La filtration rapide
En créant un gradient sortant de HCO3- dans
un milieu ne contenant pas de Na+ ( pour inhiber la
Na+/K+-ATPase et les échangeurs
Na+/K+ ) on favorise l'entrée de
36Cl-,par l'échangeur Cl-/
HCO3-, à l'intérieur des vésicules. Et c'est le
36Cl- capturé dans les vésicules à
différents temps et dans les différentes conditions qui permet de
caractériser les transports ioniques sur la membrane luminale et
basolatérale. L'échangeur Cl-/HCO3- peut
être étudié également sous le mode d'échange
36Cl-/Cl-.
Procédure:
Le principe de la mesure est le suivant: à T0 10uL de
vésicules ( luminales ou basolatérales ) sont injectés
dans le milieu expérimental contenant du 36Cl- qui
va être transporté par l'échangeur
Cl-/HCO3- et s'accumuler dans les vésicules. Le
transport est arrêté 9 secondes plus tard par l'ajout de 1.5 ml de
solution STOP11 glacé. Ce mélange est rapidement
filtré sur un filtre en cellulose ( 0.45 um - donc retenant les
vésicules ) puis rincé avec encore 15 ml de solution STOP
glacé. Les filtres, sur lesquels sont retenues les vésicules
contenant le 36Clcapturé, sont dissous dans 3 ml de scintillant et la
radioactivité est mesurée à l'aide d'un compteur de
particules â. Cette radioactivité reflète l'activité
du transporteur du Cl- dans les vésicules.
|
Résultats
|
Figure 11. Protocole permettant de
préparer simultanément les vésicules de membranes
luminales et basolatérales séparées, hautement
purifiées et orientées dans le sens physiologique.
|
Les premières expériences effectuées
avaient pour but de démontrer l'existence de échangeurs
Cl-/HCO3- sur la membrane basolatérale et luminale
et leur sensibilité au DIDS ( un inhibiteur puissant des
échangeurs Cl-/HCO3- ). Il a été
conclu à une sensibilité différente au DIDS pour les deux
membranes (les valeurs d'IC50 étant de 3.2 #177; 0.94 uM pour les
vésicules membranaires basolatérales et de 15.2 #177; 5.15 uM
pour les vésicules membranaires luminales ).
La deuxième expérience visait à
déterminer la dépendance de l'activité des
échangeurs au différents pH intravésiculaires ( pHi ).
Pour les deux membranes le transport a été étudié
à pHi allant de 6,1 à 8, tandis que le pH extravésiculaire
était constant à 5,5. Chaque me sure a été faite
en
11 Solution STOP - 20 mM de Tris/Hepes pH 7.4 et une
quantité du K-gluconate nécessaire pour maintenir
l'osmolalité constante
présence et en absence du DIDS. La différence
des transferts ioniques mesurés dans ces deux conditions permet
d'estimer le transport ionique médié par l'échangeur
Cl-/HCO3- seul ( transport inhibé par le DIDS
).
Figure 11: BLMV - Transport transmembranaire du
chlore* à travers la membrane basolatérale et
LMV - Transport transmembranaire du chlore* à
travers la membrane luminale mesuré dans les vésicules
membranaires
O - transport en conditions "normales"
- transport en présence du dids
Ä - transport dû aux transporteurs non inhibés
par dids, il s'agit vraisemblablement du échangeur Cl-/HCO3 -
Les résultats obtenus montrent que le transporteur
Cl-/HCO3- basolatéral est stimulé par des
petites variations du pH intravésiculaire tandis que le transporteur
Cl-/HCO3- luminal reste insensible aux variations du
pHi12.
| 
