III- Traitement des moustiques.
1. Traitement sur le terrain
1.1. Identification des moustiques
Sur le terrain les moustiques à tester sont
identifiés sous la loupe binoculaire, à partir de la clé
de détermination de DIAGNE et al, (1994).
1.2. Conservation des moustiques
A l'issue du test, chaque moustique mort est individuellement
conservé dans un tube eppendorf de 1,5 ml, numéroté et
contenant du silicagel (dessiccateur). Les moustiques vivants à l'issue
des 24 heures d'observation ont été assommés et
individuellement conservés dans de l'alcool 70%, dans des tubes
eppendorf de 1,5 ml numérotés.
2. Traitement au laboratoire
La détermination des espèces du complexe
Anopheles gambiae, la fréquence des formes moléculaires
M et S et la recherche du gène Knock down résistance (kdr) chez
An. gambiae s.s ont été effectuées. Par ailleurs,
la recherche d'infection chez les spécimens d'An. gambiae s.l.
testés a été effectuée par ELISA-CSP.
2.1. Principe de la technique ELISA.
La recherche d'infection a été effectuée
par la technique ELISA selon le protocole décrit par BURKOT
et al., (1984) et modifié par WIRTZ et
al., (1987). Cette technique consiste a bloquer l'antigéne
circumsporozoïtique (CSP) entre un anticorps monoclonal de capture antiCSP
et un autre anticorps monoclonal anti-CSP conjugué à la
peroxydase. L'identification est faite en deux phases. La première est
un screen qui permet d'identifier les moustiques infestés sans tenir
compte de l'espèce plasmodiale. La seconde dite monospécifique,
permet de confirmer l'infestation et d'identifier l'espèce plasmodiale
en cause. En raison de la présence probable de P. vivax en
Mauritanie, la recherche de la CSP a été faite pour P.
falciparum, P. malariae, P. vivax et P. ovale. Trois
étapes sont nécessaires pour la mise en évidence de cette
protéine :
- cottage des plaques avec le broyat à tester
- faire agir les monoclonaux
- révélation de la réaction par addition
d'un substrat péroxydase.
2.2. Principe de l'identification des espèces du
complexe Anopheles gambiae par PCR
La détermination spécifique des membres du
complexe An. gambiae a été effectuée par PCR
(réaction de polymérisation en chaîne) selon le protocole
décrit par SCOTT et al., (1993). Cette
technique consiste à copier jusqu'à un milliard de fois le
fragment de génome que l'on désire étudier en utilisant le
principe de la duplication observé in vivo dans la cellule :
la
duplication de l'ADN dans le cellule a lieu juste avant la
mitose sous l'action d'une enzyme ; l'ADN polymérase. Après
séparation des deux brins complémentaires (dénaturation),
les fragments d'ARN ou amorces s'apparient à leur séquence
complémentaire au niveau de chaque brin d'ADN. L'ADN polymérase
ajoute des nucléotides à chaque amorce, aboutissant à la
formation d'une copie complémentaire de chaque brin d'ADN. On obtient
ainsi deux nouvelles molécules d'ADN identique à la
molécule initiale : on parle de polymérisation.
La PCR utilisée repose sur le même principe,
à la différence qu'elle utilise deux amorces sous formes de brin
simple d'ADN. Cette technique comprend trois étapes principales :
- la dénaturation de l'ADN qui se fait à des
températures variant entre 90 et 97°C pendant 15 à 30
secondes.
- l'hybridation des amorces qui a lieu entre 50 et 70°C,
- l'extension des amorces sous l'action des ADN
polymérases. Au cours de cette phase, la température est
portée à 72°C. Cette température favorise l'ouverture
de la double hélice d'ADN. l'ADN polymérase thermostable : la taq
polymérase ajoute des nucléotides. Cette enzyme est tirée
d'une bactérie Archéobactérie, Thermus aquaticus vivant
dans les sources thermales entre 80 et 90°C (KAPLAN & DELPECH,
1993).
2.3. Identification des formes moléculaires et
recherche du gène Knock Down (Kdr) au sein d'Anopheles gambiae
s.s.
Dans le cadre d'une collaboration entre le PNLP de la
Mauritanie et le Malaria Research and Training Cennter (MRTC, Bamako, Mali),
les échantillons d'An. gambiae s.l ont été
analysés à Bamako. Les résultats des analyses pour la
forme moléculaire et la recherche du gène Kdr nous ont
été envoyés.
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