B. Programmation du thermocycleur
Les réactions d'amplification sont réalisées
à l'aide d'un thermocycleur : Applied Biosystems Gene
Amp, PCR système TC-3000. Cette réaction est
cyclique, et elle se fait en trois étapes :
> Dénaturation : consiste à
chauffer avec une température élevée pour séparer
l'ADN à double
brin en brisant les liaisons hydrogènes ;
> Hybridation : une fois l'ADN
séparé, on refroidit rapidement pour que les amorces se fixent
à
chaque extrémité complémentaire de l'ADN
à simple brin ;
> La polymérisation ou élongation
: Après la fixation des amorces, l'ajout de la Taq
polymérase
et de nucléotide permet la synthèse des nouveaux
brins d'ADN.
Les différentes étapes sont reprises ci-dessous:
> 95°C pendant 10 min ;
> 35 cycles de :
? 95°C pendant 45 s ;
? 53°C pendant 45 s ;
? 72°C pendant 1 min ;
> 72°C pendant 10 min.
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Matériel et Méthodes
2.10.4. Electrophorèse sur Gel d'agarose (Sambrook
et Russel, 2001)
A. Principe
L'électrophorèse sur gel d'agarose est la
méthode de choix pour la séparation, la purification et
l'identification des fragments d'ADN et d'ARN. Sous l'influence d'un courant
électrique, les acides nucléiques chargés
négativement se déplacent à travers le gel d'agarose vers
la borne positive (l'anode). Les molécules seront séparées
dans le gel dû au fait qu'elles ne migrent pas toutes à la
même vitesse.
B. Technique
1) Préparation du gel d'agarose
> Pour un gel de 1%, dissoudre par chauffage jusqu'à
ébullition, 1g d'agarose (Sigma) dans 100 ml
de tampon TAE 0.5 X (Annexe 054) ;
> Refroidir la solution à 55°C dans un bain marie,
puis ajouter du BET (Bromure d'éthidium)
(chaque 5 ul du BET dans 100 ml de TAE) qui va se fixer sur l'ADN
(cette molécule s'intercale
entre les bases de la molécule d'ADN) et va permettre la
visualisation des bandes d'ADN dans le
gel sur la table UV du transilluminateur;
> déposer le gel dans un moule dont les 2
extrémités ont été préalablement
fermées par du ruban
adhésif;
> Déposer un peigne dans le gel afin de réaliser
des puits;
> Laisser solidifier;
> Retirer le peigne du gel et le ruban adhésif du
moule;
> Placer le moule avec le gel dans la cuve
d'électrophorèse;
> Ajouter un volume de tampon TAE 0.5 X dans la cuve
préalablement remplie jusqu'à ce que le
gel soit immergé (environ 1 mm au-dessus).
2) Ensemencement
> Répartir sur un morceau de Parafilm des gouttes de
tampon de charge (Bleu de Bromo-phénol)
qui assure le maintien du dépôt en immersion dans le
puit et permet la visualisation de la
migration;
> Mélanger à l'aide d'une micropipette, 10 ul de
chaque échantillon avec le tampon de charge;
> Transférer les 5 ul des mélanges dans les
puits du gel;
> Deux puits sont réservés au témoin
positif et au témoin négatif et un puit au marqueur de poids
moléculaire;
> Déposer les échantillons dans les autres
puits.
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Matériel et Méthodes
3) Migration
> Fermer la cuve et brancher l'alimentation de la cuve de
manière à ce que les dépôts soient de
côté cathode (-);
> Appliquer un voltage de 100 volts pendant 30 min;
> Couper l'alimentation quand le colorant a parcouru la
distance requise ou laisser la migration
arriver jusqu'à 1 cm du bord de la cuve (cette ligne est
appelée le front de migration);
> Débrancher le générateur de la cuve.
4) Lecture (Visualisation par
Transilluminateur)
> La visualisation des bandes d'ADN du gel se fait sur la
table UV du transilluminateur dans une
chambre noire;
> En fonction de la taille des fragments d'ADN
étudiés, on repèrera la bande et sa taille
respectivement par rapport au témoin positif et au
marqueur de PM.
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