Effets des extraits de quelques plantes médicinales locales sur les enzymes alpha amylase, trypsine et lipase

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 2. Ttypsine
1. Principe de la methode

Dans cette partie du travail, on s'interesse a l'evaluation de l'effet des composes phenoliques des extraits (des plantes investiguees) sur l'activite enzymatique de la trypsine pancreatique bovine.

Cette enzyme hydrolyse le Na- Benzoyle- DL- Arginine -p- Nitroaniline (BAPNA) en produit principal le Na- Benzoyle- DL- Arginine incolore et le -p- Nitroaniline qui est de couleur jaune detectable en visible suivant cette reaction (figure V. 2. 1):

	H 0 H

H-,INT NH₂

	0 ^NO	BAPNA Tiypsine
			^1-^12^N
^N.,NH

-p- Nitroaniline

H₂N NTT₎ (405 nm)

Na- Benzoyle- DL- Arginine

Figure V. 2. 1. L'action de la trypsine sur le BAPNA (Anonyme, 2004). 2. Procedure experimentale

L'analyse des inhibiteurs de la trypsine est effectuee par la mesure de la vitesse de la reaction enzymatique dans le mode cinetique (kinetic) dans le spectrophotometre Shimadzu 1601. Le milieu reactionnel (3 ml) contient 200 1.t1 de la trypsine (0,16 mg/ml) dans 1,6 ml de tampon tris (trishydroxymethylaminomethane) C₄1-1₁₁110₃ de concentration molaire 50 mM avec le chlorure de calcium CaC1₂ de concentration molaire 10 mM et de pH= 8,2. La cinetique enzymatique (t = 300 secondes) debute apres l'addition de 1 ml de substrat (a differentes concentrations) ; le blanc est depourvu de l'enzyme et les inhibiteurs.

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 2. Ttypsine L'activite inhibitrice des polyphenols est mesuree de la méme fawn en introduisant 200 IA de differentes concentrations des extraits phenoliques.

3. Resultats et discussion

A l'aide des mesures spectrophotometriques realisees sur l'activite enzymatique de la trypsine et comparativement a la representation de Michaelis-Menten, on apercoit que cet enzyme presente une cinetique michaelienne (figure V. 2. 2).

V (AA/s)

0,03

0,025 -

0,02 -

0,015 -

0,01

0,005 -

0 0,5 1 1,5 2

S(mM)

Figure V. 2. 2. La cinetique enzymatique de la trypsine.

Les differentes parametres cinetiques de l'enzyme (V., K_M) sont determines selon l'equation en double inverse de Lineweaver Burk [1/ V = f (1/ S)] (figure V. 2. 3).

1/V (s/AA)

90

1/K

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

1/S (1/mM)

Figure V. 2.3. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne trypsine.

A partir de la representation de Lineweaver-Burk de la trypsine, la vitesse maximale V. est de 0.0769 AA/s et la constante de Michaelis K_M est de 2 mM.

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 2. Ttypsine Parmi les sept plantes etudiees, on trouve uniquement que l'extrait "Foulia" qui possêde un pouvoir inhibiteur vis-a-vis de la trypsine (Figure. V. 2. 4). Le type d'inhibition dans ce cas est non competitif avec une constante d'inhibition K_i de l'ordre de 16 gM.

-30 -20 -10 0 10 20 ₃₀ ^I (P^M)

Figure V. 2. 4. Representation graphique 1/V = f ([polyphenols]) de Foulia tel que ([S₁] < [S₂] < [S3] < [S4] < [^S5])^.

Nous avons essaye de determiner le pourcentage d'inhibition de tous les autres extraits y compris l'extrait "Foulia", pour ce faire nous avons fixe la concentration des inhibiteurs et nous avons calcule le taux d'inhibition suivant la methode de Qiang II et al (Qiang .H et al, 2006). Les resultats obtenus sont regroupes dans le tableau V.2.1 et representes dans l'histogramme (figure V. 2.5).

Tableau V. 2.1. Le pourcentage d'inhibition de chaque plante.

Plante	Pourcentage d'inhibition Substrat
Foulia	20,04
Gondale	5,44
Lelma	16,83
Remth	22,03
Reguig	21,78
Serr	21,78
Zwadet Elkhrouf	15,10

o

% 30 d'inhibition

20- °

d

^--7

plantes

^10-
·S^IS)

Figure V. 2. 5. Le taux d'inhibition de la trypsine avec une concentration fixe de substrat et d'inhibiteur.

On remarque que les valeurs du pourcentage d'inhibition varient de 5,44 % pour l'extrait "Gondale" a 22.03 % pour l'extrait "Remth", les valeurs trouvees prouvent que le taux d'inhibition est independant de la concentrations des phenols, on peut conclure que l'inhibition enzymatique depend du type des composes phenoliques (relation structure -- activite).

4. Conclusion

Les inhibiteurs de la trypsine sont diversifies et generalement synthetiques utilises comme medicament contre plusieurs maladies par exemple la pancreatite, mais toujours on cherche des extraits naturels des plantes qui peuvent etre des inhibiteurs de cette enzyme, beaucoup des plantes medicinales sont connus dans ce domain ; nos plantes sont des plantes sahariennes qui contient des principes actifs connus par leur pouvoir d'inhiber les enzymes et notamment les composes a structure phenolique.

Parmi les sept plantes seulement une seule plante qui a le pouvoir inhibiteur de l'enzyme sachant que les sept plantes ont subit les mémes procedures experimentales ce qui explique que l'inhibiteur est specifique capable de bloquer le site actif de l'enzyme.

L'inhibition enzymatique de la trypsine depend de differentes parametres tel que : La concentration de substrat.

Le type d'inhibiteur et la nature de sa structure chimique (sa relation avec le site catalytique).

La concentration de l'inhibiteur.