II-15 Estimation de la concentration en polyphénols
des margines
Un volume de margine est extrait trois fois par trois volumes
d'acétate d'éthyle dans une ampoule à décanter. La
phase organique (phase supérieure) est récupérée
dans un ballon de masse initiale m0, puis concentrée sous vide à
l'aide d'un rota-vapeur. Ensuite, le ballon est rincé par un volume
d'hexane afin d'éliminer la matière grasse. Ce ballon,
portée au four 105°C pendant 2 h, acquière une masse m. La
concentration (C) en polyphénols est la suivante :
C (g/l) = 1000 x (m - m0)/V
Avec m0 est la masse du ballon vide ; m est exprimée en
g et V en ml
II-16 Immobilisation en Alginate de
â-glucosidase
Tout d'abord, on prépare une solution d'alginate de
sodium en ajoutant 2,3 g pour 100 mL d'eau distillée bouillante sous
agitation. L'homogénéisation s'effectue lentement et est
accompagnée d'une désaération de la solution pendant 30
min. Lorsque la température est redescendue aux alentours de 40-45
°C, on ajoute l'enzyme toujours sous agitation.
La suspension ainsi réalisée est placée
dans une seringue et une goutte à goutte est effectué dans une
solution contenant un ion bivalent à savoir le chlorure de calcium
(CaCl2) à 0,05 M maintenue sous agitation à température
ambiante, ce qui va permettre la formation des billes. A l'issue de
l'écoulement de la suspension, les billes sont laissées sous
agitation 30 min, ensuite elles sont rincées à l'eau
distillée puis mises à équilibrer dans une solution de
chlorure de calcium (CaCl2) à 0,005 M. Les billes sont alors
prêtes pour la bioconversion et conservées à 4 °C.
Différents paramètres sont alors testés pour optimiser la
bioconversion des composés phénoliques des margines, tels que
:
? l'effet du pourcentage d'alginate de sodium (de 1 à
4%)
? la taille des billes : Afin de tester l'effet de la taille
sur la bioconversion, différents types de billes ont été
coulés à l'aide d'embouts de tailles plus ou moins grandes afin
d'obtenir des billes ayant une taille de 1 à 4 mm.
71
Matériel et Méthodes
III. Caractérisation des margines brutes
La production nationale de margines qui proviennent du
système à pression (40 %) et du système continu (60 %)
s'élève à 650 000 m3/an (1995-2004). Sur 21
régions productrices de margine en Tunisie, la région de Sfax
vient en première position avec 210 mille m3/an (Msallem et
al., 2000). Les margines brutes utilisées au cours de notre étude
sont issues de deux systèmes d'extraction « chaîne continue
» nommé MCC et « super presse » nommé à son
tour MSP. Le tableaux 3 résume les différentes
caractéristiques physico-chimiques des margines utilisées.
Comme signalé dans la partie « Synthèse
bibliographique », la composition des margines est non seulement
dépendante du type d'extraction, mais également, et dans une
moindre mesure, de la variété des olives, de la période de
la campagne, des pratiques culturales et de la modalité de l'extraction
(Lesage-Meessen et al., 2001; Obied et al., 2005). Ceci a
été remarqué dans le Tableau 5, où les margines
brutes provenant de deux systèmes d'extraction différents
à savoir le Super Presse et la chaine continue, ont une variation des
caractéristiques surtout celles responsables de leur richesse en
polyphénols (polyphénols, ortho-diphénols,
hydroxytyrosol,...).
Tableau 5 : Caractéristiques
physico-chimiques des margines : MCC et MSP.
|
MCC
|
MSP
|
|
pH
|
5,1
|
5,4
|
|
Polyphénols (g/l)
|
30,3
|
33
|
|
Ortho-diphénols (mg/l)
|
7,42
|
4,34
|
|
Matière en suspension (g/l)
|
110,63
|
119,04
|
|
Sucre réducteur (g/l)
|
23
|
26,25
|
|
Glucose (g/l)
|
5,6
|
5,98
|
|
Hydroxytyrosol (g/l)
|
0,019 à 0,045
|
0,022 à 0,065
|
|
â-Glucosidase (UI/ml)
|
80
|
83
|
L'analyse du Tableau 5 montre que les margines ont un pH
légèrement acide, ils renferment une quantité de sucre
réducteur importante, qui est de l'ordre de 23 g/l pour les MCC et de
26,25 pour les MSP. Une activité â-glucosidase de 80 à 83
UI/ml dans ces rejets a été remarquable, qui peut avoir comme
origine, soit le fruit, soit les microorganismes qui cohabitent ces rejets. Il
est également remarquable que ces margines sont très riches en
composés phénoliques ayant une moyenne de concentrations
très élevées qui est de l'ordre de 30 g/l. En revanche, la
quantité totale d'ortho-diphénols est très faible ; elle
est de l'ordre de 7,42 mg/l pour margine chaine continue (MCC) et de 4,34 mg/l
pour la margine Super Presse
Matériel et Méthodes
(MSP). L'analyse chromatographique par le C18-CLHP montre que
ces margines renferment une quantité très faible en
hydroxytyrosol (0,019 à 0,065 g/l) et une quantité importante en
oleuropéine et ses dérivés (Figure 11). L'ensemble de ces
caractéristiques mettent les margines parmi les effluents industriels
les plus toxiques et les plus riches en composés phénoliques. Une
voie de valorisation de ces rejets par leur enrichissement en composés
à haute valeur ajoutée comme les antioxydants sera alors
prometteuse.
La composition phénolique des margines a
été étudiée profondemment par plusieurs chercheurs
(Bianco et al., 2003; Della Greca et al., 2004; Obied et
al., 2005; De Marco et al., 2007). Les polyphénols des
margines sont surtout représentés par les monophénols
simples et les composés polymérisés tels que les tannins,
les flavonoides, l'oleuropéine qui est le composé
sécroiroide, le déméthyloleuropéine et le
dialdéhydique formé de l'acide élénolique (EDA)
liée du 3,4-dihydroxyphényléthanol (3,4-DHPEA ou
hydroxytyrosol). Également, ce rejet contient d'autres
sécoiroides comme le verbascoide et le ligstroside. D'autres groupes de
composés phénoliques y sont présents qui sont des
dérivés d'acide cinnamique (acide p-coumarique,
férulique et caféique) et d'acide benzoïque (acide
3,4-dihydroxyphényacetique et acide 4-hydroxybenzoique). D'autre
phénols sont retrouvés dans les margines comme le
catéchol, méthylcatéchol, phénylalchols (tyrosol,
hydroxytyrosol). Et relativement une haute concentration de composés
flavonoïques qui sont représentés par les catéchines,
les quercétines, les dihydroxyglycones, et les anthocyanes
(cyaniding-3-glucoside et cyaniding-3-rutinoside). Ces dernières sont
responsables de la coloration rouge à noire des margines
(Fernández-Bolaños et al., 2006). Particulièrement, le
glucoside d'hydroxytyrosol est le composé phénolique
prédominant des margines et de la drupe d'olive (Romero, et
al., 2002). Ces composés phénoliques ont des structures
chimiques extrêmement variées. Plusieurs approches peuvent
être appliquées pour l'identification des composés
phénoliques. Parmi ces techniques on site la chromatographie liquide
à haute performance (CLHP), la chromatographie gazeuse -
spectrométrie de masse (CG-SM) et chromatographie liquide -
spectrométrie de masse (LC-SM) qui sont les plus efficaces.
72
Matériel et Méthodes
73
Figure 11: C-18 CLHP chromatogramme de l'extrait de
margine brute frais. HT : hydroxytyrosol, Ty :Tyrosol, OE :
Oleuropéine.
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Résultats et Discussion
Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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