2-3- Production des substances
antibactériennes :
Cette partie a été effectuée pour une
seule souche fongique sélectionnée en fonction des
résultats précédents (isolement, identification et test
d'antibiose).
Afin de tester la production des antibiotiques de cette
souche, qu'ils soient des antibiotiques exogènes ou endogènes, on
a utilisé le milieu de culture YESLa (Yeast Extract Starch
Liquid acidifié) et la méthode suivante :
Tout d'abord, on a désinfecté le
récipient du culture qui est de volume 4 l ; on a placé, ensuite,
les supports en verre (pipette pasteur) de manière qu'il forme un
support du mycélium, puis on a désinfecté l'ensemble (le
récipient et les supports) et enfin on a versé 2000 ml du milieu
de culture YESLa.
A ce moment, on a préparé notre inoculum en
utilisant la technique de support cellulosique de spores décrit par De
Biller Beck (2000).
On a coupé un fil de coton commercialisée en 10
morceaux de 60 cm de long, on les a placés ensuite, dans une boite en
verre et on les a stérilisés à l'autoclave pendant 20 mn.
Après la stérilisation, 30 ml de la suspension
fongique ajustée à (1×108 spore/ml) en utilisant
la cellule de Thomas a été versée dans la boite de
Pétri, ensuite l'ensemble a subit un séchage pendant deux heure
sous hotte à flux laminaire de type (Cytostar 13164).
En denier lieu, les supports de spores ont été
placés dans le récipient de manière qu'ils soient
immergés. L'incubation a été effectuée à
température ambiante.
Cette méthode était réussite après
plusieurs essais, en améliorant à chaque fois la technique par
l'analyse des résultats de chaque essai. En plus, elle était
réalisée avant l'identification de l'espèce de cette
souche par le « Muséum National d'Histoire Naturelle.
France ».
2-3-1- Activité antibactérienne du
surnageant :
Elle a été réalisée par la
méthode de disque imprégné du surnageant décrite
dans le criblage primaire, en utilisant comme bactéries cibles (les
neuf) bactéries citées précédemment et le milieu de
culture Mueller Hinton.
L'étude de l'activité antibactérienne a
été suivie pendant trois mois.
2-3-2- Activité antibactérienne du
mycélium (aérien et substrat) :
Après trois mois d'incubation, le mycélium total
a subi des extractions par les solvants organiques polaire et apolaire
(éthanol et éther de pétrole éthylique), afin de
tester l'activité antibactérienne du mycélium
aérien et celle du substrat.
· Extraction par l'éthanol :
Cette méthode a été décrite par Ravindra
et al (2004).
Ø Le mycélium aérien :
On a broyé 0.5g du mycélium aérien dans 50
ml d'éthanol par un broyeur de type (IKAR WERKE) avec une
vitesse 13500 tours / mn pendant 15 mn, la phase liquide a été
séparée du culot par filtration. Cette opération a
été répétée en additionnant 25 ml du solvant
au culot récupéré. Le filtrat a été
déshydraté ensuite, par passage sur sulfate de sodium anhydre (
Na 2 SO4 ), puis évaporé sous vide à
température 45°C et avec une vitesse rotatif 150 tour/mn
grâce à un évaporateur rotatif de type ( Laborota 4000
efficient ) . Le résidu ainsi obtenu a été conservé
à 4°C.
Ø Le mycélium du substrat : On a
broyé 15 g du mycélium dans 150 ml d'éthanol pendant 15 mn
par le même type de broyeur et la même vitesse de broyage.
après la filtration, l'opération est répétée
en additionnant 75 ml ensuite 25ml d'éthanol. Pour les autres
étapes le même protocole d'extraction du mycélium
aérien.
· Extraction par l'éther de pétrole
éthylique : Cette méthode a été
inspirée de la méthode décrite par
Ravindra et al (2004).
Ø Le mycélium aérien : On a
broyé 0.2 g du mycélium aérien dans 25 ml d'eau
distillé pendant 15 mn par le même type de broyeur et la
même vitesse de broyage, on a ensuite, ajouté 25 ml d'éther
de pétrole éthylique afin d'obtenir deux phases de
séparation ; la phase aqueuse a subi une deuxième extraction
par 20 ml d'éther de pétrole éthylique et la phase
étherique a été récupérée. Les phases
étheriques récupérées ont été
déshydratées par passage sur Na 2 SO4,
ensuite évaporées par le même type d'évaporateur et
la même température. Le résidu obtenu est conservé
ensuite à 4°C.
Ø Le mycélium du
substrat : On a broyé 20g du mycélium dans 200
ml d'eau distillé pendant 15 mn par le même type de broyeur et
avec la même vitesse, ensuite on a ajouté 200 ml d'éther de
pétrole éthylique afin d'obtenir deux phase. La phase
étherique était récupérée et la phase
aqueuse a subi des extractions successifs par l'éther de pétrole
éthylique (100 ml, 50 ml et 30 ml). On a ensuite suivie le
même démarche d'extraction décrite auparavant.
· Le test d'antibiose : On a
solubilisé tout d'abord les résidus par 5 ml du même
solvant d'extraction ensuite, on a réalisé ce test en utilisant
les neufs bactéries-cible et la méthode de disque
imprégné. Le control négative (l'éther de
pétrole éthylique et l'éthanol).
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