Memoire Online - Etude de l'effet de l'éthylène sur la croissance de champignons filamenteux et la production de leurs mycotoxines associées

Université Toulouse III Paul Sabatier - Master Diagnostic Microbiologique : approches
innovantes - Année 2019-2020

Réalisé sous la direction de Selma Snini et de Florence Mathieu du Laboratoire
de Génie Chimique et de Christian Chervin du Laboratoire Génomique et
Biotechnologie des Fruits

Laboratoire de Génie Chimique (LGC - Département Bioprocédés et Systèmes Microbiens) et
le Laboratoire de Génomique et Biotechnologie des Fruits (GBF)

Je souhaite tout d'abord remercier très chaleureusement mes référents de stage : Selma Snini, Christian Chervin ainsi que Florence Mathieu. Tout au long de cette expérience, vous avez su me faire évoluer grâce à vos excellents conseils et à la confiance que vous avez placée en moi. Merci pour la qualité de votre encadrement et pour votre disponibilité au cours de ce stage.

Je tiens à remercier Philippe Anson pour sa gentillesse, ses remarques pertinentes, son optimisme à toute épreuve et sa disponibilité. Un grand merci pour l'aide apportée au cours de mes manipulations. Ainsi que Pierre Maury pour nous avoir gentiment apporté son aide pour le dosage du CO2.

Je souhaite également remercier Brad Binder de l'université de Knoxville, Tennessee, pour l'expertise et les précieux conseils qu'il a pu m'apporter pour les analyses bio-informatiques.

Je remercie pareillement Vanessa Maakaroun, Rola Al-Hariss, Angèle Matrat, Hiba Kawtharani, Valentin Capuran, Vincent Danjou et Antoine Raynal, pour tous les moments passés ensemble et le soutien mutuel que nous nous sommes apportés mais surtout pour les parties de cartes qui ont rythmé nos pauses déjeuners.

Je souhaite aussi saluer toute l'équipe BioSyM pour m'avoir si gentiment accueilli et rapidement considéré comme un des leurs.

Un grand merci à Marie-Line Daveran-Mingot et Pascal Lebourgeois pour le savoir, l'aide, la confiance et la bonne humeur qu'ils ont su apporter à l'ensemble de la promotion de Master 2 DIAG 2019-2020.

Pour finir, je tiens vivement à remercier tous les membres de ma famille pour leur patience, leur soutien et leur réconfort tout au long de mes années d'études. Mais également mes colocataires qui ont su m'apporter des solutions lors de moments incertains.

Résumé

Les matières premières issues des cultures agricoles (céréales, fruits, etc.) sont fréquemment contaminées par des champignons filamenteux produisant des mycotoxines. Parmi ces mycotoxines, on retrouve l'aflatoxine B1 et la patuline, produite respectivement par des champignons du genre Aspergillus et Penicillium. Du fait de la toxicité avérée des mycotoxines, elles constituent un réel danger relatif à la sécurité alimentaire. Jusqu'à récemment, l'utilisation de produits phytosanitaires était privilégiée pour lutter contre la contamination par les mycotoxines. Cependant, la toxicité et les effets néfastes de ces produits encouragent le développement de méthodes de lutte alternatives basées sur l'utilisation de composés naturels, tel qu'une phytohormone comme l'éthylène, pour réduire la contamination par les mycotoxines. Certaines études, menées exclusivement sur la production d'aflatoxines par des champignons filamenteux du genre Aspergillus, ont démontré la capacité de l'éthylène à diminuer la production de mycotoxines dans cette famille. Bien que la façon dont les champignons perçoivent l'éthylène est encore inconnue et dans le cas d'un effet de l'éthylène sur la production de mycotoxines, l'effet du 1-méthylcyclopropène (1-MCP), gaz inhibiteur des récepteurs végétaux de l'éthylène, a été testé. Les résultats obtenus ont montré qu'un traitement à l'éthylène n'avait aucune influence sur la croissance des champignons étudiés bien qu'une augmentation générale des mycotoxines a été observé lorsque l'éthylène est appliqué sans éliminer le CO2 naturellement produit par les espèces fongiques. Cependant, lors d'un traitement à l'éthylène avec de la chaux sodée (piège à CO2), les champignons ont réagi à l'éthylène, laissant présager la présence de récepteur à l'éthylène, non-caractérisé à ce jour. De plus, ces mêmes résultats semblent prometteurs quant à l'utilisation de l'éthylène comme agent de biocontrôle puisqu'une importante diminution de la production de mycotoxines a été observée.

Abstract

Raw materials from agricultural crops (cereals, fruits, etc.) are frequently contaminated with filamentous fungi that produce mycotoxins. Among these mycotoxins are aflatoxin B1 and patulin, produced by fungi of the genus Aspergillus and Penicillium, respectively. Due to the proven toxicity of mycotoxins, they constitute a real danger relating to food safety. Until recently, the use of phytosanitary products was privileged to fight against contamination by mycotoxins. However, the toxicity and harmful effects of these products encourage the development of alternative control methods based on the use of natural compounds, such as a phytohormone like ethylene, to reduce contamination by mycotoxins. Some studies, conducted exclusively on the production of aflatoxins by filamentous fungi of the genus Aspergillus, have demonstrated the capacity of ethylene to decrease the production of mycotoxins in this family. Although the way in which fungi perceive ethylene is still unknown and in the case of an effect of ethylene on the production of mycotoxins, the effect of 1-methylcyclopropene (1-MCP), a gas that inhibits plant receptors ethylene, has been tested. The results obtained showed that an ethylene treatment had no influence on the growth of the fungi studied although a general increase in mycotoxins was observed when ethylene is applied without removing the CO2 naturally produced by the fungal species. However, when treated with ethylene with soda lime (CO2 trap), the fungi reacted with ethylene, suggesting the presence of an ethylene receptor, not characterized to date. Moreover, these same results seem promising for the use of ethylene as a biocontrol agent since a significant decrease in the production of mycotoxins has been observed.

I.		*Introduction*	1
	1.	*Les champignons filamenteux*	1
	2.	*Les genres Aspergillus et Penicillium*	2
		*2.1. Aspergillus spp*	2
		*2.2. Penicillium spp*	3
	3.	*Les mycotoxines, aflatoxines et patuline*	4
		*3.1. Les mycotoxines, diversité et dangerosité*	4
		*3.2. Les aflatoxines*	6
		*3.3. La patuline*	7
	4.	*Problèmes sanitaires engendrés et réglementation subséquente*	8
		*4.1. Problèmes sanitaires*	8
		*4.2. Réglementation*	9
	5.	*L'éthylène et les fruits climactériques*	9
		*5.1. L'éthylène, phytohormone du stress*	9
		*5.2. Les récepteurs à l'éthylène connus*	10
	6.	*L'éthylène chez les champignons filamenteux*	11
		*6.1. Effet de l'éthylène sur différentes espèces fongiques*	11
		*6.2. Potentiel rôle des GPCR dans la réponse à l'éthylène*	11
		*6.3. Perspective d'utilisation de l'éthylène comme agent de biocontrôle*	12
*II.*		*Matériels & Méthodes*	13
	1.	*Analyses bio-informatiques*	13
	2.	*Souches, origines des gaz et milieux de culture utilisés*	13
		*2.1. Souches fongiques et origines des gaz*	13
		*2.2. Milieux de culture*	13
	3.	*Préparation des solutions de spores*	14
		*3.1. Revivification des souches fongiques*	14
		*3.2. Préparation de la solution de Tween 80 à 0,05%*	14
		*3.3. Récupération des spores*	14
		*3.4. Numération à la cellule de Thoma*	14
	3.	*Préparation des gaz*	15
	4.	*Ensemencement et conditions de culture*	15
		*4.1. Ensemencement des boîtes de Pétri*	15
		*4.2. Injection des gaz*	16
	5.	*Détermination de la croissance fongique*	16
	6.	*Extraction des mycotoxines*	16
		*6.1. Extraction des aflatoxines*	16
		*6.2. Extraction de la patuline*	16
	7.	*Dosage des mycotoxines par HPLC*	16
		*7.1. Préparation des gammes étalon*	16
		*7.2. Analyse HPLC des aflatoxines*	17

Figure 6 - Réplicats techniques d'une même concentration d'éthylène injectée en GC

Figure 7 - Mesure de la croissance radiale d'A. flavus avec et sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 8 - Dosage de l'AFB1, AFB2 et du CO2 chez A. flavus sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 9 - Dosage de l'AFB1, AFB2 et du CO2 chez A. flavus avec et sans chaux sodée après 72h

Figure 10 - Mesure de la croissance radiale de P. expansum après 72h d'incubation

Figure 11 - Dosage de la patuline chez P. expansum sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 12 - Mesure de la croissance radiale d'A. parasiticus sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 13 - Dosage de l'AFB1 et AFB2 chez A. parasiticus sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 14 - Dosage de l'AFG1 et AFG2 chez A. parasiticus sans chaux sodée après 72h d'incubation

Tableau 1 - Exemples de mycotoxines, d'espèces productrices, de sources et d'effets les plus fréquents

Tableau 4 - Concentrations en mycotoxines des différentes gammes étalon utilisées

Tableau 5 - Exemple de dosage de la concentration en éthylène dans les bocaux

Grâce à leur évolution depuis des millénaires, les micro-organismes appartenant au royaume des champignons constituent un clade très diversifié d'eucaryotes représentant un des plus grands groupes de la biodiversité mondiale actuelle. Ils sont retrouvés dans pratiquement tous les environnements, mais surtout dans les écosystèmes terrestres (Richards et al., 2017 ; Stajich, 2017). Ils participent activement à la transformation de l'environnement en tant que décomposeurs de la matière organique, mais également en se liant à d'autres organismes (plantes, procaryotes, animaux...) permettant la mise en place de relations symbiotiques (Galagan et al., 2005).

Par leur capacité à produire des structures macroscopiques, l'étude des champignons se faisait traditionnellement par des techniques microbiologiques. En effet, elles étaient basées sur la culture fongique ainsi que la caractérisation de structures spécialisées et de leurs effets sur leurs hôtes ou partenaires symbiotiques. Cependant, au cours des dernières décennies, l'avènement des techniques de génomique a permis une évolution considérable en termes de connaissance et de compréhension dans le domaine de la mycologie et de la toxicologie. Ces avancées ont alors mis en lumière un grand nombre de souches fongiques productrices d'un large panel de métabolites secondaires. Parmi ces derniers, certains présentent des propriétés toxiques et sont appelés mycotoxines. Ces dernières représentent aujourd'hui un des problèmes majeurs en matière de sécurité sanitaire des aliments et de préjudices économiques pour les producteurs de denrées contaminées. Pour pallier cela, depuis plusieurs années, le recours à des produits phytosanitaires pour réduire la contamination fongique était encouragé. Cependant, la toxicité de ces produits pour l'Homme, l'animal et l'environnement, conduit progressivement les chercheurs à développer d'autres moyens de lutte tels que l'utilisation d'agents de biocontrôle ou de composés naturels pour réduire la contamination fongique et la production de mycotoxines.

L'objectif de ce stage était d'étudier les potentiels effets de l'éthylène, phytohormone de stress, et de son inhibiteur compétitif, le 1-MéthylCycloPropène (1-MCP), sur la croissance de trois champignons filamenteux, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus et Penicillium expansum et de la production de leurs mycotoxines associées, les aflatoxines et la patuline.

1. Les champignons filamenteux

Les champignons filamenteux, appelés également moisissures, forment un règne à part entière : le règne fongique ou des Fungi (du latin fungus, le champignon). Le terme courant de « moisissure » fait généralement référence à leur texture laineuse/cotonneuse pouvant être observée mais n'a pas de sens phylogénétique étant donné que différentes espèces appartenant à différents phylums (ascomycètes et zygomycètes) sont regroupées sous cette même appellation. Les champignons filamenteux sont des micro-organismes eucaryotes pluricellulaires, ubiquistes et généralement saprophytes ou parasites. Ils sont incapables d'assurer la photosynthèse et se nourrissent par dégradation de molécules organiques présentent dans l'environnement, les qualifiant ainsi d'organismes hétérotrophes. La colonie fongique est constituée d'un appareil végétatif composé de

filaments appelés hyphes et l'ensemble des hyphes forment le mycélium. Des structures spécialisées au sein du mycélium, appelées « conidiophores », sont responsables de la production de nombreuses spores qui confèrent aux champignons filamenteux un pouvoir de dissémination considérable.

Les moisissures sont des organismes au potentiel encore trop inexploré. En effet, les champignons filamenteux ont la capacité de produire un grand nombre de métabolites secondaires. Contrairement aux métabolites primaires, ces métabolites secondaires ne sont pas indispensables au développement et à la survie de l'organisme. Le rôle de ces métabolites secondaires est encore aujourd'hui source de questionnement. Cependant, quelques hypothèses émergent telle que la facilitation procurée par ces composés dans la colonisation de substrats par le champignon filamenteux dans un contexte de compétition entre micro-organismes (Ballester et al., 2015). Toutefois, l'étude de ces métabolites a montré que ces molécules peuvent être bénéfiques pour l'Homme. En effet, les métabolites secondaires fongiques sont utilisés dans de nombreux domaines tels que :

- Les industries pharmaceutique et médicale : synthèse de médicaments et d'antibiotiques (la
pénicilline par Penicillium chrysogenum ou la céphalosporine par Cephalosporium acremonium).

- L'industrie alimentaire : production de fromages tels que le roquefort (Penicillium roqueforti)

ou le camembert (Penicillium camenberti) (Ropars et al., 2012) ; la production d'acides (citrique et gluconique) utilisés comme additifs alimentaires (Karaffa et al., 2001) ; ou encore dans la synthèse d'enzymes (maltase, dextrinase) capables de convertir le maltose et l'amidon en alcool (Lv et al., 2008).

Cependant, à l'opposé de ces aspects bénéfiques, les champignons filamenteux peuvent également produire des métabolites secondaires néfastes, appelés mycotoxines, représentant un risque pour la santé humaine et animale. Les moisissures toxinogènes sont capables de facilement se développer à partir du moment où les facteurs environnementaux, tels que la température et l'humidité, sont propices à leurs croissance (Paterson, 2006). Elles sont donc en mesure de contaminer un panel très large de substrats alimentaires allant d'aliments d'origine végétale comme les céréales, les fruits et leurs dérivés jusqu'aux aliments d'origine animale tels que le lait, la viande et leurs dérivés (Yiannikouris et Jouany, 2002). De plus, les mycotoxines sont des molécules extrêmement résistantes aux procédés de stabilisation des denrées (pasteurisation, stérilisation), augmentant ainsi leur capacité à perdurer dans la chaîne de production alimentaire (Escrivá, et al., 2017)

2. Les genres Aspergillus et Penicillium

2.1. Aspergillus spp

Le nom d'Aspergillus a été créé en 1729 par le prêtre et botaniste Antonio Pier Micheli dont les têtes des spores asexuées lui ont évoqué un appareil liturgique utilisé pour asperger de l'eau bénite sur les fidèles : un aspergillum (Varga et Samson, 2008). Le genre Aspergillus est un genre constitué de plus de 250 espèces de champignons filamenteux saprophytes appartenant au phylum des Ascomycota. On les retrouve au niveau de la rhizosphère, mais aussi à la surface du sol, sur les végétaux, les fleurs, les grains, le terreau... Le genre Aspergillus est divisé en quatre sous-genres

(Circumdati, Aspergillus, Fumigati et Nidulantes) comprenant chacun un grand nombre de clades (Gautier et al., 2016). De plus, via la production de mycotoxines, il est reconnu que quelques espèces (tel que A. flavus et A. parasiticus) sont néfastes pour l'Homme et l'animal.

2.2. Penicillium spp

3. Les mycotoxines, aflatoxines et patuline

3.1. Les mycotoxines, diversité et dangerosité

Le terme mycotoxine provient du grec « uýêçò» signifiant champignon et du latin toxicum signifiant « poison ». Ce terme s'applique à des composés chimiques toxiques de faible poids moléculaire (<1000 Da) produits par différentes espèces de champignon (Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Fusarium, Byssochlamys et Claviceps). Contrairement aux métabolites primaires, la production de mycotoxines n'est pas essentielle aux différents processus de développement fongique. C'est pourquoi ces composés sont considérés comme des métabolites secondaires (Drew et Demain, 1977). Comme dit précédemment, les raisons de la production de métabolites secondaires par certains champignons restent encore un domaine à éclaircir et certaines propositions commencent à émerger. Par exemple, les mycotoxines sont pensées comme agents de défense fongiques donnant un avantage concurrentiel à la souche productrice (Rohlfs et al., 2007), ou encore que ces dernières fassent partie d'un processus de reproduction fongique permettant une compétition inter-espèces (Thippeswamy et al., 2014 ; Vaishnav et Demain, 2011 ; Magan et Aldred, 2007).

Les mycotoxines peuvent contaminer les cultures agricoles à toutes les étapes de la chaine de production : avant et/ou pendant la récolte, lors du séchage ou encore lors du stockage (Turner et al., 2009). Elles se retrouvent à l'état de contaminants naturels de nombreuses denrées d'origine végétale, notamment les céréales, fruits, noix, amandes, grains, fourrages ainsi que les aliments composés et manufacturés contenant ces matières premières et destinées à l'alimentation humaine et animale (Rapport AFSSA, 2009). A ce jour, nos connaissances permettent de recenser plus de 2000 mycotoxines différentes. Une trentaine d'entre elles, sur la base de leur toxicité, leur stabilité et leur prévalence dans les denrées alimentaires, présente une grande importance en santés humaine et animale (Iram et al., 2016 ; Bullerman et al., 2007 ; Rapport AFSSA, 2009). De plus, il est communément admis que :

Cela signifie que l'Homme et l'animal ne sont pas exposés à une seule mycotoxine à la fois mais à un mélange de mycotoxines, dont les effets cumulés restent encore peu étudiés. Ces effets peuvent être de nature antagoniste, additifs ou synergiques (Alassane-Kpembi et al., 2017). La toxicité d'une mycotoxine est dépendante de sa structure moléculaire mais également de la dose et de la durée d'exposition. En effet, en fonction de sa structure et de la voie métabolique dont elle est issue (terpènes, cyclopeptides, polycétoacides...), elle peut induire une toxicité au niveau de différents organes et provoquer différents effets (Tableau 1). Cette toxicité peut être de nature aigüe (ingestion d'une seule forte dose) ou chronique (ingestion répétée d'une faible dose sur une longue période) en fonction de la consommation des produits alimentaires contaminés. Les intoxications chroniques restent les plus dangereuses en raison des habitudes alimentaires des consommateurs et de la capacité de rémanence des mycotoxines dans l'organisme. En effet, leur capacité à se lier aux protéines plasmatiques et leur lipophilie en font des toxines capables de se maintenir dans l'organisme en cas d'expositions répétées et rapprochées (Rapport AFSSA, 2009). Toutes ces considérations témoignent que les mycotoxines sont un problème très actuel de santé publique, de qualité et de sécurité sanitaire des aliments.

Tableau 1 - Exemples de mycotoxines, d'espèces productrices, de source et d'effets les plus fréquents (Rapport
AFSSA, 2009 ; CAST, 2003 ; Krska et al, 2008 ; Bbosa, 2013).

Mycotoxine	Type	Genre	Producteurs	Principaux produits contaminés	Effets
Aflatoxines	B1, B2	Aspergillus	A. flavus A. parasiticus	Maïs, blé, riz, soja, noix, amandes, fruits séchés, épices...	Hépatotoxique Carcinogénique Immunotoxique Tératogénique

A	Penicillium	P. verrucosum	Céréales, cacao, café, vin, jus de raisin et épices	Néphrotoxique Immunotoxique Tératogénique
		A. westerdijkiae A. carbonarius
	Penicillium	P. expansum	Pommes, poires et leurs dérivés	Neurotoxique Génotoxique Cytotoxique
		A. clavatus B. nivea	Ensilages
		Byssochlamys
Fumonisines	B1, B2 et B3	Fusarium	F. verticillioides F. proliferatum A. niger	Maïs, riz et sorgho	Neurotoxique Carcinogénique
Zéaralénone		Fusarium	F. graminearum F. culmorum	Maïs, sorgho, soja, blé, riz et avoine	Reprotoxique Immunotoxique

3.2. Les aflatoxines

En 1960, en Angleterre, des investigations menées au moment de l'épisode de la « maladie X du dindon » (the Turkey X disease) ont permis de mettre en évidence la présence d'une toxine dans les matières premières constituant la nourriture des volailles. En effet, après examens, Asao et al. (1963) ont réussi à identifier une contamination par A. flavus qui par extension donnera son nom à

la toxine subséquente : l'aflatoxine pour
Aspergillus flavus toxine. Les aflatoxines sont majoritairement synthétisées par des espèces fongiques appartenant au genre Aspergillus telles que A. flavus pouvant produire les aflatoxines B1 et B2 et A. parasiticus pouvant produire, en plus, les aflatoxines G1 et G2 (Varga et al., 2011).

A ce jour, même si près de 20 aflatoxines ont été décrites seules 4 d'entre elles sont produites par des champignons : AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2 (Ashiq et al., 2014). Les aflatoxines AFM1 et AFM2, retrouvées dans le lait, sont les métabolites des aflatoxines AFB1 et AFB2, issus de leur hydroxylation dans le foie des animaux exposés (Figure 4). Ces derniers représentent aussi un danger en termes de santé publique puisque, fixés aux caséines, ils persistent dans le lait.

Bien que chacune des aflatoxines soit délétère, le pouvoir toxique de cette famille de mycotoxine est associé à l'aflatoxine AFB1, considérée comme le principal métabolite génotoxique à fort potentiel cancérogène (IARC, 1987). L'organe cible étant le foie, de nombreuses études épidémiologiques tendent à montrer l'existence d'une corrélation entre une exposition chronique à l'AFB1 via le régime alimentaire et une prévalence du cancer primitif hépatique (ANSES, avril 2012). L'AFB1 peut également être à l'origine d'aflatoxicoses aigues dont les symptômes passent par des ictères, des vomissements, des douleurs abdominales, un sentiment de dépression, de l'anorexie, des diarrhées pouvant parfois mener jusqu'au décès de la personne intoxiquée (CIRC, 2015). De plus, les aflatoxines présentent des effets immunomodulateurs et immunotoxiques qui ont été mis en lumière au travers d'expérience in vivo et in vitro (Bondy et Petska, 2000 ; Meissonnier et al., 2008). En effet, la réponse inflammatoire est inhibée par ces mycotoxines en affectant spécifiquement les macrophages, les empêchant de réaliser la phagocytose et de sécréter des cytokines mais aussi en stimulant la production de radicaux oxygénés. A la vue de ces effets délétères, le CIRC a classé les aflatoxines dans le groupe n°1, reconnaissant cette mycotoxine comme un cancérogène avéré.

3.3. La patuline

À la suite de la découverte de la pénicilline en 1928 par Fleming, la patuline (Figure 3) a été découverte lors d'une campagne de criblages de nouvelles molécules fongiques ayant des propriétés antibactériennes. Bien que cette mycotoxine porte plusieurs appellations différentes (expansine, clavacine...), sa caractérisation a permis son utilisation en médecine thérapeutique autant animale qu'humaine (Moake et al., 2005 ; Clarke, 2006). Cependant, une quinzaine d'années plus tard, suite à une épidémie du bétail due à une intoxication alimentaire attribuée à la patuline, toutes recherches sur cette molécule en tant qu'antibiotique potentiel ont été abandonnées et la patuline a été classée comme mycotoxine (Özdemir et al., 2009). Cette dernière est un métabolite secondaire synthétisé par des espèces fongiques appartenant aux genres Aspergillus, Penicillium, Byssochlamys et Paecilomyces dont le genre Penicillium s'avère être le producteur majeur.

Non seulement la production de patuline est dépendante d'un certain nombre de facteurs environnementaux (activité de l'eau, température, pH...), elle est également dépendante de facteurs intrinsèques aux fruits (Moake et al., 2005). En effet, la production de patuline est influencée par la variété du fruit sur laquelle le champignon se développe mais aussi par la présence de blessures sur le fruit infecté (McCallum et al., 2003). Quelques substrats naturels tels que les céréales et la paille permettent la toxinogenèse lors de l'ensilage mais dans son ensemble, les différentes enquêtes réalisées dans le monde prouvent que les niveaux de contamination les plus élevés sont retrouvés dans les pommes et autres produits dérivant de la transformation des pommes (ANSES, 2012). Par exemple, une étude de l'alimentation de la population française par rapport à la patuline a montré que cette mycotoxine était présente à de très fortes teneurs dans des groupes d'aliments tels que les compotes et les fruits cuits (1 ug/kg), les boissons fraîches sans alcool (0,12 ug/kg) et les fruits (0,04 ug/kg) (Etude de l'Alimentation Totale 2, Anses, 2011).

Le risque d'exposition à la patuline se pose d'une manière sérieuse compte tenu du nombre d'effets toxiques qui lui sont attribués. En effet, en fonction de la dose ingérée, la patuline montre une toxicité aiguë, subaiguë ou chronique se manifestant par une neurotoxicité, une embryotoxicité, une génotoxicité, une cytotoxicité, une mutagénicité et une immunotoxicité (Puel et al., 2010). Les symptômes caractéristiques d'une intoxication aiguë ou subaiguë à la patuline passe par une perte pondérale, des désordres gastriques et intestinaux ainsi qu'une perturbation de la fonction rénale. Cependant, concernant le caractère cancérogène de la patuline, cette toxine a été classée par le CIRC (1986) dans le groupe n°3, où figurent les produits pour lesquels il est impossible de se prononcer quant à la cancérogénicité pour l'homme.

4. Problèmes sanitaires engendrés et réglementation subséquente

Les mycotoxines sont à l'origine d'un grand nombre de préoccupations autant sur le plan de la

santé publique que de la sécurité sanitaire des aliments. En effet, une étude réalisée sur plus de 17 000 échantillons de céréales (maïs, blé, orge et riz) et leurs produits dérivés provenant de différentes régions du globe (Amérique du Nord et du Sud, Afrique, Asie, Europe et Océanie) démontre que la problématique des mycotoxines est mondiale (Streit et al., 2013). Cette même étude a démontré que 38 % des échantillons étaient contaminés par plusieurs mycotoxines simultanément. Cela pose de grandes interrogations quant aux interactions potentiellement délétères entre les toxines présentes étant donné qu'aucune recommandation ou réglementation actuelle ne tient compte des situations de multi-contaminations.

Depuis des millénaires, l'Homme est conscient de l'importance mais surtout de la nécessité de contrôler la qualité sanitaire des aliments afin de protéger au mieux les consommateurs. C'est pourquoi il existe deux grands axes de préoccupations majeures lorsqu'on évoque les mycotoxines :

- La sécurité sanitaire des aliments et rendements associés : du fait de la capacité des
mycotoxines à perdurer à tous les stades de la chaîne de production et de leur grande stabilité aux différents traitements physico-chimiques, ces dernières sont à l'origine de préjudices économiques considérables pour les agriculteurs (altération de la qualité des matières premières, baisse des rendements, diminution de la valeur économique des récoltes...). La Food And Agriculture Organization estime les pertes totales de denrées dues aux mycotoxines à plus de 1 milliards de tonnes par an. Par exemple, pour les pays essentiellement agricoles, les cultures représentent parfois l'élément dominant du commerce international du pays et constituent souvent leur principale source de revenu. Dans un tel contexte, le problème des mycotoxines ne fait qu'accroître les difficultés pour le commerce de ces pays dans l'éventualité d'une perte de gains due à de mauvaises récoltes (sécheresse, pluies ravageuses...) (ONU, 1983).

- La santé humaine et animale : bien que ce problème concerne majoritairement les individus consommant des denrées contaminées, cela concerne également ceux au contact de denrées infectées (secteur agricole, filière de fabrication d'aliments pour animaux, transformation des denrées alimentaires, compostage, laboratoire d'analyses et de recherche...). En 2010, l'Institut National de Recherche et de Santé publie un dossier médico-technique faisant un état de l'art sur l'exposition des travailleurs aux mycotoxines en milieu professionnel. Les exemples d'études réalisées en milieu de travail sont unanimes quant à une exposition massive des travailleurs à des spores fongiques capables de toxinogenèse. Cependant, grâce à ces observations et aux résultats de l'expérimentation animale, des indications générales sur les risques que peuvent représenter les mycotoxines ont été récoltées. Ces dernières auront pour but de générer des procédures standardisées de traitement dans tous les secteurs touchés par ce problème.

Dans le cadre du règlement 1881/2006/CE portant sur la fixation de teneurs maximales pour certains contaminants dans les denrées alimentaires destinées à l'homme, des teneurs maximales en aflatoxine et patuline ont été instaurées. Les teneurs maximales de ces mycotoxines varient en fonction des denrées considérées et sont présentées dans le Tableau 2 pour les aflatoxines et le Tableau 3 pour la patuline.

5. L'éthylène et les fruits climactériques

En 1901, à Saint-Pétersbourg, Dimitry Neljubow observe que les plantes à proximité des lanternes à gaz avaient des tiges et des feuilles de forme anormale. En étudiant ce phénomène, il découvre alors l'éthylène (C2H4), gaz incolore, à l'odeur âcre faisant partie des composés organiques actifs les plus simples au monde (Bakshi et al., 2015).

Les fruits sont essentiels à la nutrition et à la santé humaine. Selon le profil respiratoire et la production d'éthylène pendant la maturation, les fruits peuvent être divisés en deux classes : les fruits climactériques (pomme, tomate, poire...) et non climactériques (raisin, agrumes, pastèque...). Chez les fruits climactériques, l'éthylène occupe une place centrale pour la bonne maturation d'un bon nombre d'entre eux (Bapat et al., 2010). En effet, ce gaz régulerait de nombreux aspects du cycle de vie des plantes comprenant la germination des graines, l'initiation des racines, le développement des fleurs, la détermination du sexe, la maturation des fruits, la sénescence... (Street et al., 2015 ; Ju et Chang, 2015 ; El-Maarouf-Bouteau et al., 2015). Cela a fait de l'éthylène le plus ancien régulateur de

croissance connu. Cependant, bien que toutes les cellules de la plante produisent de l'éthylène au cours du développement, des taux plus élevés ont été observés au niveau de tissus stressés ou en train de mûrir (Abeles et al., 1992). Ces constatations ont pu mettre en exergue l'importance de l'éthylène à des réponses biotiques (attaque de pathogènes...) et abiotiques (blessures, hypoxie, fraîcheur...), la qualifiant d'hormone du stress chez les plantes (Wang et al., 2013).

Le 1-MéthylCycloPropène, ou 1-MCP, est un gaz inhibiteur de l'éthylène empêchant son action physiologique. En effet, il a été prouvé que l'application de 1-MCP peut maintenir la fraîcheur de divers fruits, légumes et fleurs (Blankenship et Dole, 2003 ; Kurahashi et al., 2005 ; Ortiz et al., 2005). Bien que les processus au niveau moléculaire de ces observations ne soient pas entièrement compris, il est admis que le 1-MCP se lie de manière irréversible aux récepteurs de l'éthylène, entrant en compétition avec le substrat originel (Blankenship et Dole, 2003). Grâce à cette propriété, le 1-MCP est devenu un composé majeur dans l'étude et la compréhension de l'action et l'affinité de l'éthylène sur ces récepteurs associés.

A la fin des années 1970, plusieurs équipes découvrent et caractérisent biochimiquement les sites de liaison de l'éthylène chez les plantes (Sisler, 1979 ; Sisler, 1980 ; Evans et al., 1982). Cependant, la purification et la caractérisation approfondies des récepteurs isolés des plantes ont été rendues difficiles par un certain nombre de facteurs tels que la localisation membranaire, de faibles taux d'expression et la présence de plusieurs isoformes. Puis, l'utilisation d'Arabidopsis thaliana comme système végétal modèle pour étudier la signalisation de l'éthylène (Bleecker et al., 1988 ; Guzman et Ecker, 1990) et le clonage du récepteur à l'éthylène, EThylene Receptor 1 (ETR1) (Chang et al., 1993), a ouvert une nouvelle voie de recherche qui a donné lieu à quantité d'informations sur la signalisation de l'éthylène, y compris les récepteurs.

Chez les plantes, les récepteurs à l'éthylène sont retrouvés au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique. Ils forment des homodimères dont chaque monomère est composé de trois hélices á transmembranaires avec une extrémité amino-terminale contenant le site de liaison de l'éthylène (Bowman et al., 2017). Puis la partie cytosolique du récepteur est constituée d'un domaine GAF, un domaine kinase ainsi qu'un domaine récepteur. En 2005, O'Malley et al. ont mis en évidence que, chez les plantes, l'éthylène est perçu par une famille de récepteurs liés aux histidines kinases bactériennes qui modulent l'activité de la kinase CTR1 (Constitutive Triple Response 1). En absence d'éthylène, une cascade de phosphorylation et d'ubiquitination engendrée par cette kinase va moduler le taux de facteurs de transcription EIN3 et EIL1 (Qiao et al., 2009 ; Gagne et al., 2004 ; Li et al., 2015 ; Merchante et al., 2015) conduisant à la plupart des réponses à l'éthylène. Cependant, il est nécessaire de nuancer ce propos par la présence d'isoformes aux récepteurs ETR1 à l'éthylène qui peuvent présenter des activités kinase différentes de celle présentée (Moussatche et Klee, 2004 ; Xie et al., 2003). Chez les organismes non-végétaux, bien que certaines espèces aient été documentées

pour répondre à l'éthylène (Abeles et al., 1992 ; Bakshi et al, 2018), très peu d'informations sont connus à la fois sur les récepteurs associés et sur la signalisation intracellulaire qui en découle.

6. L'éthylène chez les champignons filamenteux

Un certain nombre d'études ont porté sur le rôle de l'éthylène chez les champignons, principalement en raison de l'importance à comprendre les interactions entre le champignon et les plantes, en particulier les champignons pathogènes et toxinogènes. Ces études ont montré que, suite à un traitement avec de l'éthylène exogène, certains champignons présentent des altérations dans leur physiologie (germination et production des spores), montrant que ces espèces fongiques réagissent à l'éthylène (Pristijono et al., 2018 ; Chagué et al., 2006 ; Flaishman et Kolattukudy, 1994). En effet, des expérimentations faites sur des espèces fongiques toxinogènes et non-toxinogènes ont montré un effet observable de l'éthylène : A. nidulans avec une inhibition du développement des ascospores (cellules reproductrices) (Roze et al., 2004) ; A. parasiticus avec une inhibition de la biosynthèse de l'aflatoxine (Roze et al., 2004 ; Gunterus et al., 2007) ; P. expansum avec une diminution du nombre de spores lors d'un traitement à fortes doses d'éthylène (Kepczynski et Kepczynska, 1977). Cependant, il a également été prouvé que certaines espèces de champignons ne subiraient aucun effet apparent de l'éthylène sur un quelconque processus physiologique (Lynch, 1975 ; El-Kazzaz et al., 1983). Peu d'études ont été faites sur les récepteurs et/ou la voie de signalisation de l'éthylène chez les champignons filamenteux, mais des pistes de recherche commencent à émerger. En effet, des études de transcriptomiques ont montré que des variations transcriptionnelles ont été observées dans la voie de signalisation couplée aux protéines G lors de l'application d'un traitement à l'éthylène (Lin et al., 2019).

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont des complexes protéiques membranaires fortement représentés dans le monde des organismes eucaryotes. Ils sont constitués de 7 hélices transmembranaires attachées les unes aux autres par des boucles internes et externes. Ces récepteurs sont capables de détecter une large gamme de signaux extracellulaires différents tels que les ions, la lumière, les acides aminés/nucléiques, les sucres, les peptides de phéromones, les oxylipines...(Kenakin et Miller, 2010). La liaison du ligand provoque un changement conformationnel du récepteur permettant la transmission des informations à l'intérieur de la cellule et induisant ainsi différents types de réponses en fonction de la nature du ligand.

Après l'activation de la GPCR chez les champignons filamenteux, il semble que les effecteurs en aval soient principalement les cascades de phosphorylation des protéines MAP kinases et des voies adénylate cyclase/ cAMP / PKA (Lengeler et al., 2000) ayant un rôle dans les différentes fonctions cellulaires telles que le développement fongique, le métabolisme, la virulence et la biosynthèse de mycotoxines. Par exemple, chez A. nidulans, il a été prouvé que les protéines G peuvent réguler la

production de stérigmatocystine (mycotoxine et précurseur de l'aflatoxine) par une régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle des médiateurs impliqués dans la voie de biosynthèse des mycotoxines (Hicks et al., 1997 ; Shimizu et al., 2003). De même, l'implication des protéines G a également été démontrée dans la biosynthèse des aflatoxines chez A. parasiticus (Roze et al., 2004 ; Gunterus et al., 2007). Fait intéressant, certains champignons toxinogènes tels que P. expansum semblent déclencher une réponse à l'éthylène exogène, même si aucune preuve directe n'a été trouvée entre les GPCR et la biosynthèse de patuline (Kepczynski et Kepczynska, 1977).

Au cours de la dernière décennie, une étude génomique a montré que de nombreux champignons filamenteux, pathogènes ou non, détiennent des GPCR similaires à ceux déjà caractérisés (Krishnan et al., 2012). Cependant, plusieurs analyses bio-informatiques ont permis d'appréhender l'existence potentielle de nouveaux GPCR fongiques (Zheng et al., 2010 ; Martin et al., 2019 ; Brown et al. 2018). La connaissance et la compréhension des récepteurs à l'éthylène et des voies de signalisation chez les espèces fongiques, potentiellement via les GPCR, semblent être une piste prometteuse en termes de régulation, de contrôle ou encore même d'élimination de la production de mycotoxines lors de moments critiques du cycle de vie des fruits infectés.

6.3. Perspective d'utilisation de l'éthylène comme agent de biocontrôle

Jusqu'à récemment, l'utilisation des produits phytosanitaires était favorisée dans la lutte contre la contamination par les champignons toxinogènes et leurs mycotoxines associées. Cependant, la toxicité de ces produits ainsi que leurs effets sur la santé humaine, animale et sur l'environnement encouragent le développement de méthodes de luttes alternatives basées sur l'utilisation d'agents biologiques ou de composés naturels. En France, ce type d'approches se traduit par l'adoption du plan Ecophyto 2025 qui a pour objectif de réduire de 50% l'usage de pesticides en agriculture. Certains composés naturels tels que les épices, les huiles essentielles ou des extraits aqueux de plantes ont montré une bonne capacité à réduire la mycotoxigenèse in vitro (Bluma et Etcheverry, 2008 ; Razzaghi-Abyaneh et al., 2005 ; Jahanshiri et al., 2012). Néanmoins, malgré cette preuve de concept, se pose la problématique de la mise en oeuvre de ce type de stratégie. En effet, une fois au contact des denrées alimentaires, ces composés peuvent altérer les qualités organoleptiques de ces dernières, ce qui en résulterait par une perte économique pour le producteur.

Parmi les composés naturels candidats au développement de telles approches écoresponsables, l'éthylène semble constituer une piste de recherche prometteuse. En effet, l'éthylène étant déjà utilisé en agroalimentaire pour faire mûrir les bananes ou déverdir les agrumes (Mahajan et al., 2014), le développement d'une stratégie de lutte contre la contamination en mycotoxines par l'utilisation d'un gaz semble tout à fait réalisable tant sur le plan de la mise en oeuvre que sur le plan réglementaire.

Les souches des champignons A. flavus (NRRL 62477), A. parasiticus (NRRL 502) et P. expansum (NRRL 35695) proviennent du Laboratoire de Génie Chimique. Elles sont conservées sous forme de suspension de spores stockées au congélateur à -20°C.

L'éthylène et le 1-MéthylCycloPropène (1-MCP) pur ont été fournis par le laboratoire de Génomique et Biotechnologie des Fruits dans des contenants en verre hermétique.

Le milieu de culture utilisé pour la culture des souches fongiques est le milieu Czapek Yeast Agar (CYA). Pour préparer un volume de 1L de milieu CYA, il est nécessaire de mélanger 50 mL de solution A (40 g/L de NaNO3, 10 g/L de KCl, 10 g/L de MgSO4 heptahydraté et 0,2 g/L de FeSO4 heptahydraté) avec 50 mL de solution B (20 g/L de K2HPO4) ainsi que 0,5 mL de solution C (10 g/L de ZnSO45H20et 5 g/L de CuSO4 5H20), 5 g d'extrait de levure, 30 g de saccharose et 15 g d'agar bactériologique, complété jusqu'au volume final de 1 L avec de l'eau osmosée.

Pour chaque espèce fongique, 3 à 5 boîtes de Pétri de CYA sont ensemencées à partir des suspensions de spores congelées. Pour cela, 100 uL de suspension de spores sont étalés sur la gélose. Les boîtes de Pétri sont incubées pour une période de 7 jours à l'obscurité dans une étuve à 28°C avec un taux d'humidité compris entre 70 et 80%. Pour chaque champignon, une boîte de Pétri sera utilisée pour extraire les mycotoxines ( 7 - Extraction des mycotoxines) afin de les quantifier par HPLC.

Au terme de l'incubation, les spores sont récupérées sur les boîtes de Pétri à l'aide d'une solution de Tween 80 à 0,05%. Pour préparer cette solution, 5 g de Tween 80 sont mélangés à 95 mL d'eau distillée afin d'obtenir une solution mère de Tween 80 à 5%. Cette solution est stérilisée par autoclavage (121°C, 20 min) puis diluée au 100^ème dans des contenants en verre. La solution de Tween 80 à 0,05% obtenue est de nouveau autoclavée à 121°C pendant 20 minutes.

En condition d'asepsie, la récupération des spores se fait par ajout de 9 mL de Tween 80 à 0,05% directement sur les cultures mycéliennes en boîte de Pétri. A l'aide d'un râteau stérile, la surface des cultures est raclée doucement afin de décrocher les spores. Ces spores sont ensuite récupérées à la pipette et placées dans un tube plastique stérile. La suspension de spores obtenue est alors filtrée dans un nouveau tube plastique stérile à l'aide d'une seringue de 20 mL contenant du coton cardé stérile. Cette étape de filtration permet d'éliminer les fragments de mycélium qui aurait pu être entraînés avec les spores lors du grattage de la gélose avec le râteau.

La numération cellulaire permet de déterminer une quantité de spores par unité de volume. Elle est réalisée directement par comptage au microscope optique (grossissement x400) à l'aide d'une cellule de Thoma. Pour permettre un comptage plus aisé, des dilutions de la suspension de spores peuvent être réalisée en prélevant 1 mL de cette suspension que l'on additionne à 9 mL de Tween 80 à 0,05% (dilution au 1/10^ème). Des dilutions successives peuvent être faites si nécessaire. La numération est réalisée par comptage du nombre de spores présent dans au moins 5 des « grands » carrés constituant la cellule de Thoma. Après avoir effectué la manipulation, la concentration cellulaire de la suspension de spores peut être déterminée selon le calcul suivant :

Avec n = moyenne du nombre de spores comptées par « grands » carrés ; V = volume de comptage
(1 « grand » carré = 4. 10^-9 dm³) ; f = facteur de dilution.

A partir des suspensions de spores préparées, les boîtes de Pétri sont ensemencées en point central avec 10 uL d'une suspension de spores calibrée à 1,0.10⁶ spores/mL pour A. flavus et A. parasiticus et 1,0.10⁸ spores/mL pour P. expansum. Les boîtes sont laissées entrouvertes sous le poste de sécurité microbiologique afin de faire sécher les gouttes déposées. Une fois les gouttes sèches, le montage du système expérimental débute. Pour ce faire, des bocaux septés d'une contenance de 3,2 L ont été préalablement autoclavés avec à l'intérieur une boîte de conserve vide et propre d'un diamètre et d'une hauteur de 8 cm. En condition aseptique, 10 mL d'eau stérile sont ajoutés dans le fond du bocal pour assurer une humidité relative tout au long de l'expérience. Sur la boîte de conserve est placée une première boîte de Pétri contenant de la chaux sodée dans le but de capturer le CO2, qui peut altérer la croissance du champignon et perturber l'action de l'éthylène. Par-dessus cette boîte de Pétri est installé un « échafaudage » qui va accueillir une première boîte de Pétri ensemencée. Cette action est répétée jusqu'à placer les triplicats à l'intérieur du bocal. Les « échafaudages » permettent de créer une séparation nette entre les boîtes permettant aux gaz d'atteindre le champignon étudié. Une fois le montage terminé, un joint hermétique est adapté sur le couvercle du bocal qui est alors fermé et totalement hermétique. Après injection des gaz, les bocaux sont placés dans une étuve à 28°C pendant 72h.

Les gaz sont injectés grâce à des seringues étanches via les septums présents sur les couvercles des bocaux. Les concentrations de gaz testées sont pour l'éthylène : 0,1 ppm (injection de 10 mL de D2), 10 ppm (injection de 10 mL de D1), 100 ppm (injection de 0,32 mL de D0) et 1000 ppm (injection de 3,2 mL de D0) ; pour le 1-MCP : 0,01 ppm (injection de 3,2 mL de M2), 1 ppm (injection de 3,2 mL de M1), 5 ppm (injection de 1,6 mL de M0) et 10 ppm (injection de 3,2 mL de M0).

Les analyses HPLC sont faites grâce à un système Dionex Ultimate 3000 UHPLC (Thermo Scientific, Illkirch, France) selon deux méthodes différentes en fonction de la mycotoxine recherchée.

Trois standards commerciaux ont été utilisés pour préparer les gammes étalons. Un standard d'aflatoxine B1 pour la doser dans les cultures d'A. flavus, un standard constitué d'un mélange des quatre aflatoxines (AFB1 (1 ug/L), AFB2 (3 ug/L), AFG1 (1 ug/L) et AFG2 (3 ug/L)) permettant de doser

chacune de ces molécules dans les cultures d'A. parasiticus et un standard de patuline afin de doser la patuline dans les cultures de P. expansum. Les concentrations des différentes gammes étalons utilisées sont présentées dans le tableau 4.

Tableau 4 - Concentrations en mycotoxines des différentes gammes étalons utilisées

L'analyse des échantillons des cultures d'A. flavus et A. parasiticus a été faite en utilisant une colonne de chromatographie Luna® C18 (125 x 2 mm, 5 rim, 100 Å) (Phenomenex, Torrance, CA, USA) à 30 °C. Les conditions de séparation ont été adaptées de Fu et al. (2008). Un mode isocratique de 20 minutes a été utilisé avec 82,5% d'éluant A : eau acidifiée (0,2% d'acide acétique) et acétonitrile (65/17,5 v/v) et 17,5% d'éluant B : méthanol pur de qualité HPLC (Fisher Scientific, Illkirch, France). Le débit était de 0,2 mL/min et le volume d'injection de 5 riL. Les aflatoxines sont détectées à l'aide d'un détecteur à fluorescence réglé à des longueurs d'ondes d'excitation/émission de 365/430 nm. Les résultats obtenus ont été confirmés en comparant le spectre d'absorption UV avec un détecteur à barrette de diodes (DAD) couplé au système et le temps de rétention avec un standard commercial. Les niveaux de production des aflatoxines ont été calculés sur la base des gammes étalon.

L'analyse des échantillons des cultures de P. expansum a été faite en utilisant une colonne de chromatographie Gemini^® C6-phényl (250 x 4,60 mm, 5 ìm, 100 Å) (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Les analyses ont été effectuées à un débit de 0,9 mL/min avec un volume d'injection de 5 riL en utilisant le programme d'élution en gradient suivant : l'éluant A était de l'eau acidifié à 0,2% avec de l'acide acétique et l'éluant B était du méthanol pur de qualité HPLC (Fisher Scientific, Illkirch, France). Les conditions d'élution utilisées étaient les suivantes : un gradient croissant linéaire du solvant B de 0 à 15% pendant 20 min ; 15% de solvant B pendant 5 min ; un gradient croissant linéaire du solvant B de 15 à 90% pendant 10 min ; 90% de solvant B pendant 5 min ; un gradient décroissant linéaire du solvant B de 90 à 0% pendant 5 min ; 0% de solvant B pendant 15 min. La patuline a été détectée à l'aide d'un détecteur à barrette diodes (DAD) à une longueur d'onde de 277 nm. Les résultats obtenus ont été confirmés en analysant le spectre d'absorption au DAD et le temps de rétention avec un standard commercial. La production de patuline a été quantifiée grâce à une gamme étalon.

Dans un premier temps, la normalité de la distribution des données a été testée par un test de Shapiro-Wilk. Puis, l'analyse de la variance a été réalisée par un test ANOVA suivi d'un test de comparaison multiple de Dunnett afin de comparer les différences de production de mycotoxines dans les différentes conditions de culture. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Les différences ont été considérées statistiquement significatives lorsque la p-value était inférieure à 0,05.

A cause de la crise COVID, le début du stage a été consacré à une recherche in silico de récepteurs potentiels à l'éthylène chez les espèces d'Aspergillus et P. expansum. A partir de la séquence protéique du récepteur couplé à la protéine G3 de B. cinerea, des alignements ont été obtenus sur le génome d'A. flavus, A. parasiticus et P. expansum et par la suite soumis à une analyse TMPred. Des exemples de résultats sont mis en forme dans l'annexe 1 pour A. flavus, l'annexe 2 pour

A. parasiticus et l'annexe 3 pour P. expansum. Les domaines protéiques surlignés en vert correspondent aux domaines transmembranaires retrouvés par le logiciel TMPred sur la base du « Strongly prefered model ». Puis, selon la représentation de l'ETR1 présenté par Wang et al., 2006, les acides aminés considérés comme essentiel dans la liaison de l'éthylène au récepteur sont représentés en rouge à l'intérieur des domaines transmembranaires.

Tout d'abord, la première observation a été de retrouver des GPCRs fongiques analogues à celles de B. cinerea, champignon réagissant à l'éthylène. Cependant, les observations faites sur les différentes séquences GPCR retrouvées nous permettent uniquement de spéculer sur un rôle potentiel des GPCR dans la signalisation cellulaire de l'éthylène chez les champignons filamenteux. En effet, la répartition exacte des acides aminés décrite chez Wang et al. (2006) n'est retrouvé dans aucune des séquences protéiques des champignons d'intérêts. Cela laisse supposer plusieurs hypothèses dont les deux les plus probables sont : 1. Les GPCRs fongiques chez A. flavus, A. parasiticus et P. expansum ne sont pas ou n'ont aucun lien avec les récepteurs à l'éthylène ou 2. Les récepteurs à l'éthylène sont potentiellement les GPCRs fongiques mais très différents de l'ETR1 décrit chez A. thaliana.

Le dosage de l'éthylène a été fait sur les premières semaines de manipulation par GC, lorsque le système expérimental a été mis en place. En effet, cela nous a permis de vérifier que les gaz injectés étaient à la concentration souhaitée tout au long des expériences et par conséquent d'apprécier l'étanchéité du système d'expérimentation.

Tableau 5 - Exemple de dosage de la concentration d'éthylène dans les bocaux

Les vérifications des concentrations en éthylène par GC sont effectuées régulièrement et seulement quelques résultats sont présentés ici. Les résultats du tableau 5 montrent que la concentration retrouvée dans les conditions expérimentales (valeurs mesurées) correspondent aux concentrations que l'on souhaite tester (0,1 et 10 ppm). Ces mesures ont été répétées sur les deux premières expériences, et les valeurs mesurées étaient proches des valeurs souhaitées.

Lors des expérimentations, plusieurs paramètres ont été analysés : la croissance radiale fongique, la production de mycotoxines ainsi que la teneur en CO2. Cependant, ayant l'opportunité de doser le CO2 que tardivement dans le stage, seule la teneur en CO2 pour A. flavus a été étudiée.

Les résultats de croissance radiale obtenus pour A. flavus ne montrent pas d'effet significatif de l'éthylène et du 1-MCP sur la croissance du champignon. En effet, les diamètres mesurés oscillent entre 3,67 cm et 3,97 cm (? = 0,30 cm) que l'expérience soit faite avec de la chaux sodée ou non (Figure 7).

Figure 7 - Mesure de la croissance radiale d'A. flavus avec et sans chaux sodée après 72h d'incubation. CS =
présence de chaux sodée

La figure 8 présente la concentration moyenne en aflatoxines B1 et B2 et le taux de CO2 dans les différentes conditions testées chez A. flavus. Une tendance semble se dessiner pour les très faibles valeurs d'éthylène (0,1 ppm) et de 1-MCP (0,01 ppm) puisqu'on remarque que la production d'AFB1 et AFB2 est équivalente à la production retrouvée dans la condition témoin. De plus, on observe une augmentation de la production de mycotoxines à partir des concentrations « fortes » des gaz (éthylène 10 ppm, 100 ppm et 1000 ppm ; 1-MCP 1 ppm, 5 ppm et 10 ppm). On remarque également qu'il semble y avoir une corrélation entre le taux de CO2 et la production d'aflatoxines puisque dans les conditions où on retrouve un fort taux de CO2 s'observe également une faible production d'AFB1 et AFB2 (CO2

(éthylène 0,1 ppm) = 2,37 % et CO2 (1-MCP 0,01 ppm) = 2,32 %). A l'inverse, il semble que plus la teneur en CO2 est faible, plus la production d'aflatoxines est forte (« concentrations fortes »).

Figure 8 - Dosage de l'AFB1, AFB2 et du CO2 chez A. flavus sans chaux sodée après 72h d'incubation. MCP =

Les premières investigations ont noté que le CO2 a la capacité de neutraliser les effets de l'éthylène dans de nombreux cas (Burg et Burg, 1967), mais plus récemment, il est devenu évident que l'interaction entre le CO2 et l'éthylène est plus complexe. En effet, l'effet du CO2 sur la production et l'efficacité de l'éthylène est dépendante de la pression partielle de CO2 appliquée et la durée d'exposition (De Wild et al., 2003).

Depuis le départ, nous savions que le CO2 serait un facteur limitant à notre système expérimental. C'est pourquoi les boîtes de Pétri ensemencées ont été surélevées par une boîte de conserve. En effet, le CO2 étant un gaz plus lourd que l'oxygène, celui-ci a tendance à s'accumuler au fond du bocal. Cependant, les premières observations ont montré que le taux de CO2 est tout de même trop élevé puisqu'on retrouve entre 1,42 % et 2,42 % de CO2 présent dans les bocaux (Figure 8). Ce constat étant problématique pour étudier l'effet de l'éthylène, 50 g de chaux sodée ont été ajoutés à chacune des conditions expérimentales pour le reste de nos expérimentations. Cela permettra de s'affranchir des artéfacts causés par le dioxyde de carbone et par conséquent de visualiser seulement les effets du gaz d'intérêt. De plus, les champignons étant aérobies, la présence de CO2 peut aussi réduire la croissance fongique. En effet, on note en figure 7, une croissance systématiquement plus forte lorsque le CO2 est piégé par la chaux sodée.

La concentration moyenne en aflatoxines B1 et B2 et le taux de CO2 dans les différentes conditions testées chez A. flavus en présence ou non de chaux sodée sont représentés dans le figure 9. La première observation montre une réduction significative du taux de CO2 présent dans les conditions expérimentales lorsque 50 g de chaux sodée sont ajoutés. En effet, sans chaux sodée, les teneurs de CO2 avoisinnent les 1% tandis que ces dernières sont diminuées d'un facteur 10 lors de l'ajout de chaux sodée. On remarque également que, en absence de chaux sodée, il semble y avoir une stimulation de la production d'aflatoxines lors d'un traitement à l'éthylène, plus la concentration en éthylène appliquée est importante, plus les productions d'AFB1 et AFB2 semblent importantes. Cependant, malgrès cela, cette figure montre bien que l'éthylène a un effet sur la toxinogénèse fongique puisque lorsqu'on s'affranchit de l'effet antagoniste du CO2, on observe une diminution de la production d'aflatoxines et surtout de l'AFB1 (exemple : [éthylène 1 ppm] = 567,64 ug/L alors que [éthylène 1 ppm CS] = 252,59 ug/L, autrement dit, une réduction d'un facteur 2,25).

Figure 9 - Dosage de l'AFB1, AFB2 et du CO2 chez A. flavus avec et sans chaux sodée après 72h d'incubation.
CS = présence de chaux sodée

La figure 10 présente les résultats de la croissance radiale obtenue pour P. expansum. Pareillement à A. flavus, aucune différence significative n'a été observée entre les conditions témoins et celles où les gaz d'intérêts étaient testés. L'éthylène et le 1-MCP n'ont donc aucun effet significatif sur la croissance radiale de ce champignon avec des valeurs mesurées oscillant entre 2,26 cm et 2,40 cm sans chaux sodée. Cependant, on observe une diminution de la croissance (? 0,2 - 0,3 cm) dans toutes les conditions lorsque 50 g de chaux sodée sont ajoutés au système d'expérimentation, contrairement aux expériences avec A. flavus (Figure 7).

Figure 10 - Mesure de la croissance radiale de P. expansum avec et sans chaux sodée après 72h d'incubation. 1-MCP = MéthylCycloPropène

La figure 11 présente la concentration moyenne de patuline dans les différentes conditions de culture. On remarque que la production de patuline est augmentée d'un facteur 1,3 pour les petites concentrations de gaz testées (éthylène : 0,1 ppm (369,9 ug/L) et 10 ppm (382,5 ug/L) ; 1-MCP : 0,01 ppm (375,6 ug/L) et 1 ppm (395,7 ug/L)) par rapport à celle du témoin (288,9 ug/L), tandis que les fortes concentrations de ces mêmes gaz ne semblent pas modifier la production de patuline en comparaison à la condition de culture contrôle (témoin bocal). Ces observations sont en adéquation avec les résultats précédemment obtenus par Kepczynski et Kepczynska (1977), qui ont montré que la germination des spores de P. expansum était augmentée lors d'une exposition à faibles doses d'éthylène et diminuée lors d'une exposition à de fortes doses d'éthylène. On peut donc supposer que la diminution de la concentration en patuline observée pour les fortes doses d'éthylène et de 1-MCP est due à une diminution de la germination initiale des spores conduisant à une réduction de la croissance fongique.

Figure 11 - Dosage de la patuline chez P. expansum après 72h d'incubation sans chaux sodée. MCP =
MéthylCycloPropène

De manière similaire aux deux précédents champignons étudiés, les résultats obtenus pour A. parasiticus ne semblent pas montrer d'effet de l'éthylène et du 1-MCP sur sa croissance. En effet, les valeurs mesurées oscillent entre 3,20 cm et 3,27 cm (? = 0,07). Par manque de temps, nous n'avons pas pu expérimenter l'utilisation de la chaux sodée sur ce champignon.

Figure 12 - Mesure de la croissance radiale de A. parasiticus sans chaux sodée après 72h d'incubation. 1-MCP = 1-MéthylCycloPropène

Les figures 13 et 14 représentent la concentration moyenne en aflatoxines (AFB1, B2, G1 et G2) présente dans les différentes conditions testées chez A. parasiticus. De manière surprenante, il semblerait qu'un traitement à l'éthylène ou au 1-MCP favoriserait la production d'aflatoxines sous toutes ses formes. En effet, sauf pour l'AFB1 où chaque condition testée reste très similaire à celle du témoin, on remarque que les aflatoxines B2, G1 et G2 ont vu leur production augmenter d'un facteur allant de 1,3 à 1,5 lors d'un traitement à 0,1 ppm d'éthylène et d'un facteur de 1,5 à 2 lors d'un traitement à 10 ppm de ce même gaz. A l'inverse, bien que la production d'aflatoxines totales reste supérieure à celle du témoin, en présence de 1-MCP la concentration en aflatoxines diminue avec l'augmentation de la teneur en 1-MCP. Cette dernière observation semble logique puisque ce dernier étant un antagoniste compétitif de l'éthylène et si l'éthylène favorise la production d'aflatoxines, alors le 1-MCP aura tendance à diminuer cette production.

Figure 13 - Dosage de l'AFB1 et AFB2 chez A. parasiticus après 72h d'incubation sans chaux sodée. 1-MCP = 1-MéthylCycloPropène

IV. Conclusion - Perspectives

Ce projet étant exploratoire pour les 2 laboratoires de recherche, beaucoup de temps a été passé sur la mise au point des conditions et des paramètres expérimentaux. Tout cela avait pour but de mettre au point un système expérimental adéquat capable de tester l'hypothèse du « Rôle de l'éthylène sur la croissance de champignons filamenteux et sur la production des mycotoxines associées ». Une fois ce système mis au point, les tests faits sur chacun des champignons ont rapidement montré que le CO2 avait un impact critique sur l'action de notre gaz d'intérêt. En effet, il a été observé une augmentation de la production générale de mycotoxines lorsque l'éthylène est appliqué sans éliminer le CO2 naturellement produit par les espèces fongiques. Cependant, cette observation nous a permis de voir que les champignons étudiés réagissent à l'éthylène et donc que ces derniers possèdent certainement des récepteurs à l'éthylène, non-caractérisé à ce jour. Bien que

les premiers résultats ne semblent pas être en faveur de l'utilisation de l'éthylène comme agent de biocontrôle, les derniers résultats obtenus lorsque le CO2 est piégé par la chaux sodée semblent prometteur puisqu'une diminution importante de la production de mycotoxines d'un facteur 2 ou plus est observée.

Dans le but d'obtenir des résultats statistiquement valables, il est nécessaire de poursuivre la suite de ces expérimentations, de manière à prouver la répétabilité et la reproductibilité des premiers résultats recueillis. A partir des résultats obtenus, bien d'autres analyses pourront être faites pour appuyer ou réfuter l'hypothèse émise, comme par exemple une étude du transcriptome pour visualiser les gènes dont l'expression est modifiée par l'application d'éthylène qui mènera ensuite à l'identification des protéines impliquées dans la voie de signalisation de ce gaz chez les champignons filamenteux. Une autre stratégie serait d'acquérir des souches mutantes de ces mêmes gènes afin d'étudier leur phénotype macro- et microscopique lors d'une exposition à l'éthylène.

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VI. Annexes

Annexe 1 - Exemple de GPCR d'Aspergillus flavus

mtmaimdskfdpysqnltfhaadgtpfqvpvmtlndfyqyciqicinygaqfgasviifiilllltrpdkrassv fflnggalllnmgrllchmiyfttdfvkayqyfssdysraptsayansilgvvlttlllvcietslvlqvqvvca nlrrryrtvllcvsilvalipvglrlgymvencktivqtdtplslvwlesatnivitisicffcsifiiklgfai hqrrrlgvrdfgpmkvifvmgcqtltvpallsilqyavsvpelnsnimtlvtislplssiwagvsltrssstens psrgalwnrltdstgtrsnqtsstdtavamtypsnksstvcyadqssvkrqydpeqghgisvehdvsvhscqrl

msapsttpyaqaviipsfsilcmlltipplilhwknrnlpvvslicwllclnlfniinafiwpsddmdnwwngag lcdvevkvmiasyvavpgnllcifrtlasmidtrramlvpskqqrwwnigidmlfcvivpvvaiathivyqasry ilvgisgcvnsfdeswvslilawiwplvicliagyycslvvyrlhryrnqfgdilqasnsnlnksrfmrlfllsf ivllailpvqtyvvyknielslpwhayswrvahgphwnkiqkipsggdaffdrwfpiasgfmlfilfgcgrdasr mygsylrllrldrcfvrtqdsssdasrsntsgfsnsrfgllfhkawtstaetcaenpatansidrssddiekgra sspkpqrgqnmswlkhpwsflhrplhrsstssgerilsrpnlstpsntvsanawagssqsrgssdltympgreaf irvkrdisqeselrk

Mslaqvlsvlasqddegnslarrlaytdagptldidplpsaqrkgliavtvmaflsfiatlvlllfityrlvfwr snyaryigynqyivliynlvladlqqslafliclkwitenkieassaacflqgfwlqigdpgsglfvlaiavhtf ilvalghklshrvfvcgvvgvwlfvailviiplaahgrfvfipsgawcwiseeyepirlwthyiwiflaefgtvc lyaimwfqlrrrikqsailgnsqteslkrlrrvigymiiypvayivlslplaagrmataqgqtpsiaffcvagav itssglvdvllytltrrnlilesepsrdrsynrfassvnrktdhlttitaaegkhtrtdisvlrthrhredddef ghtvregstdnivqpsgmelaplgkvyqhttieithepaypeaessdrsskgsigdgkgpaqsarmwgr

Annexe 2 - Exemple de GPCR d'Aspergillus

Sequence: LSE...DFR length: 384 Prediction parameters: TM-helix length between 17 and 33 > STRONGLY prefered model: N-terminus inside
7	strong transmembrane helices, total score : 11789
#	from to		length	score	orientation
1	19	37	(19)	1764	i-o
2	44	62	(19)	956	o -i	3
84	106	(23)	1741	i-o	4
120	138	(19)	1894	o -i	5
158	180	(23)	2308	i-o	6
311	333	(23)	1862	o -i
7	352	376	(25)	1264	i-o

Annexe 3 - Exemple de GPCR de Penicillium expansum

Basé sur une identité de séquence avec les séquences GPCR retrouvées chez A. flavus
En rouge : D Y P I H C

MAGTSSPTPSFDPYTQNVTFHLGDGTELLVPVQALDVFVMYNVRVCINYGCQFGASFTLLVILLLLTQSD KRRSAVFILNGLALFLNSGRLLFQVIHFSTGFEKVYPYVSGDYSSVPWSAYAISIVAVILTTLVIGCIEA SLVIQVHVVCSTLRRRYRHPLLVVSILVALVPIGFRSAWMVVNCNAIITLNYMSDIWWIESATNICLTIS ICFFCVIFVTKLGFAIKQRRRLGVREFGPMKVILVMGCQTMVVPAIFSIIQYYITVPELASNVVTLVVIS LPLSSIWAGAALEHSRRPGSQDNPHRRNLWRALVGGAESILSPTKDSPTSLSAMTAAQTLCYSDQTISKG SHNSRDTDAFYGIAVEHDISINRVQRNNSIV