2-2- Test d'antibiose :
2-2-1- Microorganisme cible :
Dans notre travail, on a utilisé comme microorganisme
cible neuf souches bactériennes dont trois provient du
laboratoire « Antibiotiques, Antifongique :
Physico-chimie, Synthèse et Activité biologique »
(Tlemcen).
· Escherichia coli (1')
(ATCC 25922)
· Pseudomonas aeruginosa (2) (ATCC
27853)
· Staphylococcus aureus (3) (ATCC
25923)
Cependant, que les autres souches provient du laboratoire
« Produits Naturels »
(Tlemcen).
* Les souches :
· Escherichia coli (1) 5044172.
· Citrobacter freundï
· Enterobacter cloacea (5) 1305573.
· Klebsiella pneumoneae
(6) 5215773.
· Listeria monocytogenes (7) (ATCC 19111).
· Proteus mirabilis (8) 0536040.
· Salmonella typhi (9) 4404540.
2-2-2- Préparation de l'inoculum
bactérien :
La préparation d'un lot de « Semences
d'essai » des souches bactériennes a été
réalisée sur Gélose nutritive en tubes inclinés et
conservés à 4°C. Vingt quatre heures avant le test
d'antibiose, on a effectué des précultures en Bouillon nutritif
à partir des souches bactériennes conservées. Ces
précultures ont été incubées à 37°C.
Lors des essais, ces précultures sert à la
préparation des suspensions bactériennes dans l'eau physiologie
et ajustées, ensuite, à l'aide d'un Spectrophotomètre de
type (JEN WAY, 6405 UV/Vis), à 1×108 bactéries
/ml par mesure de la transmission optique à 640 nm (DE BILLERBECK,
2000).
2-2-3- La réalisation du test :
Le test d'antibiose dépend des résultats
d'isolement et d'identification des champignons, qu'ils nous ont posés
de faire deux méthodes selon les souches isolées :
· METHODE 1 : Utilisée pour
le premier groupe de champignons.
Ø Le criblage primaire :
Elle était réalisée par la méthode de culture en
milieu liquide inspiré de la méthode décrit par Khelil
(1997) et Saadoun et al (1999) et, qui consiste
à inoculer des souches fongiques pures dans un flacon de 250 ml
contenant 50 ml du milieu Yeast Glucose Succhrose (YGS) et l'incuber, ensuite,
à 25°C. Après 14 jours d'incubation le contenue de chaque
flacon, a subi une filtration sur un papier filtre. Le surnagent était
récupéré. Afin d'effectuer le test d'antibiose sur une de
ces trois bactéries cible Escherichia coli (1),
Pseudomonas aeruginosa (2) et Staphylococcus aureus
(3), trois disques de papier ont été
imprégnés du surnageant et posés en surface du milieu de
culture « Gélose nutritif » coulé en boite de
Pétri et ensemencé par la suspension bactérienne.
Après 24 heure d'incubation la présence d'une zone clair autour
des disques révèle la présence des substances
antibactériennes dans le surnageant.
Ø Le criblage
secondaire : Les souches révélant une
activité antibactérienne importante dans le premier criblage, ont
subi ce criblage afin de tester leur activité en changeant la
méthode et en élargissant la gamme des
bactéries-cible (neuf espèces bactériennes). Ce test
inspiré de la méthode décrit par Saadoun et al
(1999), consiste à ensemencer des souches fongiques sur le milieu
PDAa coulé en boite de Pétri. Après 14 jours
d'incubation à 25°C, trois disques d'agar ont été
coupés et déposés sur le milieu Mueller Hinton
ensemencé préalablement par la suspension bactérienne.
Après 24 heures d'incubation à 37°C, la présence
d'une zone clair autour des disques révèle la présence des
substances antibactériennes dans le disque d'agar.
· METHODE 2 :
Utilisé pour le deuxième groupe
fongique. Cette méthode a été réalisée sous
sa forme décrite ci-dessous, après qu'on a remarqué que la
formation des hyphes aériens agrégés par ce groupe
fongique a arrêtée la croissance de certains contaminants
fongiques de la culture des souches de ce groupe.
La méthode consiste à inoculer les champignons
dans un récipient contenant 100 ml du milieu YSA. Après 20 jours
d'incubation à 25°C, les filaments aérien ont
été récolté et homogénéisé
dans 50 ml d'eau distillé stérile. Trois disques de papier filtre
ont été imprégnés de cette suspension et
déposé, ensuite, sur le milieu Mueller Hinton ensemencé
préalablement par une suspension bactérienne
(Pseudomonas aeruginosa (2) ).
Après incubation à 37°C pendant 24 heures la lecture
était effectuée comme la première méthode.
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