1.4) Production à grande échelle et obtention
de la protéine d'intérêt
Une fois les meilleures conditions
déterminées pour chaque protéine
d'intérêt, la troisième phase du programme 3PM consiste
dans un premier temps à valider ces conditions dans le cadre d'une
production à grande échelle, et ainsi produire
les quantités de protéine désirées (Figure
4.2).
culture
grande échelle
lyse
E. coli
6xHis
Fusion
TEV
Protéine
E. coli
Ni2+ X
purification
6xHis Trx NusA Gb1
GST MBP ZZ
lavage
élution
E. coli
E. coli
6xHis
Fusion
TEV
Protéine
Ni2+
coupure par
la TEV
partenaire et
TEV retenus
protéine d'intérêt
Figure 4.2 : Stratégie de
production à grande échelle et d'obtention de la protéine
d'intérêt
Toutes les protéines de fusion sont marquées en
N-terminal par une étiquette 6xHis, ce
qui permet potentiellement de les purifier par
chromatographie de pseudo affinité IMAC (Immobilized Metal
Ion Affinity) sur colonne à nickel. Le principe de
ce type de chromatographie repose sur les interactions ioniques qui se
forment entre les ions nickel et plusieurs noyaux imidazoles de
résidus histidines. L'élution de la protéine
hétérologue est
réalisée par un mécanisme
compétitif en ajoutant des quantités croissantes
d'imidazole.
Cependant, il existe des résines qui
présentent une affinité plus spécifique pour
certains partenaires de fusion. C'est le cas de la résine de glutathion
pour GST, de la résine d'amylose pour MBP, et de la
résine d'anticorps IgG pour ZZ. Ces résines sont
utilisées préférentiellement pour purifier les
protéines hétérologues fusionnées avec l'un de
ces partenaires. Dans le cas de la résine d'amylose, qui a
été choisie pour purifier plusieurs domaines PRODH,
l'élution est également menée par compétition en
introduisant du maltose,
qui est le ligand naturel de la MBP (Maltose Binding
Protein).
Si l'incorporation d'un partenaire de fusion peut
améliorer la solubilité de la protéine associée,
celui-ci représente cependant une gêne, notamment dans le cas
d'études structurales. C'est pourquoi, le système
génétique utilisé permet la production de protéines
recombinantes,
qui possèdent une séquence de
reconnaissance de la protéase TEV (Tobacco Etch Virus),
insérée entre la protéine d'intérêt et
le partenaire de fusion. L'action de la TEV conduit à
l'élimination de tous les acides aminés relatifs au
partenaire de fusion et au site de reconnaissance de la protéase,
à l'exception d'une glycine qui devient alors le premier
résidu
N-terminal de la protéine cible. Cette étape peut
intervenir en solution, après purification de la protéine
hétérologue, ou bien « sur colonne »,
c'est-à-dire lorsque la protéine est accrochée à
la résine de la colonne d'affinité.
Après clivage du partenaire de fusion, la protéine
d'intérêt est finalement isolée après
un nouveau passage sur résine de nickel. Cette
deuxième étape de purification permet de retenir toutes les
protéines qui possèdent une étiquette 6xHis comme
notamment la protéine
de fusion résiduelle, le partenaire de fusion
clivé, et également la protéase TEV qui comporte une
étiquette 6xHis à son extrémité N-terminale. La
protéine d'intérêt ne possédant plus de
séquence 6xHis après coupure enzymatique, elle ne doit
donc pas accrocher la résine de nickel, et peut ainsi être
séparée de son partenaire.
Le succès du criblage des conditions en
microplaques, certes prédispose, mais ne garantit en aucun cas
la réussite de la production en grand volume. En effet, il va
falloir vérifier si le changement d'échelle induit une
modification des profils d'expression et de solubilité des
protéines hétérologues. D'autre part, une fois le
partenaire de fusion clivé par
coupure enzymatique, le comportement en terme de
solubilité de la protéine d'intérêt n'est
pas prévisible car c'est un phénomène qui
dépend de sa nature intrinsèque. Par conséquent,
cette opération constitue véritablement
l'étape critique de la stratégie.
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