Chapitre VI: evaluation de Pactivite antioxydante
Les termes antioxydants et radicaux libres sont des termes
populaires utilises par les nutritionnistes et autres professionnels de la
sante. Ces dernieres armees ont vu apparaitre un debordement d'informations sur
le role du stress oxydatif dans le declenchement d'un certain nombre de
maladies graves, telles que certains cancers, les maladies cardiovasculaires et
les maladies degeneratives liees au vieillissement, ainsi que sur le role
therapeutique possible des antioxydants dans ces maladies (Kristiina
Pelli et Marika Lyly, 2003).
1. Les radicaux libres
Les radicaux libres sont des atomes, ou un groupe d'atomes,
avec un nombre impair d'electrons sur la loge exterieure, et ils peuvent se
former quand l'oxygene interagit avec certaines molecules (Kristiina
Pelli et Marika Lyly, 2003).
Les radicaux libres sont des composes caracterises par une
structure electronique desequilibree qui leur confere une grande reactivite sur
les constituants organiques et sur les structures cellulaires. Ils se foment de
fawn inevitable en parallele au metabolisme energetique et par une multitude
d'autres voies. Ils favorisent habituellement le bon fonctionnement de
l'organisme et la sante des mammiferes, mais leur exces peut étre
nefaste. En dehors de toute situation pathologique, leur production est
stimulee par toute situation de stress, en particulier par la manipulation
maladroite ou brutale des animaux, par l'exercice physique, par le froid, par
des niveaux d'alimentation excessifs ou par des desequilibres alimentaires.
Elle peut alors atteindre des niveaux nuisibles pour les aspects quantitatifs
et qualitatifs des productions animales (B. Aurousseau,
2002).
Le metabolisme cellulaire normal de l'oxygene produit de
maniere continue de faibles quantites de derives reactifs de l'oxygene. Le role
physiologique de cette production basale de
Chapitre VI: evaluation de Pactivite
antioxydante
derives reactifs de l'oxygene n'est pas totalement connu, mais
certaines de ces molecules pourraient avoir une fonction dans les processus de
signalisation cellulaire.
Dans certaines situations, cette production augmente
fortement, entrainant un stress oxydatif que l'on definit comme un desequilibre
entre la production et la destruction de ces molecules. En raison de leur
capacite a endommager presque tous les types de molecules dans l'organisme, les
derives reactifs de l'oxygene ont ete impliques dans un tres grand nombre de
pathologies, tant aigues que chroniques (Gutteridge, 1993).
L'appellation " derives reactifs de l'oxygene " n'est pas
restrictive. Elle inclut les radicaux libres de l'oxygene proprement dit
[radical superoxyde (.02:), radical hydroxyl
(
·011), monoxyde d'azote (NO
·), ...],
mais aussi certains derives oxygenes reactifs non radicalaires dont la toxicite
est importante [peroxyde d'hydrogene (11202),
peroxynitrite (ON00-)] (GP. Novelli, 1997)
1.1. Les differents types des radicaux
libres
D' apres Halliwell (Halliwell, 1994), les
mecanismes de l'action d'un antioxydant peuvent comprendre :
- Le piegeage direct des especes reactives d'oxygene (ERO).
- L'inhibition des enzymes et la chelation des traces
metalliques responsables de la production des ERO.
- La protection des systemes de defense antioxydants.
- Le piegeage direct des ERO
L'interaction des flavonokles avec de nombreux radicaux a ete
employee dans plusieurs etudes afin de determiner les elements majeurs de
l'activite antioxydante. A cause de leurs faibles potentiels redox
(Jovanovic, 1994), les flavonokles (Fl-OH) sont thermodynamiquement
capables de reduire les radicaux libres oxydants comme le superoxyde, le
peroxyle, l'alkoxyle et l'hydroxyle par transfert d'hydrogene :
El - ( )H + R 6 H - 0' + RH
Oil R represente l'anion superoxyde, le peroxyle, l'alkoxyle et
l'hydroxyle.
Le radical flavonoxy (FL-0
·) peut reagir
avec un autre radical pour former une structure quinone stable.
quilione
R. RH
OH K... )
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antioxydante
Figure VI. 1. Piegeage des ERO (
·)
par les flavondides.
- L'inhibition des enzymes et la chelation des traces
metalliques responsables de la production des ERO
Les ions du fer (Fe24) et du cuivre
(Cu2#177;) sont essentiels pour certaines fonctions physiologiques.
Its peuvent étre, soit des constituants des hemoproteines, soit des
cofacteurs des differentes enzymes du systeme de defense antioxydant (par
exemple, Fe pour la catalase, et Cu et Zn pour la superoxyde dismutase). Mais
ils sont aussi responsables de la production du radical hydroxyle par la
reduction du peroxyde d'hydrogene selon la reaction suivante:
H2O. +Fe2+ (Cu+) '0H + -OH +
Fe3+ (Cti2+)
Les flavonokles sont consideres comme de bons chelateurs de ces
ions metalliques.
L'activite antioxydante des flavonokles est assuree grace a sa
structure active qu'elle est represent& dans la figure VI. 2. :
HO
Figure VI. 2. Elements essentiels pour
l'activite antioxydante des flavonokles
(Abdelghafour
MARFAK, 2003).
2. L'activite antioxydante et les
antioxydants
2.1. L'activite antioxydante
Les mecanismes de defense anti-oxydante du corps humain
peuvent étre divises en deux categories differentes. Premierement, un
certain nombre d'enzymes sont synthetisees a partir des proteins et d'autres
nutriments et constituants de l'organisme. Le second groupe d'antioxydants doit
étre obtenu a partir de l'alimentation, puisque ces derniers ne peuvent
étre synthetises par l'étre humain. Its comprennent les
nutriments et les metabolites vegetaux mentionnes plus haut : les vitamins E et
C, les carotenokles, le selenium, les folates, les flavonokles, les
phytoestrogenes et les glucosinolates (Kristiina Pelli et Marika
Lyly, 2003). 2.2. Les antioxydants
Les antioxydants sont des molecules capables d'interagir sans
danger avec les radicaux libres et de mettre fin a la reaction en chain avant
que les molecules vitales ne soient endommagees. Chaque molecule antioxydante
ne peut reagir qu'avec un seul radical libre, et par consequent, it faut
constamment refaire le plein de ressources anti-oxydantes.
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antioxydante
2.2.1. Les antioxydants synthetiques
Its sont utilises pour empécher les aliments gras de
rancir et pour proteger les vitamines liposolubles (A, D, E et K) contre
l'oxydation. Les esters d'acides galliques, le butylhydroxytoluene et le
butylhydroxyanisol, appartiennent a cette categorie. Les vitamines C et E ont
egalement des proprietes antioxydantes et ont l'avantage d'augmenter la valeur
nutritive des aliments. Des recherches ont montre que les antioxydants
synthetiques employes par l'industrie alimentaire sont egalement benefiques
pour l'organisme (Microsoft Encarta, 2007)
Les antioxydants synthetiques sont generalement prepares en
laboratoire, et principalement a partir de composants chimiques. Dans
l'industrie alimentaire, l'ajout d'antioxydants naturels dans les aliments est
une technique completement nouvelle. Depuis a peu pres 1980, les antioxydants
naturels sont apparus comme alternative aux antioxydants synthetiques, et ils
sont aujourd'hui generalement preferes par les consommateurs. Toutefois, le
fait de trouver communement une substance dans un aliment ne constitue pas une
garantie de son absence totale de toxicite. Les antioxydants synthetiques ont
ete testes quant a leurs effets carcinogens ou mutagenes, mais de nombreux
constituants naturels des aliments n'ont pas encore ete testes
(Kristiina Pelli et Marika Lyly, 2003).
2.2.2. Les antioxydants naturels
Parmi les antioxydants naturels on trouve l'acide ascorbique
(Vitamine C), les tocopherols (Vitamine E) et les composes phenoliques exemple
les flavonoIdes.
3. Test de DPPH
3.1. Principe de la methode
Le DPPH ou 1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyle agit en tant qu'un
radical libre stable efficace reduit par un antioxydant, montrant un spectre
d'absorption a 517 nm avec une couleur violette, la reduction de ce radical
nous donne la coloration jaune (Dong-Sun Lee et al,
2001).
La reaction de la reduction de DPPH. Avec les
composes phenoliques est montre ci-dessous :
0
0
Figure VI. 3 : La reaction entre le DPPH et
l'hydroquinone (Masahiro Nishizawa et al, 2005).
3.2. Procedure experimentale
On prend 1 ml de la solution de DPPH dissout dans le methanol de
concentration 250 1.1A4 avec 1 ml de l'extrait phenolique de concentrations
croissantes, apres une incubation pendant
30 minutes on effectue la lecture dans le spectrophotometre a
517 pourcentage d'inhibition suivant cette relation :
I% = (1 --
(Aextrait
ADPPH temoin)) *100
|
nm, on calcule le
|
|
3.3. Resuftats et discussion
Les resultats obtenus nous permet de tracer les graphes
figurant la variation du pourcentage d'inhibition en fonction de la
concentration de l'extrait phenolique I% = f (C), les graphes sont representes
dans la figure VI. 4.
E 70
E 60
50 40 30 20 10
PI (%) 100 -80 -60 -40 -20 -
Foulia
y= 3,8593x
R2 = 0,9818
y = 5,0395x
R2 = 0,973
Gondale
0
|
|
|
|
0
|
|
|
|
|
|
5
|
10
|
15
|
20 C (pM)
|
|
10
|
15
|
20
|
|
C (pM)
Lelma
Remth
y = 6,1801x
y = 5,5069x
-8. 100
E 80
60 40 20
R2 = 0,9695
R2 = 0,9669
C
80 60 40 20
0
0
5 10 15 20
C (1M)
2 4 6 8 10 12 14
C (pM)
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antioxydante
E 100
r.
80 60 40 20 0
Reguig y = 8,5847x
il 120
-
a 100
-
80 -60 -40 -20 -
R2 = 0,9487
0
2 4 6 8 10 12 14
C (OA)
Serr y = 7,4359x
R2 = 0,9912
,
2 4 6 8 10 12 14
C (pM)
Zwadet El khrouf
E 50 r. 40
30 20 10 0
y = 3,2364x R2 = 0,9945
·
2 4 6 8 10 12 14
C (pM)
Figure VI. 4. Les graphes PI =f (C) de chaque
plante.
Puisque la valeur d'EC50 presente la concentration
d'inhibiteur necessaire pour balayer 50 %
des radicaux libres et qui est
inversement proportionnelle a l'activite antioxydante, nous avons
determine
les valeurs des EC50 de chaque extrait phenolique a partir des
representations
graphiques I % = f (I). Les resultats sont groupes dans le
tableau VI. 1 et presentes dans
l'histogramme (figure VI. 5).
Tableau VI. 1. Les EC50 de chaque
plante.
|
|
Plante
|
EC 50 (mg/ml)
|
Foulia
|
12,95
|
Gondale
|
9,92
|
Lelma
|
9,1
|
Remth
|
8,1
|
Reguig
|
5,8
|
Serr
|
6,7
|
Zwadet
|
15,4
|
|
EC50
(mg/m1)16
14- 12- 10- 8 - 6- 4 - 2 -
0 MI , Plantes
640 ,z--
ks>,
oP ,z--
,z, *
· ,z, ,
,i, 4,1, , c.0
00 i. ,,i,
be
1
Figure VI. 5. Classement croissant des
plantes selon leur EC50.
Si on compare les valeurs de EC50 des sept
extraits, on peut dire que l'extrait "Reguig" est le plus puissant antioxydant,
alors que l'extrait phenolique "Zwadet Elkhrouf' est l'antioxydant le plus
faible. Nous n'avons pas trouve une correlation entre le pouvoir antioxydant
EC50 et la teneur en phenols totaux et flavonoIdes. Ce resultat peut
étre explique que les extraits etudies renferment des composes
phenoliques de structures chimiques differentes et que ractivite antioxydante
etudiee par ce test ne depend pas obligatoirement de la concentration des
composes phenoliques. L'idee de revaluation de ractivite antioxydante est dans
le but de trouver une correlation de ractivite antioxydante et le pouvoir
inhibiteur des enzymes. Les tentatives essayees n'ont pas conduit a un resultat
significatif et ceci montre q'un extrait inhibiteur d'enzyme ne soit forcement
pas un antioxydant puissant.
Chapitre VI: evaluation de Pactivite
antioxydante
4. Conclusion
Les radicaux libres sont des molecules instables produites en
permanence par le corps humain suivant des reactions biochimiques, par exemple
la production de l'energie a partir des aliments et de l'oxygene, ils peuvent
s'associer a d'autres molecules et entrer en reaction comme ils peuvent
endommager ou detruire les parois des cellules. De cette oxydation provient
l'alteration de l'ADN et le vieillissement cellulaire qui est a la base de
certaines maladies comme l'atherosclerose et le cancer.
L'organisme pour se defendre possede des agents neutralisant
les radicaux libres qui sont les enzymes tel que la super-oxyde dismutase et
les vitamines "anti-oxydantes" C, E, A, les bioflavonoIdes, les vitamines du
groupe P comme les pigments vegetaux qui ont un effet protecteur "le
béta-carotene".
A travers cette etude, on peut dire que les plantes etudiees
possedent des pouvoirs antiradicalaires importants.
Chapitre VI: evaluation de Pactivite
antioxydante
Bibliographie
· Abdelghafour Marfak, le 12 Decembre
2003, Radiolyse gamma des flavonokles. etude de leur reactivite avec les
radicaux issus des alcools : formation de depsides, p 30-34 (these de
doctorat), l'Universite de Limoges, Ecole Doctorale Sciences Biologie Sante,
Faculte de Pharmacie.
· B. Aurousseau, 2002, les radicaux
libres dans l'organisme des animaux d'elevage : consequences sur la
reproduction, la physiologie et la qualite de leurs produits, INRA Prod.
anim.
· Dong-Sun LEE, Nam-Soon KIM and Sang-Han LEE,
2001, 2, 2-Dipheny1-1- picrylhydrazyl Hydrate, a Stable Free Radical,
Is an a-Glucosidase Inhibitor, J Biological & pharmaceutical bulletin,
Volume 24, No 6, pp 727-728.
· JM Gutteridge, 1993, Free radicals in
disease processes: a compilation of cause and consequence. J Free Radical
Res Commun, Volumel9, pp 141-158.
· ICristiina Pelli et Marika Lyly, janvier
2003, les antioxydants dans l'alimentation, Biotechnology Finlande.
· Masahiro Nishizawa, Masahiro Kohno, Minemitsu
Nishimura, Akio Kitagawa, and Yoshimi Niwano, 2005, Non-reductive
Scavenging of 1, 1-Dipheny1-2- picrylhydrazyl (DPPH) by Peroxyradical: A Useful
Method for Quantitative Analysis of Peroxyradical, J Chemical and
pharmaceutical bulletin, Volume 53, No 6, pp 714716.
· Novelli GP, 1997, Role of free radicals
in septic shock. J Physiol Pharmacol, Volume 48, pp 517-527.
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