C. albicans ATCC 2091
C. albicans ATCC 90028
C. albicans SC 53 14
M2
M5
M7
M8
M1 6
M20
M2 1
M24
M25
M36
M42
M45
M47
M56
M57
Candida krusei
C. krusei ATCC 6258
C. krusei 05 (054)
M1 3
M22
M30
M3 1
M32
M39
M40
M4 1
M43
M44
M49
M1 7
M1 8
M50
Candida famata
C. famata V2
M9 M1 0 M1 1 Candida tropicalis
C. tropicalis 06(085)
M28
M46
Candida lusitaniae
C. lusitaniae CECT 11458
M1
Candida guilliermondii
M1 4
Saccharomyces cerevisiae
M23
++ Rouge Slime négatif
+++ Rose Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rose Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
+ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
++ Rose Slime négatif
+ Rouge Slime négatif
+ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+ Rouge Slime négatif
+ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rose Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+ Rouge Slime négatif
+ Rouge Slime négatif
++ Rouge Slime négatif
+++ Rouge Slime négatif
33,92 33,03
10 19
15,78 10,52
16,85 10,11
17,27 29,09
66,66 57,77
1,66 15,83
56,66 17,5
16,66 52,22
16,49 46,39
17,79 57,62
14 78
46,66 66,66
48,18 82,72
55 80
62,5 85,83
50 76,66
3,26 29,34
3,50 12,28
22,22 1,11
11,81 41,81
3,27 40,98
59,37 70,62
55 56,66
37 27,55
10 34
24,54 61,81
2 48
11 52
16,66 42,5
7,20 54,05
5 4
2 30
32,20 44,91
10,71 25,89
24,60 41,26
0,8 6,62
14,51 16,93
6,36 1,81
24,19 4,83
56,36 79,09
21,66 24,16
11,25 10
21,84 24,36
47,5 84,16
(+) : souche faiblement formatrice de biofilm
; (++) : souche moyennement formatrice de biofilm; (+++) :
souch e fortement formatrice de biofilm.
Résultats
La figure 14 (a) montre que les moyennes des valeurs des
densités optiques relatives à l'activité de la
déshydrogénase mitochondriale différent entre les 43
souches de Candida testées. En effet, les valeurs des
densités optiques varient de 0.063 pour la souche C. albicans
SC 5314 à 0,375 pour la souche C. albicans (M21). Nous
avons pu remarquer que tous les isolats de C. albicans sont plus
formateurs de biofilm sur les polystyrènes que les souches de
référence SC 5314 (DO=0,063) et C. albicans ATCC 90028
(DO= 0,262). Pour les souches C. krusei, les valeurs des
densités optiques varient de 0,19 pour la souche de
référence C. krusei 05(054) à 0,33 pour la souche
de C. krusei (M43). Nos résultats ont montré que
l'espèce albicans est plus formatrice de biofilm sur le
polystyrène (DO= 0,375) que l'espèce de C. krusei
(DO=0.289). Aussi les espèces C. tropicalis
s'avèrent fortement formatrice de biofilm sur ce même
matériaux puisque pour la souche de référence C.
tropicalis 06(0,85) a une DO=0,306 et pour la souche C. tropicalis
M28 la DO est 0,243, et il en est en même pour la souche
C. famata V2 (DO= 0,243).
Pour le Cristal violet 1%, la figure 14 (b) montre que les
moyennes des valeurs des densités optiques différentes entre les
43 souches de Candida testées. En effet, les valeurs des
densités optiques varient de 0.107 pour la souche C. albicans
(M7) à 0,331 pour la souche C. albicans (M57). Pour les
souches de C. krusei, les valeurs des densités optiques varient
de 0,100 pour la souche de référence C. krusei 05(054)
à 0,234 pour la souche de C. krusei (M44).
41
Résultats
(a)
(c)
Figure 14. Distribution des valeurs de
l'absorbance de XTT (a) à 492 nm et du cristal violet à 595 nm en
fonction des différentes espèces de
Candida
isolées de la station de traitement des lixiviats de
Djebel-Chakir.
DISCUSSION
42
Discussion
Dans cette étude, 37 souches de levures ont
été isolées de la station de traitement des déchets
de Djebel Chakir, avec dominance des deux espèces C. albicans
(15/37) et C. krusei (14/37).
Six espèces de Candida spp. ont
été isolées qui sont C. albicans, C.
lusitaniae, C. famata, C. guilliermondii, C.
tropicalis, C. krusei ainsi que la souche Saccharomyces
cerevisiae.
L'étude morphologique des Candida spp. a
porté sur l'aspect et la forme des colonies sur milieu solide
sélectif. L'examen macroscopique des souches cultivées sur ce
milieu et à une température de 37°C a montré qu'il
s'agit de colonies crémeuses ayant une odeur de levures. La
capacité des espèces de Candida à se
développer à 37°C est une caractéristique importante
à considérer dans l'identification des espèces cliniques
sachant que la plupart, des espèces pathogènes se
développent aisément à 25°C et à 37°C
(McCullough et al., 1996).
L'observation microscopique des cellules de Candida
spp. a montré qu'elles sont semblables. Les blastopores peuvent
changer de l'aspect ovoïde à allongé et même
sphérique (Odds, 1988). Notre étude nous a permis de
vérifier que macroscopiquement, C. albicans apparait une
espèce caractérisée par la forme de levure (blastopores
ovoïdes) et les souches de C. krusei sont de forme
allongée ou en grain de riz.
Les activités hydrolytiques incluant la phospholipase,
la protéase et l'estérase jouent un rôle important dans la
pathogénie des champignons. La sécrétion de ces enzymes
à été discutée dans la littérature
(da Costa et al., 2009, Noumi et al., 2009).
Les enzymes hydraulitiques peuvent entrainer la destruction de la membrane
cellulaire et son aussi impliquée dans la pathogénicité
des levures de genre Candida.
La sécrétion des phospholipases extracellulaires
par les espèces de Candida a été reportée
pour la première fois par Costa et ses collaborateurs
(1968) suite à la croissance de cette levure sur milieu
solide à base de jaune d'oeuf. Nos résultats ont prouvé
que 31,11% des souches de Candida ont une activité
phospholipase négative et que 44,44% des souches C. albicans
sont phospholipase positive, contrairement à l'étude de
Farina et ses collaborateurs en 2009 qui ont montré que
99,4% des souches de C. albicans sont productrices de cette enzyme.
D'autre étude ont montré que d'autre espèces de
Candida telles que les C. tropicalis, C. famata, et C.
guilliermondii secrètent aussi de la phospholipase (Noumi
et al., 2011).
43
Discussion
En ce qui concerne l'activité protéolique,
Naglik et ses collaborateurs (2003) ont
prouvé que les Aspartyl protéases sécrétées
par les Candida jouent un rôle important dans la virulence de
cet organisme. Les rôles attribués à cette enzyme lors de
l'infection par C. albicans pourraient aller de la simple absorption
des substances nutritives jusqu'à la digestion des immunoglobulines de
l'hôte afin de résister au système immunitaire. Nous avons
aussi montré que 86,04% des souches de Candida testées
sont productrices de la protéase et que cette production est
répartie au niveau des six espèces de Candida
étudiés (C. albicans, C. lusitaniae, C. famata, C.
guilliermondii, C. tropicalis, C. krusei).
L'étude expérimentale a
révélé que 46,51% des isolats de Candida
testés ont une activité estérase négative. Les
souches de Candida qui ont une activité estérase
positive ont un pourcentage de 27,90% parmi elles: C. albicans
33,33% et C. krusei 35,71%. Mudaliar et ses
collaborateurs en 2005, la majorité des espèces
sont non productrice de l'estérase sur 149 souches de Candida
isolées de différents patients malades à
montré que 92.3% de C. albicans ne secrète pas
l'estérase, C. tropicalis (92.3%), C. parapsilosis
(25%), C. dubliniensis (16.6%), C. inconspicua (100 %),
et C. lipolytica (100%) non sécrétrices de
l'estérase.
Le pouvoir hémolytique des souches de C. albicans
à été rapporté pour la première fois
par Manns et ses collaborateurs (1994).
L'étude de Gang et ses collaborateurs
(2001) a démontré qualitativement et
quantitativement l'activité hémolytique chez différentes
espèces de Candida. Nos résultats ont montré que
la majorité des souches testées ont la possibilité de
dégrader l'hémoglobine (source de fer par production de deux
différents types d'hémolysines responsable de la lyse des
érythrocytes). En effet, les souches hémolytiques de Candida
ont montré les trois types d'hémolyse. Cependant,
l'activité beta hémolytique (hémolyse complète) a
été uniquement observée après 48 h d'incubation
précédée d'une activité alpha hémolytique
(hémolyse incomplète) durant les premières 24 h
d'incubation.
L'analyse quantitative des données a montré que
l'activité beta hémolytique de C. albicans est plus
importante que celle des autres espèces testées. Aussi cette
variation a été observée au sein d'une même
espèce. En effet, les deux types d'hémolyse (bêta et alpha)
ont été observés chez les souches de C. albicans
et C. krusei. Ces résultats ont été
prouvés en 1999 par Watanabe et ses
collaborateurs. Ces observations suggèrent que alpha et beta
hémolyse peuvent résulter de deux ou plusieurs différents
facteurs hémolytiques produits par
ce type de levures.
44
Discussion
L'adhésion des isolats de Candida à
différentes surfaces à été testée
qualitativement et quantitativement. La production de Biofilm testée par
méthode de coloration à la safranine 1% a montré que
toutes les souches de Candida testées sont
phénotypiquement formatrices de biofilm avec des degrés variables
en fonction de l'intensité du biofilm. En effet, 17,77 % de souches sont
faiblement formatrices de biofilm (noté `+') et 57,77% sont moyennement
formatrices de biofilm (noté `++') et 24,44 % sont fortement formatrices
de biofilm (noté `+++'). Cerickcioglu et ses
collaborateurs (2004) suggèrent l'utilisation de cette
technique puisqu'elle est simple et efficace pour la détermination des
propriétés adhésives de souches de Candida.
La production d'exo-polysaccharides sur milieu au rouge Congo
a montré que les souches testées donnent deux morphotypes (rouge
et rose) qui sont interprétés comme étant des souches
slime négatif. En 2010, Dag et ses
collaborateurs ont montré la présence de différents
morphotypes : rouge foncé (noté slime positif), rose à
centre noir (noté souche faiblement productrice de slime) et rose pale
et blanc (noté souche slime négatif). De plus, Gökce
et ses collaborateurs (2007) ont étudié
la production de biofilm chez 99 souches de C. albicans isolées
d'hémoculture en utilisant la méthode en tube et les
méthodes spectrophotométriques. Les résultats obtenus
montrent une corrélation positive entre les différentes
techniques testées.
Il est connu que le rouge Congo interagit avec plusieurs
polysaccharides avec une forte affinité pour la chitine et le glucane
(Roncero et Duran, 1985). Ceci étant, l'interaction
entre ces molécules et le rouge Congo limitent son utilisation pour
évaluer qualitativement la formation de biofilm par les souches de
Candida. Ainsi et compte tenu de ces remarques, nous ne recommandons
pas l'utilisation de ce test (CRA) pour le screening des souches de Candida
formatrices de biofilm sur ce milieu. Cette position est aussi prise par
Dag en 2010 et Noumi et ses collaborateurs (2011). En effet,
ces auteurs ont montré que le test sur rouge Congo a une faible
sensibilité avec un pourcentage élevé de faux positifs.
Au cours de notre travail, nous avons étudié
l'hydrophobicité des 43 souches de Candida au cyclohexane et au
xylène .Nous avons montré que les hydrocarbures testés
sont capable de s'adhérer aux différentes souches de Candida
avec différentes degrés .Pour le cyclohexane
l'adhérence optimale est pour la souche C. albicans
(M47) 85,83% et pour le xylène l'adhérence
optimale est pour la souche C. albicans M7 (66,66%) et 59,37% pour
C. krusei. En 2010, Raut et ses
collaborateurs ont étudié l'hydrophobicité de 50
souches
45
Discussion
cliniques de Candida en corrélation avec la
formation de biofilm sur le polystérene .Ils ont trouvé que
l'hydrophobicité de la surface des cellules de Candida varie de
2 à 41 %. Ils ont aussi noté qu'il n'y a pas de
corrélation entre l'hydrophobicité des cellules de cette levure
et leur adhésion au polystyrène.
Les isolats de Candida ont été
testés pour leur capacité à former un biofilm à la
surface des puits des plaques en polystyrène par mesure de la
viabilité cellulaire suite à la réduction du XTT par la
déshydrogénase mitochondriale des cellules de Candida
métaboliquement actives. Le changement colorimétrique durant
la phase de formation de biofilm reflète le nombre des cellules vivantes
et peut être quantifié par un lecteur ELISA (Kuhn et al.,
2002).
Notre étude nous a permis de remarquer que C.
albicans est l'espèce la plus productrice du biofilm suivi par
C. krusei. En effet, certaines études ont
démontré que le métabolisme du XTT par les cellules
adhérentes de Candida peut varier d'une espèce à
une autre et que ce métabolisme est plus élevé chez C.
albicans que chez les autres espèces vu qu'elle est l'espèce
la plus adhérente.
Dans la dernière partie nous avons étudié
l'activité antifongique de l'amphotéricine B contre des isolats
de Candida. Dans le même domaine, les études de
kunkel en 2011 sur 51 souches de C.
albicans qui ont été isolées des différents
services de l'hôpital à partir des cathéters et des sondes
après leur ablation a montré que les cellules de C. albicans
sont très résistantes ,cette résistance augmente au
cours phases de la formation des biofilms jusqu'à ce qu'elle atteigne
son seuil à la phase de maturation (après 48 h) par dosage
colorimétrique après coloration au cristal violet.
Il en sort de ce travail que toutes les espèces de
Candida isolées des différentes phases de traitement des
lixiviats de Djebel-Chakir sont dotées de plusieurs
propriétés virulentes: (i) sécrétion de plusieurs
enzymes hydrolytiques (phospholipases, estérase,
aspartylprotéases), (ii) dégradation des globules rouges, et
(iii) formation de biofilm. De telles levures déversées
directement dans le milieu récepteur (Oued El Attar) peuvent être
une source de danger
potentiel pour l'être humain.
CONCLUSION
GENERALE
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