IV. Production de l'HA rubéolique
IV.1. Matériel biologique
? Lignée cellulaire BHK21
La lignée cellulaire BHK21 va servir de support pour la
culture en masse et la prolifération du virus de la rubéole afin
de produire l'HA.
Dans ce projet l'ampoule qui contient les cellules BHK21 du
passage 123 du 20/4/1996 congelée dans l'azote liquide.
Les cellules sont maintenues en vie dans l'ampoule qui contient
un milieu de conservation constitué par SVF et le DMSO noté aussi
diméthylsulfoxyde.
Figure 18: Observation
microscopique des cellules BHK21
? Souche virale (virus de la rubéole
M33)
Le virus de la rubéole M33 a été
préparé a partir de la cellule souche VERO (lignée
cellulaire dérivant de rein de singe). La cellule VERO donne un ECP en
un temps court. La multiplication virale dans la culture cellulaire peut
être mesurée par une quantification de l'ECP.
La souche M33 (suspension virale préparée a
partir de la cellule VERO) a été fournie du service de Virologie
Clinique de L'institut Pasteur de Tunis. Cette souche est utilisée lors
de ce projet pour la production et la validation de l'HA rubéolique
grâce à la lignée cellulaire BHK21.
IV.2. Procédé de production de l'HA
rubéolique par la technique de culture cellulaire
Les étapes de la culture cellulaire pour la production
de l'HA du virus de la rubéole sont décrites comme suit:
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IV.2.1. Décongélation des cellules
BHK21
Il faut pratiquer une bonne technique pour obtenir une
proportion élevée de cellules survivantes à cette
procédure.
L'ampoule qui contient les cellules BHK21 a été
retirée de la bouteille d'azote liquide, puis décongelée
au Bain marie à 37°C pendant quelques secondes.
Après la décongélation le contenu de
l'ampoule a été transféré dans une flasque de
culture de 25 cm2 avec ajout de 10 ml du milieu DMEM 10% SVF pour
éliminer l'action du DMSO et pour le réveille cellulaire.
? Cette étape se fait sous la Hotte.
La flasque qui contient les cellules BHK21 est mise dans
l'étuve à 37°C sous 5% de CO2 pour l'incubation.
L'incubation se fait pendant 4 à 5h à 37°C pour que les
cellules adhérent au fond du flasque. Après, l'état des
cellules et leur adhésion au fond du flasque est vérifiée
à l'aide d'un microscope inversé., puis un changement de milieu
DMEM 5% SVF est effectué, et la flasque est ensuite remise à
l'étuve à 37°C.
Figure 19: Décongélation des
cellules BHK21
IV.2.2. Les différents passages lors de la
culture des cellules BHK21
Après 48h d'incubation à 37°C une
deuxième vérification de l'état des cellules est
effectuée par le microscope inversé.
L'ancien milieu DMEM 5% SVF, contenu dans la flasque 25
cm2 est déjà épuisé. Un virage de sa
couleur vers le jaune signifie que le milieu est devenu défavorable pour
les cellules et leur multiplication. Un premier passage de la flasque
25cm2 vers une flasque 75cm2 contenant le milieu DMEM 5%
SVF est alors effectué.
? Le passage cellulaire se fait grâce à la
solution de trypsine (étape de trypsination).
? D'abord il faut éliminer l'ancien milieu DMEM 5% SVF
de la flasque 25cm2. Un rinçage des cellules par la solution
de trypsine est effectué pour décoller les cellules
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de support. Une incubation quelques secondes dans
l'étuve est nécessaire pour que la trypsine effectue son
rôle de dissociation.
? Lorsque les cellules sont bien dispersées un ajout
d'une quantité du milieu DMEM 5% SVF (10ml) pour inhiber l'action de la
trypsine est effectué. La pipette a un rôle important grâce
à son mouvement d'aspiration et de refoulement avec une forte vitesse
pour la dissociation des cellules. Le contenue de la flasque 25cm2
est transféré dans une autre flasque plus grande
(75cm2) et une quantité suffisante du milieu DMEM 5% SVF est
ajoutée pour le bon déroulement de la culture.
Après 48h d'incubation un deuxième passage
cellulaire de la flasque 75cm2 vers la flasque 150cm2 est
nécessaire après une vérification de l'état des
cellules.
Figure 20: Observation microscopique des
cellules BHK21 dans la flasque 150cm2
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Figure 21: Incubation dans l'étuve
à 37°C
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Chaque passage nécessite un temps d'incubation de 48h.
De cette manière tous les passages seront effectués dans les
diverses flasques 25, 75,150 et 225cm2 puis dans les bouteilles
Roller.
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(Les étapes d'élimination du milieu DMEM 5% SVF,
de la trypsination, de la dissociation des cellules et d'ajout du nouveau
milieu de culture dans les flasques puis dans les bouteilles Roller sont les
mêmes dans tous les passages).
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Figure 22: Passage des cellules BHK21
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