine-rich protein 2), spécifique de P. falciparum ; - la pLDH (Plasmodium Lactate Déshydrogenase), enzymes spécifiques des 4 espèces plasmodiales (P. falciparum et les 3 autres à l'exception de P. knowlesi) - l'Aldolase, enzyme spécifique (pan-spécifique). 6.2.2. Matériel et réactifs (En général, il est fourni avec le coffret de tests) o Matériel de prélèvement pour recueillir du sang veineux prélevé sous EDTA ou sang capillaire. (aiguilles, tubes-EDTA, tampon d'alcool, gants, garrot) o Matériel de désinfection o Buffer ou tampon (fourni avec le TDR) o Micropipettes ou pipettes compte-gouttes o Notice d'utilisation. o Chronomètre o TDR (Cassette, savonnettes ou bandelettes)
Si les tests sont au freezeur, les ramener à température ambiante. Mais en général, les TDR disponibles se conservent entre 15 et 30°C (température ambiante en général). Le test peut se réaliser sur le champ ou en différé de 2 jours maximum (sauf si conservation à 2-8°). § Observer bien que le test n'est pas encore périmé § Déballer le TDR et le déposer sur une surface plane, horizontale et propre. § En général, le mode opératoire diffèrera un peu selon les fabricants. (Dans tous les cas, se référer à la notice du fabricant à l'intérieur du coffret !).
Il faut savoir que l'interprétation des TDR dépend du type (détection d'une ou plusieurs espèces) : § S'il est capable d'identifier une seule espèce, en général, il s'agira de P. falciparum, il y a un seul trait rouge possible à la zone de réaction (T) et un trait dans la zone contrôle (C), soit 2 traits au total en cas de positivité. Seul le trait (C) apparait en cas de négativité. § Si le test est capable de détecter au moins 2 espèces plasmodiales, il y a 2 traits possibles à la zone de réaction (T) et par conséquent 3 traits possibles (dont un trait dans la zone (C) en cas de positivité.
v RESULTATS POSITIFS
Figure 9. : Interprétation des résultats d'un TDR (HRP2) identifiant P. falciparum seul Source : (OMS, 2008) Les TDR ont l'avantage d'être simple d'usage, permettent de rendre les résultats dans un délai relativement court (moins de 20 minutes), permettent une meilleure standardisation des résultats et surtout, chacun peut interpréter le résultat (patient, prescripteur, technicien de laboratoire) ; ce qui renforce la crédibilité du résultat. Leur sensibilité varie selon fabricants et les études mais certains ont une sensibilité et une spécificité que l'OMS juge acceptables (> 95%). Mais ils ne sont pas quantitatifs et ont des caractéristiques liées aux types d'Ag ciblés dont on devrait tenir compte au moment du choix du type de TDR (WHO, 2009) 6.2.5. Limites des TDR. (HRP2) Les limites des TDR sont fonction du type de TDR choisi. § Les TDR (HRP2) sont en général plus sensibles que les TDR (pLDH) et les TDR (Aldolase). De plus, ils sont relativement moins coûteux (Swartout et al, 2007). Par contre, ils ne sont pas adaptés au suivi du traitement des patients en raison de la persistance de la HRP2 dans le sang jusqu'à 35 jours après le traitement (OMS, 2005) et ne peuvent détecter que P. falciparum. D'autres paramètres tels que le respect des procédures opératoires, le respect des conditions d'emballage, de transport et de conservation et les caractéristiques propres au test (sensibilité, spécificité), conditionnent les performances des TDR. En général et des TDR(HRP2) en particulier.
METHODOLOGIE |
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