Méthode
Animaux :
Dix rats mâles Sprague-Dawley à
jeun depuis 12 heures, de 250 à 300 g, sont sacrifiés
après anesthésie par injection intra-peritonéale de 50
mg/kg de pentobarbital de sodium, pour la préparation des
suspensions de tubules de la branche ascendante large médullaire comme
cela est déjà décrit (ref. 8 ). En résumé,
les reins prélevés à 4°C sont
décapsulés, et tranchés dans le plan sagittal. Les
tranches sont transférées rapidement dans une solution de
Hancks10 glacée, puis la bande interne de la
médullaire externe (caractérisée par sa coloration rouge)
est disséquée sous microscope binoculaire. Les fragments obtenus
sont soumis à un traitement à la collagénase (40 mg/100
ml), afin de digérer les segments tubulaires les moins résistants
à la collagénase (partie descendante de l'anse de Henle, tubule
collecteur) , pour ne
laisser intact que les segments de la branche large ascendante
médullaire qui seront récupérés par centrifugation
à basse vitesse. Cette suspension tubulaire, est rincée deux fois
dans une solution tampon de saccharose 250 mM, pH 7.4 contenant un inhibiteur
des protéases (ABSF). Les tubules ainsi traités sont alors
homogénéisés à l'aide d'un Dounce puis d'un Waring
Blendor à la vitesse maximale pendant une minute afin de rompre les
cellules. L'homogénat obtenu est constitué d'un mélange de
membranes et différents organites. L'ajout de CaCl2 au mélange
(concentration finale de 10 mM) permet de complexer l'ensemble des membranes
sauf les membranes luminales. Après 20 minutes d'incubation à
froid avec le CaCl2, les membranes luminales sont isolées par
centrifugation (6000 g pendant 15 minutes) des autres membranes,
intracellulaires et basolatérales, qui vont sédimenter ( P1 ). Le
surnageant ( S1 ) contenant les membranes luminales est centrifugé
à 48000 g pendant 8 minutes et le surnageant obtenu ( S2' ) est
centrifugé à 400 000 g pendant 60 minutes. Le dépôt
obtenu est composé à plus de 95% de membranes apicales.
Les membranes basolatérales sont isolées
à partir du P1 par centrifugation (3300 g pendant 15 minutes) dans une
solution d'EGTA (qui permet d'éliminer le surplus de Ca2+).
Cette centrifugation permet de sédimenter les membranes
intracellulaires, tandis que le surnageant (S2 ) est centrifugé à
48 000 g pendant 25 minutes pour obtenir un culot enrichi en membranes
basolatérales. Ce culot (P3) est homogénéisé,
repris dans 6 ml de la solution tampon de saccharose, puis déposé
sur un gradient discontinu de saccharose ( on utilise les solutions de 44, 52
et 65% ). Une ultracentrifugation (250 000 g pendant 50 minutes) permet de
séparer sur le gradients plusieurs bandes : la deuxième bande,
composée de membranes basolatérales à plus de 95%, est
reprise à la pipette pasteur, et soumise à une
ultracentrifugation finale permettant de sédimenter la
préparation des membranes basolatérales qui est reprise dans un
faible volume de milieu expérimental. La composition du milieu de
reprise détermine donc le milieu intravésiculaire pour les
études du transport transmembranaire.
Les mesures des transports ioniques
10 Solution physiologique tampon dont la composition est: ( en mM
) 112 NaCl; 5,4 KCl; 25 NaHCO3; 0,3 Na2HPO4; 0,4 K2HPO4; 0,4 MgSO4; 1,2 CaCl2;
5 D-glucose; 5 alanine; 10 Tris/Hepes pH 7,4; 1 % albumine; et bullée
avec 95% O2-5%
CO2
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