Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire bhk21

		REPUBLIQUE TUNISIENNE MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
		Université de Tunis El Manar Institut Pasteur de Tunis Institut Supérieur des Technologies Médicales de Tunis Mémoire De Projet de Fin d'études Pour l'obtention de la LICENCE en Biotechnologies Médicales Option: Génie cellulaire Sujet
		Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire BHK21
		Elaboré par: Encadré par: Ghaith BEN MESSAOUD Pr. Abderrazak MAAROUFI
		Année universitaire 2012-2013
	REPUBLIQUE TUNISIENNE MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université de Tunis El Manar Institut Pasteur de Tunis Institut Supérieur des Technologies Médicales de Tunis Mémoire De Projet de Fin d'études Pour l'obtention de la LICENCE en Biotechnologies Médicales Option: Génie cellulaire Sujet
	Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire BHK21
	Elaboré par: Encadré par: Ghaith BEN MESSAOUD Pr. Abderrazak MAAROUFI
	Année universitaire 2012-2013

DEDICACE

Je dédie ce travail à:
A mes parents
Vous vous êtes dépensés pour moi sans compter. En
reconnaissance de tous les sacrifices consentis pour me
permettre d'atteindre cette étape de ma vie.

A mon frère et à ma soeur

Pour leur affection, compréhension et patience.
Meilleurs voeux de succès dans vos vies et vos études.

A toutes ma famille

Vous avez de près ou de loin contribué à ma formation.
Affectueuse reconnaissance.

Aux membres de l'association tunisienne de lutte contre le
cancer
Pour leur aide précieuse dans mon travail et le savoir qu'ils
m'ont donné.

A mes amis et camarades de l'ISTMT.

Merci...

REMERCIMENTS

Comme préambule à cette mémoire, je souhaite adresser mes
remerciements les plus sincères aux personnes qui m'ont
apporté leur aide et qui ont contribué à l'élaboration de cette
mémoire ainsi qu'à la réussite de cette formidable année
universitaire.
Je tiens à remercier sincèrement Monsieur Hechmi LOUZIR
directeur général de l'Institut Pasteur de Tunis pour m'avoir
offert l'opportunité d'effectuer ce stage au sein de son
institution.

Mon encadreur Mr Abderrazak MAAROUFI responsable du
service d'Immunotechnologie et Réactifs Biologiques, qui s'est
toujours montré à l'écoute et très disponible tout au long de la
réalisation de cette mémoire, sa confiance et tous ses conseils
utiles pour la réalisation de ce modeste travail.

J'adresse mes plus sincères remerciements aux membres de
jury qui ont accepté de juger mon travail.

Mes remerciements s'adressent également à Madame Nejia
BEN ALI pour sa générosité et pour la grande patience dont elle
a su faire preuve malgré ses charges professionnelles.

J'exprime ma gratitude à tous le personnel du service
d'Immunotechnologie et Réactifs Biologiques et en particulier à
Madame Faten MEZNI, Madame Chedia AOUADHI, Madame Raja
REZGUI et Madame Najet HAMMAMI qui ont accepté de répondre
à mes questions avec gentillesse.

Je tiens à remercier le personnel du service de Virologie Clinique
et service de Microbiologie Vétérinaire de L'institut Pasteur de
Tunis pour leurs aides précieuses dans ce travail.
Je tiens à saisir cette occasion pour adresser mes sincères
remerciements et mes profondes reconnaissances à Madame
Halima MAHJOUBI Directrice de l'ISTMT et tous mes
professeurs qui m'ont aidé pendant ces trois ans en particulier
Madame Ines ZIDI et Madame Ahlem DJEBBI

Introduction 1

Partie bibliographique

I. Maladie de la rubéole 2

II. Caractéristiques cliniques 2

III. Infection par le virus de la rubéole . 3

III.1.La rubéole acquise 3

III.2.Réinfection rubéolique 3

III.3.La rubéole congénitale . 3

IV. Virus de la rubéole . 4

IV.1.Historique 4

IV.2. Classification du virus de la rubéole ... 5

IV.3. Morphologie du virus .. 6

IV.4.Type et classification antigénique 6

IV.4.1. Protéines non structurales . 7

IV.4.2. Protéines structurales 7

IV.5.Génome du virus de la rubéole . 8

IV.6.Réplication du virus . 9

V. Réponse immunitaire ... 10

VI. Epidémiologie et prévention .. 11

VI.1.Epidémiologie 11

VI.2.Prévention et vaccination 12

VI.2.1. Prévention 12

VI.2.2. Vaccination 12

VII. Cellule BHK21 et multiplication du virus de la rubéole à l'échelle cellulaire 13

VII.1. Cellule BHK21 13

VII.2. Multiplication du virus de la rubéole a l'échelle cellulaire 13

VIII. Diagnostic 14

VIII.1.Diagnostic direct 15

VIII.1.1.Recherche du virus par isolement en culture de cellules 15

VIII.1.2.Détection du génome viral .. 15

VIII.2.Diagnostic indirect . 17

VIII.2.1.Centrifugation en gradient de saccharose 17

VIII.2.2.Mesure de l'avidité spécifique des IgG .. 17

VIII.2.3.ELISA (Enzyme-Linked-Immuno Sorbent Assay) 17

VIII.2.4.Agglutination sur latex 18

VIII.2.5.Hémolyse radiale (HR) 19

VIII.2.6.Test de neutralisation .. 19

VIII.2.7.Technique de fixation du complément 19

VIII.2.8.Test d'Inhibition d'hémgglutination (IHA) 20

VIII.2.9.Hémagglutination virale . 20

Matériel et méthodes

I. Préparation du local et matériel 21

I.1.Préparation du local 21

I.1.1. Stérilisation de l'atmosphère ... 21

I.2.Préparation du matériel 21

I.2.1. Stérilisation du matériel ... 21

I.3. Contrôle de stérilité du local ... 22

II. Matériel utilisé pour la production et la validation de l'hémagglutinine (HA)

rubéolique . 22
II.1.Appareillage et matériel technique de culture cellulaire et test ELISA indirect

type IgG 22
II.2.Réactifs chimiques et Tampons pour la production et validation de l'HA

rubéolique . 23

III. Milieu pour culture cellulaire . 23

III.1. Milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 23

III.2. Additifs pour milieu DMEM 24

III.2.1.La trypsine . 25

III.2.2.Préparation du milieu de culture par la méthode de stérilisation à froid .. 25

III.3. Contrôle de stérilité du milieu de culture et des additifs . 26

IV. Production de l'HA rubéolique 27

IV.1.Matériel biologique .. 27

IV.2. Procédé de production de l'HA rubéolique par la technique de culture

cellulaire 27

IV.2.1.Décongélation des cellules BHK21 28

IV.2.2.Les différents passages lors de la culture des cellules BHK21 . 28

V. Inoculation du virus M33 30

V.1. Récolte 31

V.2. Extraction de l'HA rubéolique 31

V.3. Titrage de l'HA rubéolique par la technique d'hémagglutination 31

V.3.1. Etape de titrage de l'HA 32

VI. Validation du procédé de production de l'HA rubéolique par le test ELISA

indirect type IgG 33

VI.1. Matériel biologique . 33

VI.2. Principe et étapes du test ELISA . 33

VI.2.1. Principe 33

VI.2.2. Réalisation du test ELISA indirect type IgG 34

Résultats et discussion . 37

Conclusion et perspectives . 43

Références bibliographiques .. 44

Annexes

·	C: Protéine C	·	BHK21: Baby Hamster Kidney
·	E1: Protéine E1	·	RK 13: Rabbit kidney		·
E2: Protéine E2	·	ECP: effet cytopathique
·	HA: Hémagglutinine	·	HR: Hémolyse radiale
·	ARN: acide ribonucléique	·	IHA: Inhibition d'hémagglutination
·	S: coefficient de sédimentation	·	ELISA: Enzyme-Linked-Immuno
			Sorbent Assay
·	DMSO: diméthysulfoxyde	·	PCR: Polymerase Chain Reaction
·	nm: nanomètre	·	RT-PCR: Reverse Transcriptase
			PCR
·	kDa: kilo Dalton	·	Nested PCR: PCR nichée
·	Kb: kilobase	·	DMEM: Dulbecco's Modified Eagle
			Medium
·	IgM: immuglobuline M	·	SVF: Sérum de veau foetal
·	IgG: immuglobuline G	·	ATB: Antibiotique
·	Ig A : immuglobuline A	·	GR: globules rouges
·	HLA: Human leukocyte antigen	·	UHA: unité hémagglutinante
·	Ac: Anticorps	·	OPD: Ortho-Phénylène-Diamine
·	Ag: Antigène	·	LIRB: Laboratoire d'Immunotechnologie et Réactifs
			Biologiques

Figure 1: Symptômes de la rubéole ( www.larousse.fr) 2

Figure 2: Un enfant atteint de rubéole congénitale (Lasek-Duriez et al., 2008) 4

Figure 3: Représentation schématique du virus de la rubéole (Guillet, 2010) 6

Figure 4: Virus de la rubéole au microscope électronique (Bienvenu et al., 2004) 6

Figure 5: Représentation du génome de la rubéole (Bienvenu et al., 2004) 9

Figure 6: Réplication du virus de la rubéole (Bienvenu et al., 2004) 10

Figure 7: Cinétique d'apparition des anticorps lors d'une infection et réinfection

rubéolique ( www.microbe-edu.org) 11
Figure 8: Détection du virion de la rubéole dans les cellules BHK21 (Risco et al.,2003).....

14
Figure 9: Cellules VERO et BHK21 infectées par le virus de la rubéole. (Risco et al.,

2003) 14
Figure 10: Technique de détection de l'infection rubéolique a partir du liquide amniotique

de foetus par PCR et electrophorese RT-PCR(A),Nested PCR(B) (Bienvenu et al.,2004) 16

Figure 11: Contrôle de stérilité 22

Figure 12: Milieu DMEM 23

Figure 13: SVF 24

Figure 14: Antibiotiques 24

Figure 15: Tryptose phosphate 25

Figure 16: Trypsine 25

Figure 17: Contrôle de stérilité du milieu de culture et additifs 26

Figure 18: Observation microscopique des cellules BHK21 27

Figure 19: Décongélation des cellules BHK21 28

Figure 20: Observation microscopique des cellules BHK21 dans la flasque 150cm² 29

Figure 21: Incubation dans l'étuve à 37°C 29

Figure 22: Passage des cellules BHK21 30

Figure 23: Inoculation du virus 30

Figure 24: Lot d'hémagglutinine 31

Figure 25: Titrage de l'hémagglutinine rubéolique 32

Figure 26: Lavage par le Tampon PBS Tween de la plaque ELISA 35

Figure 27: Incubation du sérum des malades 35

Tableau 1: Résultats de titrage de l'HA 37

Tableau 2: Test numéro 1 . 38

Tableau 3: Test numéro 2 . 39

Tableau 4: Test numéro 3 .. 40

Tableau 5: Test numéro 4 . 41

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ISTMT-IPT 2012-2013

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a culture cellulaire s'est considérablement développée tant pour ses aspects fondamentaux que pour ses applications pratiques et cliniques. Cette discipline s'avère aujourd'hui d'une grande utilité dans le domaine de virologie puisqu'elle nous permet d'isoler des virus et contribuer aux diagnostics des maladies virales.

Le virus utilisé au cours de ce projet, est le virus de la rubéole. Ce virus appartient à la famille des Togaviridae. C'est un virus enveloppé, à acide ribonucléique (ARN) de polarité positive.

La transmission de ce virus peut se faire par les gouttelettes nasales expulsées par les personnes infectées lorsqu'elles éternuent ou toussent. L'homme est le seul hôte connu.

Plusieurs techniques de sérodiagnostic de la rubéole nécessitent la présence de l'hémagglutinine (HA) rubéolique, comme:

· Technique d'Inhibition d'hémagglutination (IHA)

· Technique d'agglutination sur latex

· Test ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) ...

Le développement des techniques immunoenzymatiques en particulier la technique ELISA a contribué à améliorer la spécificité et la sensibilité de dépistage des antigènes et des anticorps, en particulier dans le diagnostic de la rubéole.

Pour la femme enceinte, la sérologie rubéolique est demandée d'une manière systématique. Ainsi des milliers d'analyses sérologiques sont réalisées chaque année en Tunisie. Ceci représente une importante consommation des réactifs pour le diagnostic de cette virose.

C'est dans ce cadre que nous nous sommes intéressés à développer une technologie de production de réactifs pour le sérodiagnostic de la rubéole ce qui nous permettra d'éviter le cout élevé d'importation du Kit commercial de diagnostic.

Toute fois, le développement de tels Kit de diagnostic nécessite la préparation de l'antigène d'hémagglutinine rubéolique.

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ISTMT-IPT 2012-2013

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