Mise en évidence et caractérisation
d'échangeurs Cl-/HCO3- sur les vésicules des membranes plasmiques
luminales et basolatérales
Résumé
La branche ascendante large de Henle réabsorbe une
proportion significative (environ 20%) de bicarbonate filtré par le
glomérule. Les mécanismes impliqués dans cette
réabsorption dans la partie médullaire de ce segment tubulaire
sont seulement partiellement connus: c'est un échangeur
Na+/H+ de type NHE3 qui est responsable de la
sécrétion luminale de protons. En revanche, la voie d'efflux
basolatérale de HCO3- reste indéterminée. Les
expériences en cours dans l'équipe de R-A Podevin ont
déjà permis de démonter l'existence d'échangeurs
anioniques de type Cl-/HCO3-, présents sur les
deux types de membrane plasmique, luminale et basolatérale, des cellules
épithèliales de la branche large ascendante du rat. L'approche
expérimentale repose sur la préparation simultanée de
vésicules de membranes plasmiques hautement purifiées,
orientées dans le sens physiologique.
Les avantages et les limites de la méthode
Le principal avantage de cette méthode est de permettre
l'étude séparée des membranes luminales et
basolatérales de l'épithélium de la branche large
ascendante médullaire, dans des conditions qui permettent,
contrairement aux modèles utilisant des systèmes intacts
(suspensions et
cultures cellulaires, tubules) de contrôler les
caractéristiques du milieu intravésiculaire et
extravésiculaire. Ainsi, il est possible d'inactiver certains
systèmes de transport qui pourraient interférer avec
l'activité du transporteur étudié. On peut utiliser, par
exemple, des milieux sans NaCl, pour inactiver les échangeurs
Na+/H+. Les transporteurs peuvent être
localisés fonctionnellement par l'étude des transports (technique
de filtration rapide) mais également par des techniques
d'immunoempreinte qui permettent d'identifier les différentes isoformes
des protéines de transport sur chaque membrane.
Dans le cas pré sent, des isoformes distinctes
d'échangeurs anioniques ( AE ) ont été identifiées
sur les membranes basolatérales et luminales : la membrane
basolatérale contient un polypeptide de 165 kDa de type AE2 ainsi que
plusieurs polypeptides de poids moléculaire proches de 100 kDa de type
AE1, tandis que la membrane luminale contient uniquement un polypeptide de type
AE1, dont la migration sur le gel diffère légèrement des
échangeurs anioniques de type AE1 basolatéraux, suggérant
la possibilité d'une isoforme spécifique.
Les expériences actuelles visent à
différencier les isoformes présentes aux deux pôles de la
cellule à l'aide des caractéristiques fonctionnelles : ainsi, il
a pu être démontré une sensibilité différente
au DIDS, un inhibiteur des échangeurs anioniques, puisque la valeur
d'IC509 est d'environ 3 uM pour les vésicules membranaires
basolatérales et 15 uM pour les vésicules membranaires luminales.
L'expérience suivie au cours du stage visait à déterminer
une sensibilité différente des échangeurs au pH intra
vésiculaire.
9 Concentration donnant 50% d'inhibition
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