Memoire Online - Caractérisation génomique des bactériophages isolés en Côte d’Ivoire.

Présenté pour l'obtention du Diplôme de Master de
Biotechnologies-Biosécurité-Bioressources de
l'Université Félix HOUPHOUET- BOIGNY

M. AHONZO Niamke L. S...Professeur Titulaire...UFHB Président du Jury M. DJAMAN A. Joseph....Professeur Titulaire...UFHB Superviseur

Madame KAKOU N. Solange...Maître de Recherches.... IPCI Directeur Scientifique

Dédicaces

Je dédie ce travail à :
Ma mère,
Autant de phrases aussi expressions soient-elles ne sauraient montrer le degré d'amour et
d'affection que j'éprouve pour toi. Tu m'as comblé avec ta tendresse et d'affection tout le long
de mon parcours. Tu n'as cessé de me soutenir et de m'encourager durant toutes les années de
mes études, tu as toujours été présent à mes côtés pour me consoler quand il fallait. En ce jours
mémorable, pour moi ainsi que pour toi, reçoit ce travail en signe de ma vive reconnaissance et
mon profond estime. Puisse le DIEU TOUT PUISSANT te donne santé, bonheur et longue vie
afin que je puisse te comble à mon tour.
Mon épouse,
Ton encouragement et ton soutien étaient la bouffée d'oxygène qui me ressourçait dans les
moments pénibles, de solidarité et de souffrance. Merci d'être toujours à mes côtés, par ta
présence, par ton amour dévoué et ta tendresse, par te donner du goût et du sens à notre famille.
En témoignage de mon amour, de mon admiration et de ma grande affection, je te prie de trouver
dans ce travail l'expression de mon estime et mon sincère attachement. Je prie DIEU le TOUT
PUISSANT qu'il te donne bonheur et prospérité.

Remerciements

Je remercie tout d'abord, le Bon DIEU Tout Puissant, de m'avoir donné la force d'accomplir ce travail.

Je remercie Pr DOSSO M., Directrice de l'Institut Pasteur de Côte d'ivoire qui a servi de cadre à

Un immense merci à Pr DJAMAN Allico Joseph, Professeur Titulaire à l'Université Félix Houphouët Boigny, Directeur du laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique et Chef de Département de Biochimie à l'Institut Pasteur de Côte d'Ivoire, qui est le directeur de ce mémoire, et qui s'y est impliquée de manière considérable. Merci d'avoir fait plus que ton travail de directeur.

Je tiens à exprimer mes remerciements et ma reconnaissance à Dr KAKOU NGAZOA E. Solange, codirectrice de ce mémoire, responsable de la Plateforme de Biologie Moléculaire à l'Institut Pasteur de Côte d'Ivoire, pour tout le temps qu'elle a consacré à la réalisation de ce projet, pour ses encouragements, son support, ses conseils, sa patience, sa gentillesse, et son esprit responsable, critique et rigoureux.et son aide précieuse tout au long de ce mémoire.

Mes vifs remerciements à tout le personnel de la Plateforme de Biologie Moléculaire de l'Institut Pasteur de Côte d'Ivoire, particulièrement à Monsieur Yavo Albert Konan, Madame Zogba née Sangaré Flany et Madame Mambé née Ani Perpétu pour tout leur soutien et tous les bons conseils.

Je ne peux oublier M^lle ADDABLAH Ameyo Yayra Audrey dont l'ardeur au travail et sa sympathie ont créé des conditions tout à fait propices pour une bonne productivité scientifique, mais aussi pour l'intérêt qu'elle a accordé à ce travail.

Je remercie Pr Sylvain Moineau de l'Université de Laval, sans lequel le Projet Phage n'aurait pas abouti. Merci pour les souches de références.

Merci aux enseignants et chercheurs du laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique de l'Université Félix Houphouët Boigny.

Je tiens à remercier Messieurs et Mesdames, membres de jury d'avoir acceptés de juger ce travail de mémoire de Master 2. Je vous remercie vivement d'avoir accepté d'examiner ce travail et de faire partie de ce jury.

Enfin, je tiens à exprimer toute notre gratitude à tous ceux qui nous ont aidé de près ou de loin à

TABLE DES MATIÈRES

1.4.1. Cycle lytique « phages virulents »

1.4.3. Cycle chronique « phages filamenteux »

3.1. Rôle des bactériophages dans le transfert des gènes (phage lysogénique)

4.1. Cas du bactériophage T4

2.1. Concentration des bactériophages

2.3. Dosage fluorimétrique

2.4. Digestion enzymatique

2.5. Electrophorèse sur gel d'agarose

2.6. Electrophorèse en champ pulsé

2.7. Analyse des profils de restriction

1.1. Analyse du profil génomique des phages par les endonucléases sur gel d'agarose

LISTE DES ABRÉVIATIONS

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Schéma illustrant la morphologie et les différentes protéines structurales (Effantin, 2005): . 5

Figure 2 : Schéma des cycles d'infection phagique (lytique et lysogénique) (García et al., 2010). 8

Figure. 5 : Carte génétique du génome du bactériophage T4 (Miller et al., 2003). 19

Figure 8 : Électrophorèse en champ pulsé de bactériophage digéré par l'enzyme de restriction XbaI 38

Figure 9 : Dendrogramme généré par le logiciel Bionumerics® avec l'enzyme XbaI. 38

Figure 10: Électrophorèse en champ pulsé des génomes de bactériophages après digestion par XhoI.40

Figure 11 : Dendrogramme généré par le logiciel Bionumerics® avec l'enzyme XhoI. 40

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Différents gènes fonctionnels en fonction des couleurs (Miller et al., 2003). 20

Tableau VIII : Mélange réactionnel de la pré-digestion enzyamtique du PFGE 33

Introduction

Les bactériophages ou phages sont des virus qui infectent les bactéries. Ces parasites intracellulaires obligatoires et absolus ont été découverts par Frederick W. Twort et Felix d'Hérelle en 1915 et 1917 respectivement. Le terme bactériophage a été inventé par d'Hérelle qui signifie étymologiquement « mangeur de bactéries ».

On les trouve partout ou l'on trouve des bactéries (sol, mer, désert et eaux d'égouts) et ils sont visibles uniquement en microscope électronique. Ils sont omniprésents dans la biosphère et constituent l'entité biologique la plus nombreuse de la planète (Williamson et al,. 2005 ; Dublanchet et Patey, 2011). Les bactériophages constituent un modèle biologique fascinant en écologie et en évolution. (Ceyssens et al., 2011) L'évolution des phages, entraînée par la résistance des hôtes bactériens, peut affecter plusieurs gènes, et ceci est reflété par la grande diversité génomique à l'intérieur des espèces de phages (Brussow et al., 2004). Les virus constituent un immense réservoir de diversité génétique fréquemment révélé par la découverte de nouveaux gènes en particulier dans les génomes de phages nouvellement séquencés (Suttle, 2005 ; Essoh et al., 2013). Les données métagénomiques de l'environnement humain montrent que la plus grande partie de la diversité virale reste non caractérisée (Breitbart et al., 2003).

L'utilisation de l'antibiothérapie a fait surgir au cours des dernières décennies le phénomène qu'est la résistance des bactéries aux antibiotiques ( BMR : Bactéries Multi-Résistantes). L'origine de cette multi-résistance est due à la pression sélective exercée par l'utilisation abusive des antibiotiques ainsi qu'à l'accumulation de mécanismes de défense par la bactérie (résistance naturelle, mutation de gènes, transfert génétique, etc.) (Vallot , 2015).

Selon un rapport de l'OMS, 60% des infections nosocomiales sont causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques (Rosner et al., 2004). Face à l'évolution inexorable des infections nosocomiales à bactéries multi-résistantes (Carminati et al., 2016), des infections entériques (Lappe et al., 2009), et des infestions respiratoires (Hsu et al., 2013), l'absence de nouvelles molécules antibiotiques efficaces, ainsi que la montée en gravité des maladies émergentes, l'une des alternatives pour faire face à ce problème est un retour à la phagothérapie (Carminati et al., 2016).

La phagothérapie est l'utilisation de bactériophages lytiques afin de traiter un grand nombre de maladies infectieuses d'origine bactérienne, en particulier les infections multi-résistantes, peu effet secondaire (Dublanchet, 2009). Cette thérapie des infections humaines est pratiquée en Europe de l'Est en particulier en Géorgie et en Pologne (Ackermann, 2004).

Introduction

L'utilisation des phages comme thérapie nécessite plusieurs étapes de caractérisation biologique et génomique . Après l'isolement et la purification des phages, le matériel génétique est extrait afin de réaliser le typage moléculaire par l'utilisation des enzymes de restrictions dans le but de vérifier le type de matériel génétique, la technique d'électrophorèse en champs pulsé (PFGE en anglais) pour voir le profil génomique, la PCR et le séquencage pour étudier les gènes par comparaison avec d'autres séquences d'ADN , le séquencage du génome complet par la technique la technique de Next Generation Sequencing (NGS), etc.

En Côte d'Ivoire, la phagothérapie n'est pas utilisée comme thérapie et reste méconnue par le corps médical professionnel (Ehui et al., 2017). Plusieurs études récentes ont mis en évidence l'isolement de phages lytiques à potentiel thérapeutique en Côte d'Ivoire (Essoh et al., 2015 ; Ngazoa-Kakou et al., 2017) mais aucune application n'a été explorée. Vue l'émergence des bactéries et bactéries multi-resistantes dans l'environnement (Baguy, 2014), la sélection et la caractérisation de phages candidats potentiels en faveur de la phagothérapie et la mise en place des biocollections de phages lytiques en Cote d'Ivoire devient une nécessité et une urgence scientifique.

Aujourd'hui, grâce à la biologie moléculaire et au séquençage du génome viral, on peut rapidement éliminer les phages contenant des séquences génomiques potentiellement dangereuses (gènes de toxines, gènes de virulence, gène de résistance aux antibiotiques etc.) (Gorski et al., 2009).

Déterminer le profil génomique de quelques phages isolées en Côte d'Ivoire, et comme objectifs spécifiques de :

? Déterminer le type de matériel génétique après digestion enzymatique suivie d'une électrophorèse,

? Estimer la taille du génome par analyse du profil génomique via la technique de l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE).

Revue bibliographique

1. Bactériophages

1.1. Définition

Les bactériophages, communément appelés phages sont des parasites obligatoires n'ayant aucune activité biochimique à l'extérieur d'une cellule et n'infectent que les bactéries (Ackermann et DuBow, 1987 ; Kutter et Sulakvelidze, 2005). Ils sont généralement spécifiques à une espèce bactérienne voire à juste certains individus de cette espèce. Mais, plusieurs bactériophages peuvent être spécifiques d'une même bactérie (Sulakvelidze, 2011).

Bien que parasites obligatoires, constitués d'un acide nucléique (ADN ou ARN) et de protéines, comme tous les virus, ce ne sont pas des êtres vivants au sens strict, mais des entités biologiques (Drouji, 2009).

1.2.Historique

L'histoire des phages a 100 ans. Aujourd'hui, il est admis que la découverte du bactériophage appartient conjointement à deux microbiologistes :

Frederick William Twort : bactériologiste anglais qui a la propriété de la description du principe lytique sur des colonies de Micrococcus, en 1915, il est donc indubitable qu'il avait fait une interprétation imprécise et, surtout, n'avait pas poursuivi ses recherches et encore moins envisagé une utilisation thérapeutique. Il n'est donc pas contestable que le mérite de la phagothérapie appartient à Félix d'Hérelle (D'Hérelle, 1926).

Félix d'Hérelle : biologiste canadien d'origine française, qui a présenté très tôt le rapport entre un phénomène observé au laboratoire et le phénomène de la guérison clinique en 1917. Pour lui, l'apparition de plages claires, observée dans les boîtes de Pétri sur lesquelles cultivaient les bactéries responsables de dysenterie bacillaire, semblait annoncer la guérison. En effet, dès 1918, d'Hérelle après avoir constaté que « la pathogénie et la pathologie de la dysenterie bacillaire sont dominées par deux facteurs agissant en sens contraire : le bacille dysentérique, agent pathogène et le microbe filtrant bactériophage, agent d'immunité », affirma que c'est « logique de proposer comme traitement de la dysenterie bacillaire l'administration, dès l'apparition des premiers symptômes, de cultures actives du microbe bactériophage » (D'Hérelle, 1919).

Par ailleurs, l'étude des phages a contribué à la naissance de la biologie moléculaire et fourni des indications fondamentales sur le mode de réplication et la morphogenèse des virus. Les phages ont également contribué à la compréhension de certaines épidémies et des maladies infectieuses. Ils sont par ailleurs responsables de fermentations défectueuses dans l'industrie laitière, et sont utilisés dans le

diagnostic (Singh et Arutyunov, 2012) et dans le biocontrôle. Actuellement, beaucoup de recherches sont orientées sur la génomique des phages, l'évolution, l'écologie et la découverte de nouveaux phages à des fins thérapeutiques.

A ce jour, plusieurs milliers (environ 6000) de phages ont été décrits mais on estime que seulement 10% d'entre eux ont été découverts (Ackermann, 2009).

La tête du bactériophage a généralement une structure icosaédrique qui est constituée par un noyau très compact d'acide nucléique, entouré d'un enduit protéinique ou capside. La capside est uniquement constituée de protéines dont l'ensemble forme une enveloppe qui protège le génome viral (ADN ou ARN, en simple ou en double brin) (Figure 1).

La capside est amorcée par un connecteur qui est un complexe multiprotéique situé à l'un des sommets de la capside, le connecteur est à la fois en interaction avec elle, mais aussi avec l'ADN et les éventuelles protéines internes ainsi qu'avec la queue du phage (Lurz et al, 2001). Le connecteur est l'élément central de la machinerie servant à l'incorporation de l'ADN viral dans la capside lors de la réplication des phages dans la bactérie. Et c'est aussi en passant par le connecteur puis la queue que l'ADN viral est injecté dans le cytoplasme de la bactérie (Ponchon et al, 2005) (Figure 1).

La queue est un complexe multiprotéique assemblé indépendamment de la capside et du connecteur. L'ancrage de la queue sur la capside au niveau du connecteur termine le cycle d'assemblage des bactériophages. La queue des phages est impliquée dans la reconnaissance et l'attachement aux bactéries hôtes, dans le transpercement des membranes bactériennes ainsi que dans le transfert de l'ADN viral de la capside dans le cytoplasme (Ackermann, 2003).

Figure 1 : Schéma illustrant la morphologie et les différentes protéines structurales (Effantin, 2005) :

(A) le phage T4 (Myoviridae, queue contractile), (B) le phage T7 (Podoviridae, queue courte) et (C) le phage SPP1 (Siphoviridae, queue non contractile), (D) Image prise en coloration négative du phage X (Siphoviridae, queue non contractile) illustrant les différentes parties le constituant notamment sa queue

1.3. Classification des bactériophages

Un système de classification de phages a été élaboré par le Comité international de taxonomie des

La structure sur laquelle est basée la classification des bactériophages est extrêmement variée. Les critères de classification sont (Dublanchet, 2009) (Figure 2) :La nature de l'acide nucléique : généralement ADN double brin, parfois ARN simple brin (Inal , 2003) ; la forme de la capside (icosaédrique ou tubulaire) et la présence ou non d'une enveloppe (nommée péplos).

Approximativement 90% de tous les phages infectent et tuent les bactéries, mais ne conviennent pas tous à la phagothérapie (Gill et Hyman, 2010). De ce fait, l'intérêt est porté sur les phages lytiques représentés par 3 familles de l'ordre des Caudovirales : les Myoviridae, les Siphoviridae et les Podoviridae (Ackermann, 2011).

1.4. Biologie des bactériophages

La capacité de reproduction des phages à l'aide d'une bactérie nécessite l'insertion du matériel

génétique de ce dernier au sein de la bactérie et du détournement de la machinerie bactérienne pour son métabolisme. Cette dernière propriété fait des phages des particules virales car ne possédant pas d'autonomie de reproduction. (Weinbauer, 2004 ; Drulis-Kawa et al., 2012).

On discerne trois types de bactériophages : les phages dits « virulents » ou « lytiques », représentant près de 90 % des bactériophages, ceux dits « tempérés » ou « endogènes » ou « lysogénique » représentant environ 10 % et ceux dits « phages filamenteux » ou cycle chronique, bien plus minoritaires (moins d'1 %). Parmi tous les bactériophages, les plus étudiés sont le phage T4, appartenant aux phages virulents, et le phage X, appartenant aux phages tempérés (Inal, 2003).

1.4.1. Cycle lytique « phages virulents »

Les phages lytiques, comme leur nom l'indique, détruisent la bactérie. Ils détournent la

machinerie bactérienne à leur profit pour se reproduire et se multiplier. Au terme du processus appelé cycle lytique, la bactérie éclate et plusieurs dizaines de nouveaux phages identiques à l'original- sont libérés dans le milieu et donc disponibles pour s'attaquer à d'autres bactéries de la même espèce. Véritables « tueurs professionnels », les phages lytiques sont les prédateurs naturels des bactéries. Ce sont précisément ces phages lytiques qui sont utilisés à des fins thérapeutiques (depuis D'Hérelle) pour lutter contre les infections bactériennes (phagothérapie) (Dublanchet, 2009 ; Ravat et al., 2015).

Arrimage, c'est-à-dire fixation du phage sur la bactérie grâce à des récepteurs spécifiques au phage et à l'espèce bactérienne à laquelle il s'attaque.

Perforation de la paroi et de la membrane bactériennes à l'aide d'enzymes contenus dans le phage Injection de l'ADN du phage dans le cytoplasme bactérien, le plus souvent à l'aide des molécules contractiles du fourreau, qui se comporte ainsi comme une seringue

Production avec fragmentation de l'ADN bactérien et utilisation de celui-ci pour synthétiser les éléments constitutifs des futurs phages.

Maturation et assemblage des différents éléments produits et éclatement de la bactérie et libération des phages dans le milieu. Cette opération conduit à la mort bactérienne et à la production de 50 à 100 clones du phage original pour chaque cycle lytique.

1.4.2. Cycle lysogénique « phages tempérés »

Des bactériophages, appartenant tous à l'ordre des Caudovirales, sont appelés des phages tempérés. Ces phages peuvent établir avec les bactéries des rapports de longue durée, éventuellement réversibles, qualifiés de lysogénie (Anas, 2011).

Le cycle lysogénique, aussi nommé « lysogénisation » (Dublanchet et Patey, 2011), a lieu lorsqu'un phage tempéré pénètre dans une cellule bactérienne. Le génome du phage s'insère dans celui de la bactérie et devient dès lors partie intégrante de celle-ci (on appelle le génome viral intégré « prophage »). La réplication de ce matériel génétique a ainsi lieu en même temps que celui de la bactérie. Celle-ci, dont le chromosome bactérien a été envahi, transmet ensuite lors de sa division ce nouveau patrimoine génétique à sa descendance (figure 2) (Dublanchet, 2009). Cet état « silencieux » demeure jusqu'à ce qu'à un moment donné, le cycle lysogénique s'active en cycle lytique et que le génome du phage s'excise du chromosome bactérien. Ce changement d'état est relativement rare : un cas pour 100 000 phages tempérés environ (Dublanchet, 2009), mais sa fréquence est augmentée lors d'un stress, induit par exemple par des rayons ultra-violets, des rayons X ou des substances chimiques comme des oxydants.

1.4.3. Cycle chronique « phages filamenteux »

La durée d'un cycle de réplication typique chez les phages filamenteux varie entre 10 et 15 minutes. Lors de ce cycle, le phage se fixe sur la membrane de la bactérie à partir du pilus sexuel bactérien et injecte son ADN dans la bactérie. L'ADN viral introduit dans la cellule bactérienne est converti de simple brin à double brin puis répliqué et transcrit en ARNm ; les ribosomes bactériens traduisent ensuite les ARNm en protéines de la capside virale, qui s'insèrent ensuite dans la membrane bactérienne, et s'assemblent entre elles en entourant un nouveau brin d'ADN viral, tout en traversant la membrane bactérienne jusqu'à être totalement excrétées sous forme de nouveaux virions. Cette invasion ne détruit généralement pas les bactéries et n'est donc pas intéressante en ce qui concerne la phagothérapie (Ackermann, 2003 ; Clokie et al., 2011).

Figure 2 : Schéma des cycles d'infection phagique (lytique et lysogénique) (García et al., 2010)

Lors d'un cycle lytique, un phage virulent va pénétrer au sein de la cellule bactérienne, détruire le génome bactérien, en détourner la machinerie pour produire des éléments constitutifs de nouveaux phages et enfin lyser la bactérie pour libérer ces nouveaux virions.

Lors du cycle d'un phage tempéré, le génome phagique va s'intégrer au génome bactérien et prendre le nom de « prophage ». Ce prophage peut être transmis par transfert bactérien vertical (cellule mère à cellule fille) ou horizontal (entre deux bactéries sans lien de parenté). Parfois le cycle lysogénique s'active en cycle lytique notamment à l'occasion d'un stress.

2. Applications des bactériophages

2.1.Phagothérapie

Les phages sont des virus et comme tous virus se reproduisent aux dépens de cellules vivantes. Un phage ne peut utiliser que les constituants d'une bactérie, celle-ci appelée bactérie-hôte. La spécificité d'hôte caractérise un phage par la reconnaissance d'un groupe restreint de bactéries (gamme d'hôtes) appartenant à la même espèce, voire de quelques souches d'une seule espèce, rarement plusieurs espèces voisines (Dublanchet, 2014).

En 1896, Ernest Hanbury Hankin, démontrait que les eaux du Gange et de la rivière de Yamuna contiennent des principes biologiques qui empêchent la croissance de cultures de bactéries responsables du choléra. Selon lui ces substances peuvent passer à travers les microfiltres (Hankin, 1896). C'est plus tard en 1915 que les bactériophages ont été décrits pour la première fois par Frederick William Twort (bactériologiste) lors de ses travaux sur les virus « ultra-microscopiques » (Twort, 1925 : Dublanchet et Fruciano, 2008).

2.1.1. Pharmacologie de la phagothérapie

La pharmacologie des phages et ceux des antibiotiques diffèrent sur trois points principaux :

La variation d'efficacité des traitements dans des cas de maladies infectieuses d'origine bactérienne en fonction de la concentration de phages

La densité joue également un rôle important dans l'efficacité de la phagothérapie étant donné qu'elle est tributaire de la diffusion des phages dans l'organisme. En raison de leur taille, et donc d'une densité élevée, les phages mettent beaucoup plus de temps à diffuser au sein de l'organisme hôte. Des modèles théoriques ont clairement démontré l'importance de la dose initiale ainsi que du temps d'inoculation sur l'efficacité d'infection d'une population bactérienne par des phages (Payne et Jansen, 2001).

2.1.2. Intérêts de la phagothérapie

Un avantage très important concerne la résistance des bactéries vis-à-vis des bactériophages. En effet, cette résistance existera toujours mais à la différence des antibiotiques, les bactériophages sont des organismes « vivants ». Certes, on peut contester l'appellation « vivant » concernant ces virus, mais ce ne sont pas de banales molécules inertes. Les bactériophages évoluent, au même titre que les bactéries. Les phages changent avec le temps par des mutations et ils auront toujours la capacité d'infecter les bactéries, même si ces dernières développent de nouvelles résistances. Donc les bactéries multi-

résistantes aux antibiotiques continuent à être attaquées et tuées par les bactériophages virulents. Il s'agit de processus aussi ancien que la vie sur terre en constante évolution (Dublanchet et Patey, 2011).

Un argument qui peut peser face aux antibiotiques, est la diversité des bactériophages. A quelques rares exceptions près, il existe au moins un bactériophage qui peut infecter une bactérie (Chambon, 2006). Il ne reste plus qu'à isoler le ou les phages pour s'attaquer à une infection donnée, chose très aisée face aux années de recherches qu'implique la découverte d'une nouvelle famille d'antibiotiques.

L'avantage de l'étroite spécificité des bactériophages pour leur cible réside dans le fait qu'ils ne se multiplient qu'au sein de l'infection. Cette particularité les oppose aux antibiotiques, responsables du déséquilibre des flores, elles-mêmes à l'origine de troubles digestifs, mycoses et infections opportunistes secondaires. Il est, en outre, nécessaire d'administrer les antibiotiques régulièrement pour palier leur élimination (destruction et/ou excrétion) continue par l'organisme (Dublanchet et Patey, 2011).

2.1.3. Contraintes de la phagothérapie

Le principal inconvénient de la phagothérapie est le besoin de déterminer rapidement l'étiologie de la bactérie responsable de l'infection avec certitude. Il n'existe pas de phagothérapie probabiliste comme est le cas en antibiothérapie. La spécificité des relations entre les phages et les bactéries est un principal avantage mais également une limite quant à l'application de la phagothérapie. Un échantillon clinique doit être isolé, cultivé puis identifier selon des procédures microbiologiques standards avant l'administration des phages. Or, ce processus peut s'étendre jusqu'à 5 jours, comme dans le cas de la fièvre typhoïde. Ce problème pourrait trouver solution en l'utilisation de cocktails de phages (Loc-carrillo et Abedon, 2011).

Nécessité d'utiliser un bactériophage lytique et non un bactériophage tempéré car en plus d'être inefficace il peut être à l'origine de transfert de gènes pathogènes vers les bactéries. Cependant, grâce à la biologie moléculaire et au séquençage du génome viral, on peut rapidement éliminer les phages contenant des séquences génomiques potentiellement dangereuses (gènes de toxines, gènes de virulence, gène de résistance aux antibiotiques etc.). (Gorski et al., 2009)

Et pour finir, il est noté également le développement de résistance chez la bactérie cible résultant d'une mutation, d'une sélection ou de l'acquisition d'un nouveau matériel génétique par un phage tempéré. Il existe au moins 4 mécanismes de résistance que peut déployer une bactérie face à un phage spécifique : la perte ou l'absence du récepteur, sa modification structurale, ou par un mécanisme dans lequel le récepteur est caché au phage, contrant ainsi l'adhésion du phage à la bactérie. La perte du récepteur se produit lorsque la modification de la composition de la surface de la cellule bactérienne

advient, tel qu'il a été démontré pour Bordetella spp. (Liu et al., 2002). Fort heureusement, la fréquence de résistance obtenue in vivo lors de la phagothérapie est basse (Kutter et al., 2010) comparée aux observations faites in vitro. De plus, l'isolement de nouveaux phages actifs à partir de l'environnement offre de nouvelles possibilités de traitement

2.2 Essor du génie génétique et de la biotechnologie

Les bactériophages, décrits en 1915 par F. Twort et en 1917 par F. d'Hérelle, ont conduit à la découverte de nombreux concepts dans la biologie et la virologie et ont permis l'essor de la biologie moléculaire et de la génétique entre les années 30 et les années 60.

Hershey et Chase ont pu démontrer, grâce au bactériophage T2, que l'ADN était le support de l'information génétique (Hershey et Chase, 1952). Aujourd'hui, les bactériophages sont toujours utilisés en biologie moléculaire, comme par exemple dans les techniques de clonage ou de phage display.

Les bactériophages ont une importance majeure pour l'évolution. Ils ont été décrits comme des agents de transfert latéral de gènes (Canchaya et al., 2003). Le transfert des gènes crée un avantage de sélection pour la bactérie hôte, exemple des gènes de résistance aux antibiotiques. Toutefois, le même processus peut être utilisé au profit de la thérapeutique par transfert de gènes rendant la bactérie plus sensible à certains antibiotiques (Lu et Collins, 2009). Une autre approche consiste à inverser la résistance à l'antibiotique en injectant des gènes spécifiques qui confèrent une sensibilité accrue. Ceci a été récemment démontré par la possibilité de rendre des bactéries résistantes à la streptomycine et à l'acide nalidixique sensibles (Edgar et al., 2012).

2.3. Agroalimentaire

Selon les estimations des "Centers for Disease Control and Prevention" 9,4 millions de cas de maladies d'origine alimentaire, presque 56 000 hospitalisations et plus de 1 350 décès sont rencontrées chaque année aux États-Unis seulement (Scallan et al, 2011). Cependant, les produits (LISTEX P100TM et ListShieldTM) ciblent Listeria monocytogenes, contaminant potentiel de viande, de volaille, de produits laitiers et de légumes crus et pousse même dans les aliments réfrigérés en provocant après ingestion une infection grave appelée listériose. D'autres produits ciblant Salmonella sp. (SalmoFreshTM et SALMONELEXTM) et E. coli O157 :H7 (EcoShieldTM) sont en instance d'autorisation. (García et al, 2010 ; Zhang et al, 2012).

L'utilisation des bactériophages semblent être une alternative biologique aux substances chimiques utilisées actuellement en agriculture (pesticides, antibiotiques). Concernant les cultures, sont notamment commercialisés deux produits ciblant Xanthomonas sp. Ou P. syringae, deux pathogènes de la tomate

entre autres (AgriPhageTM). Concernant l'élevage, plusieurs études ont montré une efficacité de l'utilisation des bactériophages dans la lutte contre les infections à Campylobacter jejuni dans les élevages de volailles (Loc-Carrillo et al, 2005 ; Wagenaar et al., 2005 ; Carvalho et al, 2010;).

2.4. Traitement des eaux usées

Au cours du traitement des eaux usées par les boues activées ces dernières s'installent dans les réservoirs, et le surnageant est évacuée pour davantage de purification. Mais ce processus est déjoué par des microorganismes filamenteux comme Sphaerotilus natans, qui poussent de longs tentacules qui suspend les boues et diminuer la décantation. (Choi et al., 2011). Des phages isolés à partir d'eaux usées ont été testés contre le chlore : le traitement standard par le chlore, a retiré 40 % de biofilms de Pseudomona aeroginosa. Les phages appliqués seuls ont tué 89 %. Alors que les phages suivis de chlore ont éliminé 97 % des biofilms (Zhang et Hu, 2013).

2.5. En médecine humaine et vétérinaire

L'étude des phages a des implications importantes en médecine et en génétique, surtout pour la compréhension des infections virales, des anomalies génétiques et de la résistance des bactéries aux antibiotiques. Les phages sont aussi utilisés dans le traitement vétérinaire de différentes maladies animales, y compris les infections oculaires d'origine bactérienne (Kutateladze et Adamia, 2008).

3. Rôles des phages en Biologie moléculaire

3.1.Rôle des bactériophages dans le transfert des gènes (phage lysogénique)

Les prophages inactifs, sont parfois intégrés au génome bactérien lorsqu'ils ont subi des modifications génétiques irréversibles. Certains sont actifs et peuvent s'exciser du génome bactérien, se reproduire et infecter de nouveaux hôtes. Lors de son intégration dans le génome de la bactérie, le phage tempéré dirige la synthèse d'un répresseur qui bloque l'expression de certains de ces propres gènes ainsi que ceux d'autres phages lysogènes très proches de lui. Ceci est un bénéfice non négligeable pour la bactérie d'autant que certains prophages aident en plus la bactérie en la protégeant contre l'infection par certains phages lytiques sans rapport avec eux (Berdjeb et Jacquet, 2009).

Avec le temps, de nombreux résultats de recherche montrent que non seulement les phages contribuent à l'évolution des bactéries par le biais de la transduction mais, aussi ceux-ci contribuent directement à la toxicité des bactéries. L'acquisition de nouveaux gènes par l'intermédiaire d'un phage lysogène peut, dans certains cas, modifier sensiblement la pathogénie de la bactérie (Lebaron et Nicolas 2003). Ainsi, il a été montré que certaines toxines contribuant significativement à la nocivité d'une

bactérie sont codées par des gènes de bactériophages. Par exemple, la toxine du choléra est contenue dans le génome du bactériophage filamenteux CTXÖ qui infecte les bactéries Vibrio Cholerae (Davis et Waldor, 2003). Par ailleurs, certains gènes portés par des phages peuvent modifier profondément n'importe quelle étape du processus infectieux d'une bactérie comme l'adhésion, la colonisation, l'invasion, la résistance aux défenses immunitaires, la sensibilité aux antibiotiques et la transmissibilité entre humains.

3.2. Les phages display

Les phages sont également utilisés pour la recherche antivirale. La méthode de phage-display permet un criblage rapide de molécules en utilisant leur affinité pour une cible. Elle consiste à fusionner le peptide d'intérêt à une protéine de surface du bactériophage. Cette méthode est efficace pour isoler et/ou améliorer de nombreuses molécules notamment, les inhibiteurs d'infection. Les phages recombinants sont sélectionnés pour leur capacité de liaison à une cible, telle qu'un anticorps, une enzyme, un récepteur purifié, un acide nucléique ou tout autre molécule de nature non protéique (Castel et al., 2009). Le phage par excellence est le phage M13. Toutefois les phages fd, f1, T4 et T7 sont également proposés (Souriau et al., 1998).

3.3. Les protéines des phages

La diversité des phages dans la nature reste toujours mal connue car beaucoup de bactéries de l'environnement (et de ce fait leurs phages) ne sont pas cultivables. Pour contourner cette difficulté, des analyses de séquences génétiques ont été faite directement sur de l'ADN extrait de l'environnement et amplifié sélectivement par PCR (polymerase chain reaction), sans passer par l'étape de mise en culture (Filee et al., 2006.). La partie centrale de la séquence du gène codant pour la protéine principale (g23) de la tête du phage T4 (la capside) peut servir de bon substitut phylogénique à l'ensemble du génome (Filee et al., 2005).

L'assemblage de la queue du phage T4, dont au moins les produits de 22 gènes sont impliqués dans l'assemblage de la queue du phage T4. La voie d'assemblage de la queue est strictement basée sur les interactions des protéines par ordre séquentiel (Kanamaru et al., 2002).

Les baseplates, remarquablement ont une structure multi-protéique complexe qui sert d'unité de contrôle de l'infection par le T4, sont assemblées en premier. Le baseplate est composé d'environ 150 unités d'au moins les produits de 16 gènes différents sont oligomériques. Le baseplate est assemblé à partir de six portions identiques. Le gp11 (le STF connecting protein), gp10, gp7, gp8, gp6, gp53, et gp25 sont combinées pour construire un coin. Le noyau central est constitué par gp5, gp27 (King, 1968) et gp29. L'assemblage de baseplate est complété par l'adjonction de gp9, le STF-connexion protéines,

STFs, gp48, et gp54. Les deux dernières protéines sont nécessaires pour initier la polymérisation du tube de la queue. Le tube de queue est terminé avec gp3 (King, 1968 ; Vianelli et al., 2000). Le tube de la queue sert de modèle pour l'assemblage de gp18 qui forme la gaine contractile de la queue (Figure 3). La longueur du tube de la queue est probablement déterminée par la gp29, qui participe également à l'assemblage des baseplates (Kikuchi et King, 1975). La longueur de la gaine de la queue est déterminée par le tube. Le tube de la queue et la gaine ont une symétrie hélicoïdale avec une hauteur de 40.6A° et des sous-unités répétées successivement tous les 17.7A° (Vadim et Mesyanzhinov, 2004).

L'assemblage de la queue est complété par une gp15 hexamère qui lie le dernier anneau de la gaine de la queue (Zhao et al., 2003). La queue s'associe à la tête après compactage de l'ADN. L'assemblage de la queue et de la gaine représente une structure métastable supramoléculaire qui subit des changements de conformation après liaison des phages à des récepteurs de la cellule hôte. Au cours de la contraction irréversible, la longueur de la gaine diminue de 980 à 360A°, et son diamètre extérieur augmente de 210 à 270A° (Figure 3).

Le phage T4 contient trois types de protéines fibreuses : des fibres longues (LTFs), des fibres courtes (STFs), et moustaches. Chaque LTF se compose par une partie proximale codée par le gène 34 et une partie distale codée par le gène 37. Les deux parties sont reliées par gp35 et gp36 qui forment une région charnière. Les protéines qui forment la LTF sont homotrimeres, mais pour gp35 est assemblé comme un monomère. Les fibres courtes (STFs) codées par gp12 qui interagissent avec le lipopolysacharide de la bactérie lors de l'infection (Coombs et Arisaka, 1994).

(A) Phage fixant la plaque de base à la surface de la cellule. (B) Queue contraction provoquant la perforation de la membrane cellulaire externe par l'aiguille gp5. (C) La dissociation gp5C à partir du tube de queue, activant ainsi les trois domaines de lysozyme. (D) Les domaines du lysozyme créant une ouverture dans la couche de peptidoglycane. (E) L'association gp27 avec un récepteur sur la membrane interne et initier la libération d'ADN dans le cytoplasme. Pour simplifier, les LTF ne sont pas montrés en B à travers E.

3.4. La génomique des phages dans la nature

Il n'y a pas de marqueur universel pour les phages de la même manière que le gène de l'ARNr 16S peut être utilisé pour remplacer de manière fiable l'affinité phylogénétique de toutes les bactéries. En effet, il n'y a pas de gènes convenablement conservés dans tous les phages, ou même par exemple présents dans les Caudovirales (Paul et al., 2002 ; Clokie et al., 2011). Les chercheurs ciblent généralement les gènes qui codent les protéines structurales en tant que marqueurs phylogéniques. Un gène qui a été largement utilisé est le gène qui code pour la protéine portale qui est située au sommet du col du phage et à travers laquelle passe l'ADN en descendant la gaine de la queue (Zhong et al., 2002 ; Marston et Sallee, 2003). Des amorces ont été développé à partir de ce gène pour étudier les séquences dans les phages de type T4 qui sont connus pour infecter un large éventail d'hôtes bactériens (Filee et al.,2005).

3.5. La métagénomique des bactériophages

Les virus de l'environnement sont à la fois très nombreux, très diversifiés et largement méconnus. Au-delà de leur pouvoir pathogène, on leur reconnaît aujourd'hui une influence plus large sur des aspects fondamentaux de l'écologie de notre planète, comme les cycles biogéochimiques, la régulation des communautés de micro-organismes ou encore l'évolution des organismes vivants et de leurs génomes (Willner et al., 2009).

Les approches de métagénomique virale, consistant en un séquençage aléatoire massif des acides nucléiques encapsidés, ont permis durant cette dernière décennie de mieux connaître la composition des communautés virales naturelles ainsi que la diversité génétique des virus (Roux et al., 2013). Les métagénomes viraux permettent de comparer les communautés virales et ainsi de mieux comprendre la répartition des populations virales dans la biosphère. Parmi les séquences de viromes affiliées aux virus, la majorité est similaire à des génomes de bactériophages, appartenant principalement au groupe des Caudovirales (groupe de phages bactériens à structure tête-queue).

L'existence de gènes conservés au sein des différents groupes viraux rend en effet possible de mener des analyses phylogénétiques pour ces groupes. Le gène codant pour la grande sous unité de la terminase (TerL) est le marqueur le plus utilisé dans le cas des Caudovirales.

Une partie de ces séquences de viromes sont affiliées au groupe des phages de type T4, groupe de référence incluant le phage T4 infectant la bactérie Escherichia coli et utilisé comme modèle depuis plusieurs décennies. Deux sous-groupes sont ainsi retrouvés dans les viromes lacustres : le groupe des cyanophages de type T4 et le groupe des Far-T4 (Comeau et Krisch, 2008), (Figure 4) pour lequel le phage « Rhodothermus phage RM378 » est le génome de référence le plus proche.

A) Arbre phylogénétique basé sur l'alignement des gènes codant pour la grande sous-unité de la terminase, gène commun à l'ensemble des Caudovirales (bactériophages à queue). Cet arbre permet d'associer des séquences de références (en noir) et des séquences issues des viromes (en rouge et bleu) ; B) zoom sur le sous-arbre comprenant la famille des phages T4. Les trois sous-groupes connus (near-T4, cyano-T4, Far-T4) sont indiqués sur l'arbre.

4. Caractérisation génomique

4.1.Cas du bactériophage T4

Le bactériophage T4 a environ 300 gènes probables emballés dans son génome dont la taille est de 168,903 pb. Il a un total de 289 gènes codant pour des protéines, 8 gènes d'ARNt et au moins 2 d'autres gènes qui codent de petits ARN stables de fonction inconnue (Miller et al., 2003). Son génome est entièrement séquencé et la fonction de la majorité de ses ORFs est connue (Figure 5). Les différents processus biologiques impliqués dans la survie du phage T4 : la transcription, la traduction, le métabolisme nucléotidique, la réplication de l'ADN, la recombinaison, la réparation, l'encapsidation, les virions protéiques, les protéines chaperons, la lyse de la cellule hôte, les interactions avec l'hôte, les endonucléases et des fonctions inconnues (Tableau I) (Miller et al., 2003).

Les études structurales des protéines du phage T4 ont commencé avec la cristallisation et la détermination de la structure tridimensionnelle de gpe (lysozyme). Le phage T4 lysozyme est un excellent exemple de l'analyse structurale et de remplacement des acides aminés ciblés utilisés de manière à démêler les propriétés catalytiques d'une enzyme et la conformation de la protéine (Bardy et al., 2016) (Annexe 1).

4.2.Méthodes de génotypage

Dans le but de comprendre le mode de dissémination des infections dans les communautés et les hôpitaux, mais également d'appréhender les changements évolutifs qui ont donné lieu à des avantages sélectifs, la distinction précise entre différents isolats d'une espèce est indispensable. Ceci peut être fait grâce aux techniques moléculaires de typage ou génotypage.

Plusieurs techniques de génotypage sont disponibles et des études menant à leur comparaison ont été réalisées permettant d'identifier les plus informatives pour évaluer la diversité des souches cliniques et environnementales (Wommack et al., 1999).

Il s'agit de méthodes reposant sur l'analyse du polymorphisme de longueur des fragments d'ADN générés par digestion enzymatique. Parmi ces techniques figure le PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) d'où électrophorèse en champ pulsé (ECP) est fondé sur l'analyse de fragments d'ADN de très grande taille issus de la digestion enzymatique (macro-restriction). Il demeure la méthode de choix pour plusieurs bactéries mais aussi des bactériophages (Clokie et al., 2011).

Les méthodes basées sur l'analyse des produits d'amplification. Ces techniques possèdent d'une grande sensibilité et spécificité permettant d'analyser une faible quantité d'ADN. On a le RADP (Random Amplified Length Polymorphism) et le AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Steward, G.F., 2001).

Figure. 5 : Carte génétique du génome du bactériophage T4 (Miller et al., 2003)

Les ORFs caractérisés et hypothétiques sont montrés sur carte. Les gènes schématisés par des flèches portant la mème couleur appartiennent à une mème catégorie fonctionnelle de gènes caractérisés. Les flèches blanches correspondent à des gènes dont la fonction est inconnue. Le schéma en couleur est expliqué dans le Tableau I

Tableau I : Différents gènes fonctionnels en fonction des couleurs (Miller et al., 2003).

Catégories des gènes fonctionnels du phage T4	Gènes
Transcription (Rouge)	asiA, dsbA, goF, modA, motA, motB, mrh, rpbA, srd, srh, 33, 55 (alc, alt, 45)
Traduction (Marron)	cef, dmd, modB, regA, regB, vs, rnlA, rnlB (modA), tRNAR, tRNAI, tRNAT, tRNAS, tRNAP, tRNAG, tRNAL, tRNAE; rnaC, rnaD
Métabolisme de Nucléotides (Orange)	cd, denA, denB, frd, nrdA,B,C,D,G,H, nudE, pseT, td, tk, 1, 42, 56
La réplication de l'ADN, la recombinaison, la réparation, l'emballage (jaune)	dda, denV, dexA, repEA, repEB, rnh, uvsW, uvsX, uvsY, 16, 17, 30, 32, 39, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 59, 52, 60, 61/58, 62
Virions protéiques (bleu)	Head: soc, hoc, inh, ipI, ipII, ipIII, 2, 4, 20, 23, 24, 67, 68, (22, 21) , Neck: 13, 14 ,Tail: 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 48, 53, 54 ;Tail fiber: wac, 34, 35, 36, 37 (rnlA)
Chaperons (bleu points)	21, 22, 31, 38, 40, 51, 57A, rnlA
Lyse (Vert)	e, rI, rIII, sp, t (rIIA, rIIB)
Interactions avec hôte (violet)	ac, arn, _-gt, _-gt, dam, imm, pin, rIIA, rIIB, stp, (gol, pseT, rnlA)
Arrêt d'hôte (rose)	alc, alt, gol, ndd (denA, denB, modA, modB)
Endonuclease (peche)	I-TevI-III, mobA-mobE, segA-segG
Inconnue (blanc ou ~)	Inconnu

Matériel et Méthodes

1. Matériel

1.1.Cadre d'étude

La présente étude a été réalisée à la plateforme de biologie moléculaire de l'Institut Pasteur de Côte d'Ivoire de Juin 2018 à Octobre 2018 (5 mois).

1.2. Matériel d'étude

1.2.1. Matériel biologique

Le matériel biologie est constitué de 5 bactériophages provenant de différents sites d'isolement. Il s'est agi de 2 phages isolés dans les eaux lagunaires (lagune Ebrié) et de 3 phages isolés des micromammifères. Le phage T4 a été utilisée comme phage contrôle de cette étude (Tableau II).

1.2.2. Matériel technique, équipement et consommables

La réalisation de cette étude a nécessité l'utilisation de plusieurs appareils et consommables (Tableau III) qui ont permis de réaliser l'extraction et la purification du matériel génétique ainsi que l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE).

1.2.3. Réactifs et tampons

Divers réactifs et tampons ont été nécessaires pour l'étude moléculaire (Tableau IV et V). De plus, l'eau pure utilisée était de qualité biologie moléculaire, elle a permis de réduire les variations du pH du milieu réactionnel. Par ailleurs, les tampons et réactifs mentionnés dans le tableau IV ont permis la caractérisation génomique (PFGE), tandis que ceux du tableau V ont été utilisés pour la concentration des phages, l'extraction du matériel génétique et la digestion enzymatique à l'aide des enzymes de restriction (XbaI, XmnI, XhoI) dont les caractéristiques sont contenus dans le Tableau VI.

Phages	Origine	Année d'isolement	Réference
p Ebrios	Lagune Ebrié (Cote d'Ivoire)	2015	Ngazoa-Kakou et al., 2017 ; Kakou et al, 2018.
p A5a	Abobodoumé/ Lagune Ebrié (Cote d'Ivoire)	2017	- N.P
p M3	Décharge Akouedo (Cote d'Ivoire)	2017	N.P
p M7	Gbetitapea (Cote d'Ivoire)	2017	N.P
p M11	Soko (Cote d'Ivoire)	2017	N.P
p T4	Univerité Laval (Canada)	1944	Szermer-Olearnik et Boratyñski, 2015.

	Désignations	Rôles
	V' Cônes stériles (ART®)
	V' Tubes Falcon 15 et 50ml (WVR®)
	V' Alcool 70%, Eau distillée
	V' Tube eppendorf 1,5 et 2 mL
	V' Béchers 500-1000 mL
Consommables		Extraction et
	V' Bistouris, Embouts	purification
	V' Moules (Bio-Rad Laboratories)
	V' Réfrigérateur 4°C, Incubateur à 50°C
	V' Bain marie à 54°C,Microcentrifugeuse
	V' Spatule stérile, Scalpel stérile
	V' Générateur avec systèmes PFGE (CHEF-DR III	Caractéristion
Équipements	System) (Bio-Rad) V' Micropipettes et des cones.	génomique, PFGE
	V' Balance électronique de précision (BEL)
	V' Gel Doc Imager (Bio-Rad)

Désignations	Réactifs	Quantité/L
1.0 M Tris, pH 8.0	· Tris [Tris hydroxymethyl aminomethane] · Ajuster le pH à 8.0 · H2O	60.57g 350 ml 500 ml	0.5 M EDTA, pH 8.0
· EDTA · Ajuster le pH à 8.0 · H2O	93.05 g 500 ml	Tris-EDTA (TE) buffer, 1X, (10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 8.0).
· 1M Tris, pH 8.0 · 0.5 M EDTA, pH 8 · H2O	1 ml 0,2 ml 100 ml	Tris-Borate-EDTA (TBE), Buffer, 5X (0.45 M Tris borate et 0.01 M EDTA).
· Tris base · Acide borique · 0.5 M EDTA, pH 8.0 · H2O	54 g 27,5 g 20 ml 1 L	Tris-Borate-EDTA (TBE), Buffer, 0.5X (45 mM Tris borate et 1 mM EDTA)
· 5X TBE · H2O	200 ml 1 L	Phage suspension (PS) Buffer (0.1 M Tris et 0.1 M EDTA, pH 8.0).
· 1.0 M Tris, pH 8.0 · 0.5 M EDTA, pH 8.0 · H2O	10ml 20ml 100 ml	Plug agarose (1.2% SeaKem Gold Agarose, 1X TE Buffer).
· SeaKem Gold Agarose · 1X TE Buffer · Chauffer jusqu'à dissolution puis maintenir à 50 ?C	1.2 g 100 ml	Phage lysis (PL) buffer (50mM Tris, 50mM EDTA, and 1% (w/v) SDS).
· 1.0M Tris, pH 8.0 · 0.5M EDTA, pH 8.0 · SDS · H2O	5 ml 10ml 1 g 85ml	Protéinase K solution, 20 mg/ml.
· Protéinase K · Sterile nuclease-free water	20mg 1ml	PFGE agarose (1% SeaKem Gold Agarose, 0.5X TBE).
· SeaKem Gold Agarose · 0.5X TBE Buffer · H2O · Chauffer jusqu'à dissolution et refroidir à 50 ?C	1,2 g 120 ml 1 L	PBS 1X
· Un comprimé	500 ml	· PFGE low range DNA Marker in http://www.neb.com/; Catalogue
agarose plugs (New England Biolabs; Ipswich, MA, No. N0350S), approximately 0.13-194 kb

Désignations	Fournisseurs	Roles
Bench Top 1 Kb DNA Ladder GeneRuler 1 Kb DNA Ladder Blue 6X loading dye Sybr® Safe DNA Gel Strain Ultra ^TM Agarose TAE Buffer 10X	Promega Thermo Scientific Thermo Scientific Invitrogèn Invitrogèn Promega	Réalisation de l'électrophorèse standard
Polyethylene Glycol (PEG) 8000 Phosphate Buffered Saline (PBS) NaCl (Chlorure de sodium) Alcool Isopropanol 100% Alcool Iso-amylique Ethanol95% Acetate de Sodium Phénol : Chloroforme : Alcool Isoamylique (25 : 24 : 1) Protéinase K (20 mg/ml) RNase A 4 (mg/ml) DNase I	Promega Invitrogèn Promega Riedl-de Haen AMRESCO AMRESCO Promega Promega Roche	Concentration des phages et l'extraction du matériel génétique
XbaI XmnI XhoI Bovine Serum Albumin (BSA)	Promega Promega Roche Promega	Digestion enzymatique

Endonucléase (Source)	Sites de restriction	Température	Temps d'incubation	Origine
XbaI (Promega)	5'...TCTAG " A...3' 3'...A.?.GATCT...5'	37 ° C	4 Heure	Xanthomonas badrii
XmnI (Promega)	5'...GAANN " NNTTC...3' 3'...CTTNN ?. NNAAG...5'	37 ° C	4 Heure	Xanthomonas campestris pv. manihotis
XhoI (Roche)	5'...C " TCGA...3' 3'...G AGCT?.C...5'	37 ° C	4 Heure	Xanthomonas holcicola

2. Méthodes

2.1. Concentration des bactériophages

2.1.1. Principe

La concentration des phages consiste à concentrer les virus par l'intermédiaire de deux solutions:

le Polyéthylèneglycol (PEG 8000 à 40 %) et le NaCl (5 M). Ce mélange va permettre au PEG de former un complexe avec les cellules phagiques (Phage-PEG) et ce complexe est précipité par centrifugation après incubation sur glace. Le PEG est éliminé par le chloroforme pendant que les phages demeurent intacts. Ensuite les phages sont détruits par du phénol tandis que l'élimination des protéines phagiques a été possible par l'ajout du mélange phénol / chloroforme.

2.1.2. Protocole

Les phages ont été concentrés selon la méthode de Kumari et al., 2009 avec quelques

modifications. Ainsi, 3 mL de phages purifiés (10¹⁰-10¹¹ PFU/ mL) sont ajoutés à 400 ìL de NaCl 5 M, et 800 ìL de PEG 8000 à 40 % et conservés à 4 O C pendant une nuit. Les précipités recueillis après centrifugation (10 000 rpm / min pendant 10 minutes, 4 O C) sont remis en suspension dans 500 ìL de PBS 1X (pH 7,2). Le mélange obtenu est traité avec un égal volume de chloroforme-alcool-isoamylique (24: 1) puis centrifugé à 9000 rpm / min pendant 2 minutes ; ce qui permet d'éliminer le PEG 8000 et les débris cellulaires de la suspension bactérienne.

2.2. Extraction de l'ADN des phages

2.2.1. Principe

L'extraction de l'ADN est une technique qui permet d'isoler l'ADN à partir d'une cellule en

quantité et en qualité suffisante pour permettre son analyse. Elle comporte plusieurs étapes à savoir la libération de l'ADN et des différents constituants cellulaires suivie d'une lyse par digestion enzymatique avec la Protéinase K; la déproteinisation des proteines membranaires par le Phénol-Chloroforme- Alcool Isoamylique (25:24:1) et la purification sélective de l'ADN par précipitation avec l'Alcool-Isopropanol qui aboutit à la formation d'un culot (précipité).

2.2.2. Protocole

Des particules de phages préalablement purifiées (10^-10-10¹¹ PFU / mL) sont traitées avec 20 ìL

de DNase I (1mg / mL) et 15 ìL de RNase A (4 mg / mL) à 37 O C pendant 30 minutes. Dix microlitres de protéinase K (20 mg / mL) et 50 ìL de SDS (10 %) sont ajoutés à la solution obtenue, puis le tout est incubée à 56 O C pendant 30 minutes. Après l'incubation, un volume de 500 ìl de Phénol-Chloroforme-Alcool Isoamylique (25 : 24 : 1) sont additionnés au mélange qui est ensuite centrifugé à 10 000 rpm

pendant 2 minutes pour séparer les phases. Cette opération d'ajout de phénol-chloroforme-alcool isoamylique suivi de la centrifugation est répétée trois fois. La phase aqueuse (phase supérieure) est transférée dans un nouveau micro-tube de 1,5 mL puis 500 ìL d'isopropanol (100 % glacial) et 50 ìL d'acétate de sodium (3 M) y sont ajoutés. Après une incubation de 10 min sur la glace (pour permettre la précipitation), le mélange est centrifugé à 14 000 rpm pendant 15 min à 4 ° C. Le culot d'ADN est lavé deux fois avec 200 ìL d'éthanol à 70% et séché à l'air ou à 65° C dans le Thermoblock pendant 15 min. L'acide nucléique est mis en suspension dans 50 ìL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,0, EDTA 1,0 mM, pH 7,0) selon la procédure standard (Sambrook et al., 1989 ; Sambrook et Russell 2001).

2.3.Dosage fluorimétrique

2.3.1. Principe

Le système Qubit(R) 3.0 utilise la technologie des sondes fluorophores, qui contiennent des colorants qui ne fluorescent que liées aux ADN, ARN et protéines. Cette spécificité permet une quantification précise des acides nucléiques et non de contaminants. Le système Qubit est sensible et peut être utilisé même pour de faibles concentrations (10 ìg/ìL).

2.3.2. Protocole

Pour la réalisation du dosage, deux tubes d'analyse ont été utilisés pour les standards (les étalons) et un tube pour chaque échantillon. La solution de travail Qubit TM est préparée en diluant le réactif Qubit TM 1 : 200 dans le tampon Qubit TM. Un volume de 190 ìL du mélange (réactif Qubit TM + tampon Qubit TM) est réparti dans les tubes à raison de 10 ìL pour les solutions d'étalon et 195 ìL pour les échantillons à doser plus 5 ìL d'extrait d'ADN. Ensuite, la solution est mélangée au vortex pour une homogénéisation suivie d'une incubation de 2 minutes à la température ambiante. Après l'incubation, le test de dosage est réalisé dans le fluoromètre Qubit® 3.0.

2.4. Digestion enzymatique

2.4.1. Principe

Les enzymes de restriction sont des endonucléases capables de reconnaître spécifiquement une courte séquence, de 4 à 10 pb et de cliver les liaisons phosphodiesters entre 2 nucléotides à l'intérieur de l'ADN double brin au site reconnu. Ils permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille réduite, ou de le couper à tel ou tel site désiré. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments dont les extrémités sont franches. Cependant, la plupart réalisent une coupure dissymétrique :

on parle dans ce cas d'extrémités cohésives (chaque fragment possède une chaîne qui dépasse l'autre de quelques bases).

2.4.2. Protocole

L'ADN de bactériophage est mis à digérer par chaque endonucléase (XbaI, XmnI) et incubé à 37 °C pendant 4 heures en présence d'un tampon RE 10X buffer et de bovin serun albumin (BSA) fourni par le fabricant (Tableau VII).

Après incubation, les produits obtenus ont été séparés sur gel d'agarose à 0,8% dans du tampon TAE 1X (Promega) contenant 3 ìL de Sybr Safe (10000X) (Invitrogen) à 100 volt pendant 2 heures.

^&RE 10X Buffer contient à 1X : pH 7,5 à 37°C ; Tris-HcL 6 mM ; MgcL2 6 mM et NaCL 6 mM.

2.5. Electrophorèse sur gel d'agarose

Avant la migration, un gel d'agarose à 0,8% est préparé dans le tampon TAE 1X puis coloré avec 3 ìL de Sybr Safe (10000X). Un volume de 20 ìL d'extrait d'ADN sont mélangés à 4 ìL de tampon de charge (colorant Blue 6X). Le mélange obtenu est déposé dans un puit du gel et soumis à une migration à 100 Volt pendant 2 heures jusqu'à ce que le front du colorant soit proche du fond du gel. La révélation s'est faite sous UV sur Gel DOC^TM EZ (BioRad) pour visualiser la présence de bandes d'ADN.

2.6. Electrophorèse en champ pulsé

Une étape d'encapsulation des phages dans l'agarose, une étape de lyse des phages et de libération des génomes, une étape de digestion enzymatique par les endonucléases et une étape de migration sur gel d'agarose suivi de l'analyse et de l'interpretation des résultats (Figure 6).

1 :Encapsidation des phages dans l'agarose ; 2 : Lyse virale et caqqure des protéines de la capside avec la protéinase K ; 3 : Digestion enzymatique de l'ADN avec les endonucléases ; 4 : Migration électrophorétique et analyse et interpretation des résultats.

2.6.1. Encapsidation des phages dans l'agarose

Une solution d'agarose est préparée par mélange de 0,1 g d'agarose (concentration finale à 1% ; Pulsed Field Certified agarose, Bio-Rad, France) et 10 mL de tampon TBE porté à 100 °C. Après dissolution complète de l'agarose, la solution est placée dans un bain à 55 °C pendant 5 minutes.

Parallèlement les phages purifiés sont placés dans le tampon Phage Suspension (100 mM Tris, 100 mM EDTA, pH 8,0), puis un volume total de 0,5 -1 mL de suspension de phages purifiés est maintenu dans un bain marie ou bloc chauffant à 50 - 54 °C et un volume de 400 uL cette suspension de phage est tranférée dans des tubes eppendorf de 2 mL. Après homogénéisation, 400 ìL de la préparation d'agarose (1% d'agarose) conservée à 55 °C sont ajoutés et mélangés doucement avec la suspension phagique maintenue à 50 - 54°C par aspiration et refoulement avec une pipette sans qu'il n'y ait de bulles d'air. Ce mélange est ensuite immédiatement réparti dans les moules à plugs, à raison de 100 ìL par plug. Ceux-ci sont laissés à température ambiante pour se solidifier ou à + 4 °C pendant 10 à 15 min (Figure 6).

2.6.2. Lyse virale des phages dans les plugs d'agarose

Une préparation de 5 mL de tampon de lyse [(Phage Lysis : 50 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 8,0), et SDS à 1 %] additionné de 25 ìL de protéinase K à 20 mg/mL est mis un tube de 5mL. Les tubes sont ouverts délicatement, les plugs d'agarose sont rétirés des moules et transférés dans les tubes correspondants. Ces tubes sont alors placés dans un bain-marie à 54 °C pendant 2 heures. Le tampon de lyse est soigneusement éliminé des tubes à l'aide d'une pipette par aspiration. Les plugs sont lavés avec 5 mL de tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) stérile qui est chauffé à 54 °C pendant 15 min dans un bain d'eau sous faible agitation. Les tubes contenant les plugs sont rétirés du bain-marie, et le tampon est aspiré soigneusement en veillant à ce que les plugs ne soient pas cassés. Cette opération de lavage avec le tampon TE est répétee trois fois et deux fois avec de l'eau. Cependant le tampon est changé après chaque lavage. Les plugs sont alors stockés à +4 °C jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être soumis à digestion par les enzymes de restriction (Figure 6).

2.6.3. Digestion enzymatique du génome

Les plugs d'agarose sont soumis à une pré-digestion selon le mélange réactionnel (Tableau VIII) avant de réaliser une digestion enymatique proprement dite selon le mélange réactinnel (Tableau IX) dans un bain marie à 37 °C pendant 2 heures. Les plugs de phages sont rétirés du tampon TE avec un petit spatule plate désinfecté à l'éthanol, coupés à l'aide d'un bistouri ou une lame de scalpel, le long de l'axe des bouchons en faisant des tranches d'environ 2 mm de la longueur prise. Les portions restantes

des bouchons sont stockés à 4°C dans le tampon TE. Les plugs découpés sont placés dans un volume de 200 uL de tampon de restriction dilué à 1X de concentration pour une pré-digestion (Tableau VIII), puis incubés à 37°C pendant 10 à 15 min à la température ambiante. Après l'incubation, le tampon est aspiré à l'aide d'une micropipette et 200 uL de master mix de digestion (Tableau IX) est ajouté à chaque tube puis incubé à la température appropriée de l'enzyme XbaI ou XhoI pendant 2 heures. Après l'incubation, le tampon de restriction est aspiré puis les plugs découpés sont mis en suspension dans 200 uL de TBE 0,5X pendant 5 min (Figure 6).

2.6.4. Électrophorèse sur gel d'agarose

Avant la migration, un gel d'agarose de 1% est préparé dans un tampon de TBE 0,5X puis conservé au bain mari à à 55 °C. Ensuite, la cuve d'électrophorèse en champ pulsé CHEF-DRIII system (Bio-Rad Laboratoires) est remplie avec 2,2 litres de tampon 0,5X et l'automate est laissé allumer jusqu'à ce que la température de la cuve de migration passe à 14°C. Parallèlement les plugs découpés sont déposés le long du peigne. On laisse refroidir entre 45-50 °C et le gel préparé est conservé à 55 °C avant de le couler dans la direction de la longueur de l'axe. Après que le gel soit solidifié avec les plugs sur le peigne, on rétire le peigne puis on le dépose dans la cuve électrophorèse. L'électrophorèse est réalisée à 14°C avec un voltage à 6 V/cm, pendant 6 heures avec un temps de pulsation de 2,0-12,0 sec, et un angle de 120° (des temps d'impulsion peuvent être nécessaires pour optimiser la séparation des bandes) (Figure 6). Une fois la migration terminée, le gel est immergé dans une solution de sybr safe 10000X (40 uL dans 400 mL d'eau déionisée) pendant 30 min sous une faible agitation. Le gel est ensuite décoloré dans 500 mL d 'eau désionisée pendant 20 min et à chaque 10 min l'eau désionisée est changée. Le gel est examiné à l'aide d'un automate appélé GelDoc (BioRad Laboratoires) couplé à un ordinateur puis capturé, imprimé et enregistré l'image du gel coloré avec un système de documentation de gel.

Tableau VIII : Mélange réactionnel de la pré-digestion enzyamtique du PFGE

Réactifs	Volume de réactifs par plug (bouchon) en ìL	Volume de réactifs pour 10 plugs (bouchon) en ìL
H20	173	1730
Buffer 10X Enzyme	20	200
BSA 10 ìg / ìL	2	20
XbaI ou XhoI 10 U/ ìL	5	50
Volume Total	200	2000

2.7. Analyse des profils de restriction

Les analyses de profils PFGE ont été réalisées grâce au logiciel Bionumerics® (Applied Maths). Les images des gels d'électrophorèse ont été normalisées après que les bandes de restriction du marqueur de poids moléculaire aient été identifiées.

2.7.1. Evaluation de la similarité des profils

La dissemblance entre 2 génotypes est quantifiée par le calcul du coefficient de Jaccard. Il permet d'estimer le degré de dissemblance entre deux profils de restriction par le calcul du pourcentage de bandes communes sur le nombre total de bandes (Jaccard, 1908). Le cofficient de similarité de Jaccard entre deux profils de restriction i et j est calculé comme suit :

Le coefficient de Jaccard varie de 0 à 100%, un coefficient égal à 100% signifiant que les profils de restriction sont identiques. Le coefficient de Jaccard entre 2 profils est ajusté grâce à des paramètres d'optmisation et de tolérance. Lorsque les profils i et j sont comparés, deux bandes sont considérées comme identiques si la position d'une bande du profil i est comprise dans une fenêtre autours de la bande du profil j. La taille de cette fenêtre correspond à la tolérance. Le critère d'optimisation correspond ici au même principe en prennant en compte le positionnement des profils entiers les uns par rapport aux autres. La tolérance et l'optimisation sont chacun fixées à 2%.

2.7.2. Analyse phylogénétique

Les liens de parentés entre les isolats sont établis par construction de dendrogrammes. Ceux-ci sont construits par classification hiérarchique selon la méthode Unweight Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA) qui fait l'hypothèse d'une évolution indépendante des différentes lignées à une vitesse constante, avec 1000 répétitions.

2.7.3. Attribution de pulsotype et de cluster

Il s'agit d'identifier les différents profils de restriction grâce au seuil de tolérance défini précédemment. Dans cette étude, deux profils ayant au maximum 2% de différence, seront considérés comme identiques et appartenant au même pulsotype..

Résultats et Discussion

1. Résultats

1.1. Analyse du profil génomique des phages par les endonucléases sur gel d'agarose

L'analyse génomique par la digestion enzymatique montre que les phages p T4, p Ebrios, p M3 et p M7 sont des phages à ADN double brin car on a une apparition des bandes sur le gel d'agarose (Figure 7A, Annexe 4).

Les phages p Ebrios et p A5a provenant des eaux lagunaires sont des phages à ADN, et montrent un profil après digestion aux enzymes XbaI et XmnI (Figure 7, Annexe 4).

Les phages p M3, p M7 et p M11 issus de mammifères montrent des profils différents. Ainsi, p M3 et p M7 sont des phages à ADN, tandis que p M11 n'a revelé aucune bande après digestion (Annexe 4). Le phage p T4 a été positif pour la digestion aux enzymes de restrictions (Figure 7 et Annexe 4 ; Tableau XI).

Les concentrations d'ADN obtenus après l'extraction, la purification ont varié de 8,41 à 445 ng/uL, avec une moyenne de 276,18 ng/uL (Tableau XI).

Puits1: (p Ebrios ; Puits 2 : (p A5a ; Puits 3 : (p M3 ; Puits 4 : (p M7 ; Puits 5 : (p M11.

Désignation du Phage	Concentration des Acides Nucléiques (ng/uL)	Digestion enzymatique (XbaI/XmnI)	Type Génome (ADN/ARN)
(p T4c	46,90	+/+	dsDNA
(p T4b	8,41	+/+	dsDNA
(p Ebrios	265	+/+	dsDNA
(p A5a	369	+/+	dsDNA
(p M3	445	+/+	dsDNA
(p M7	356	+/+	dsDNA
(p M11	443	-/-	ND

+/+ : Profil de restriction positif d'une digestion enzymatique par XbaI et XmnI, -/- : Profil de restriction négatif de la digestion enzymatique par XbaI et XmnI.

1.2.Analyse du profil génomique par la méthode en champ pulsé

1.2.1. Analyse du profil génomique généré par XbaI

Après la digestion des phages avec l'enzyme XbaI, les résultats ont montré une diversité entre les 5 phages de cette étude (Figure 8, Annexe 2), 10 bandes au niveau du phage ö M7, 9 bandes pour les phages ö T4c et ö M11 ont été observées. Par contre avec les phages ö Ebrios et ö A5a, aucune bande n'a été observée.

Une analyse par le logiciel BioNumérics (Applied Maths vesion 7.6 de 2017) a permis l'obtention de dendogramme (Figure 9).

Figure 8 : Électrophorèse en champ pulsé de bactériophage digéré par l'enzyme de restriction XbaI

M1 : marqueur de poids moléculaire spécifique du PFGE (0.13-194 kb) ; M : marqueur de poids moléculaire GeneRuler 1 kb DNA Ladder;

Puits 1 : p T4b ; Puits 2 : p T4c ; Puits 3 : p A5a ; Puits 4 : p A5a ; Puits 5 : p Ebrios ; Puits 6 : p M3 ; Puits 7 : p M3 ; Puits 8 : p M7, Puits 9 : p M7 ; Puits 10: p M11 ; Puits 11: p M11.

Figure 9 : Dendrogramme généré par le logiciel Bionumerics® avec l'enzyme XbaI

Elle montre la distance calculée par l'indice de similarité de Jaccard, des profils PFGE des phages isolés par l'enzyme XbaI. Le degré de similarité (%) est indiqué.

1.2.2 Analyse du profil génomique généré par XhoI

Après l'analyse du profil de restriction de l'enzyme XhoI (Figure 10, Annexe 3), 16 bandes au niveau du phage p M11, 15 bandes pour le phage p T4, 14 bandes pour les phages p M3 et p M7 et enfin 13 bandes pour le phage p A5a ont été observées. Cependant aucune bande n'a été observée au niveau du phage Ebrios. Le profil PFGE des deux enzymes XbaI et XhoI a montré que les phages p T4, p A5a, p M3, p M7et p M11 ont tous une taille supérieure à 164 Kb.

Les pulsotypes générés par XbaI présentant un dendrogramme sur la Figure 9 ont montré entre eux des similarités comprises entre 73 et 99 % ; ceux générés par XhoI présentés sur la Figure 11 ont présenté entre eux des similarités comprises entre 40 et 96 %. Cela implique que les profils de restrictions des phages sélectionnés sont différents entre eux.

Figure 10 : Électrophorèse en champ pulsé des génomes de bactériophages après digestion par XhoI

M1 : marqueur de poids moléculaire spécifique du PFGE (0.13-194 kb) et M2 : marqueur de poids moléculaire 1 kb ; Puits 1: (p T4c ; Puits 2: (p T4c ; Puits 3: (p T4 b ; Puits 4: (p T4 b ; Puits 5: (p A5a ; Puits 6: (p A5a ; Puits 7: (p M3 ; Puits 8: (p M3 ; Puits 9: (p M7 ; Puits 10: (p M7 ; Puits 11: (p M11 ; Puits 12: (p M11 ; Puits 13: (p Ebrios.

Figure 11 : Dendrogramme généré par le logiciel Bionumerics® avec l'enzyme XhoI

Elle montre la distance calculée par l'indice de similarité de Jaccard, des profils PFGE des génomes de phages fragmentés par XhoI. Le degré de similarité (%) est indiqué.

1. Discussion

La digestion enzymation a permis de mettre en evidence les différences entre les phages étudiés. Ainsi, une absence de bande d'ADN se justifirait soit par l'incapacité de digérer l'ADN des phages par les enzymes XmnI et XbaI qui pourrait être due à l'absence de sites cibles pour l'enzyme de restriction testée, soit par une perte de fragment de petites tailles lors de l'électrophorèse, soit par une faible concentration d'ADN où encore lors de l'extraction de l'ADN génomique. Cette hypothèse a été rapportée par certains auteurs qui pourrait être probablement due à une dégradation de l'ADN durant le processus (Wong et al., 2004) ou à sa méthylation (Xydas et al., 1996).

En effet, l'analyse du profil de restriction des phages ö T4 et ö Ebrios a montré que leurs génomes sont supérieurs à 10000 Kbp. Le matériel génétque de ces phages est du type ADN double brin. Ces résultats confirment des travaux antérieurs pour les phages ö T4 et ö Ebrios avec des génomes respectifs de 168903 bp et 39 752 pb (Szermer-Olearnik et Boratyñski, 2015 ; Ngazoa-Kakou et al., 2018). Par contre les phages ö A5a, öM3, öM7 montrent des profils dont le génome est également supérieur à 10000 Kbp. Plusieurs études ont montré la caractérisation moléculaire grace aux enzymes de restriction des phages à Pseudomonas aeruginosa (Kumari et al., 2009 , Essoh et al., 2015), Salmonella enterica (Lappe et al., 2009), et klebsiella pneumoniae (Hsu et al., 2013).

Enfin, la non-reconnaissance des sites de restriction de l'enzyme démontre la limite de la méthode pour les phages à ADN double brin.

L'électrophorèse en champ pulsé est une électrophorèse sur gel d'agarose utilisant des champs électriques alternés. Les changements de direction des molécules en fonction de leur structure tridimensionnelle durant la migration font varier leur distance totale de migration (Lai et al., 1989). L'électrophorèse en champ pulsé sur gel d'agarose a connu un important essor parmi les techniques d'étude des génomes (Safa et al., 2005). Cette technique utilise des enzymes de restrictions pour générer des profils typiques à chaque souche bactérienne où phagique. L'utilisation des enzymes supplémentaires dans le PFGE permet d'offrir une meilleure discrimination possible des modèles les plus faciles à interpréter d'où l'intérêt pour nous d'utiliser le XbaI et le XhoI.

Les résultats obtenus dans cette étude sont similaires aux travaux antérieurs de Clokie et Kropinski, 2009, qui a utilisé les gros coliphages purifiés dans l'optimisation de l'électrophorèse en champ pulsé sur gel d'agarose. En effet, les résultats obtenus par le PFGE ont été analysés par le logiciel Bionumerics®, il nous a permis d'estimer la taille du génome des phages ö A5a, ö M3, ö M7, ö M11 et

ö T4 qui est supérieure à 164 Kb. Le phage Ebrios n'a aucune bande concernant les deux enzymes de restrictions utilisées. Cela s'expliquerait par une absence totale de molécules d'ADN, ce qui signifierait que les molécules d'ADN ont été dégradées ou détruites où soit par une insuffisance de molécules d'ADN due à la méthode de concentration et de purification des phages utilisant le PEG et le NaCl.

Cette absence de bande pourrait être due également par une incapacité de l'endonucléase a dégradé la molécule d'ADN où encore une absence de sites de restriction. Cette notion d'absence de bande a été rapportée par certains auteurs qui pourrait être probablement dû à une dégradation de l'ADN durant le processus (Wong et al., 2004) ou à sa méthylation (Xydas et al., 1996).

En effet, des différences entre les phages ont été obtenues par les profils de restriction PFGE par rapport à la méthode de digestion enzymatique. Le PFGE a un pouvoir discriminant plus élevé que la digestion enzymatique. De plus, la PFGE peut s'avérer longue à mettre en oeuvre et souffre d'un manque de reproductibilité inter- (voire intra-) laboratoires. Ainsi, le pouvoir discriminant du PFGE a été soutenu par (Hsu et al., 2013 ; Czajkowski et al., 2015 ; Krasowska et al., 2015 ; Wang et al., 2016) caractérisant le génome de nouveaux phages lytiques comme candidats potentiels pour la phagothérapie et le biocontrôle des aliments en industrie agroalimentaire.

D'autres travaux antérieurs ont étudié les différents facteurs influençant les résultats de l'électrophorèse en champ pulsé, incluant la préparation des plugs d'agarose, la lyse des cellules bactérienne ou phagique, la digestion enzymatique (Mulvey et al., 2001 ; Murchan et al., 2003 ; Zhang et al., 2007), ainsi que les paramètres électrophorétiques à savoir le temps total de migration, influençant la distribution des fragments de restriction dans le gel et donc influence le pouvoir discriminatoire de la technique

Conclusion et Perspectives

Ce travail a permis de caractériser 5 phages à savoir ö Ebrios, ö A5a, ö M3, ö M7, ö M11 par la digestion enzymatique et l'électrophorèse en champ pulsé, de produire des élements de connaissance sur le type de matériel génétque de ses phages ainsi que la taille du génome par des profils de restriction. L'analyse de ses profils obtenus a permis de mettre en evidence des différences entre les phages. Cela a permis de démontrer la diversité génétique entre les phages étudiés.

Il en résort que le PFGE s'est avéré être une méthode plus sensible que la digestion enzymatique pour la caractérisation des phages au vue des résultats rapportés. Il a révelé plus de bandes discriminantes que la digestion enzymatique. Le PFGE et la digestion enzymatique sont deux méthodes dépendantes. La digestion enzymatique des phages est simple et rapide et pourrait être excellente dans la mise en oeuvre en première intention de la discrimination des contraintes.

En définitive, les profils de restriction du PFGE et de la digestion enzymatique permettent de comparer plusieurs échantillons ; cependant, ils ne donnent malheureusement pas accès à l'information génétique en tant que telle.

En perspectives, il serait intéressant de poursuivre ce travail de recherche afin de réaliser l'étude des gènes d'intéret par PCR suivie de séquençage à haut débit (NGS) afin de fournir de précieuses informations sur la diversité de ces gènes.

Ce type d'information pourra à long terme permettre de réaliser la métagénomique afin d'avoir une meilleure compréhension sur la diversité génétique ainsi que la composition de ses phages.

Le monde étant actuellement confronté aux infections nosocomiales difficiles à traiter, les bactériophages représentent une alternative intéressante et un potentiel médicinal naturel offrant une panoplie d'applications relativement peu coûteuses, permettant de répondre en toute sécurité à la lutte antibactérienne.

Il serait important de caractériser des phages comme candidats potentiels à la phagothérapie.

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Annexes

Annexe 1 : Les Protéines Phage T4 dans la base de données (Miller et al., 2003).

Protéines	Description	Banque de données
AsiA	Anti- regulatory protein	1JR5, 1KA3
f3-gt	f3 Glycosyltransférase	1QKJ
DenV	Pyrimidine-dimer excisionase	2END, 1VAS
gpe	Lysozyme	1LYD
I-TevI	Intron-homing endonuclease	1I3J
MotA	Transcription regulatory factor	1BJA, 1I1S
NrdC	Glutaredoxin, thioredoxin	1ABA, 1DE1
NrdD	Anaerobic NTP reductase, large chain	1H77
RegA	Translation regulatory protein	1REG
Rnh	RNase H	1TFR
TS	Thymidylate synthase	1TIS
Wac	Fibritin deletions E and M	1AAO, 1AVY
gp1	dNMP kinase	1DEK
gp5/27	Tail-associated lysozyme	1K28
gp9	Long-tail fiber connector	1QEX
gp11	Baseplate-short-fiber connector	1EL6
gp12	Short tail fiber	1H6W
gp31	Cochaperone	1G31
gp32	ssDNA-binding protein	1GPC
gp42	dCMP-hydroxymethylase	1B5D
gp43	T4 DNA polymerase fragment, RB69, DNA polymerase	1NOY, 1WAF
gp45	Processivity clamp	1CZD
gp49	EndoVII	1E7D
gp59	Helicase assembly protein	1C1K
nrdD intron	Group IA intron RNA/ribozyme	1SUN

Annexes

Annexe 2 : Electrophorèse en champ pulsé (PFGE) de bactériophage digéré par l'enzyme de restriction XbaI.

Puits 1 : marqueur (PFGE low range DNA approximately 0.13-194 kb), Puits 2 : p T4b Puits 3 : p T4c, Puits 4 : p A5a, Puits 5 : p A5a, Puits 6 : p Ebrios, Puits 7 : p Ebrios, Puits 8 : marqueur (PFGE low range DNA Marker in agarose plugs), Puits 9 : p M3, Puits 10 : p M3, Puits 11 : p M7, Puits 12 : p M7, Puits 13 : p M11, Puits 14 : p M11, Puits 15 : marqueur (PFGE low range DNA Marker in agarose plugs).

Annexe 3: Electrophorèse en champ pulsé (PFGE) de bactériophage digéré par l'enzyme de restriction XhoI.

Puits 1 : marqueur (PFGE low range DNA Marker in agarose plugs), Puits 2 : p T4c, Puits 3 : p T4c, Puits 4 : p T4b, Puits 5 : p T4b, Puits 6 : p A5a, Puits 7 : p A5a, Puits 8 : p M3, Puits 9 : p M3, Puits 10 : marqueur de poids moléculaire GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Puits 11 : p M7, Puits 12 : p M7, Puits 13 : p M11, Puits 14 : p M11, Puits 15 : p Ebrios.

Annexes

Annexe 4 : Profil de digestion des phages par les enzymes de restrictions XbaI et XmnI

Puits 1: p M7 ; Puits 2 : p M3 ; Puits 3 : p M11 ; Puits 4 : p Ebrios ; Puits 5 : p T4 ; Puits 6 : p A5a ; Puits 7 : p M7 ; Puits 8 : p M3 ; Puits 9 : p M11 ; Puits 10 : p Ebrios ; Puits 11 : p T4 ; Puits 12 : p A5a.

RÉSUMÉ

Les bactériophages ou phages sont les virus des bactéries et ont la capacité de lyser celles-ci. Cette action lytique fait des phages une alternative thérapeutique appelée phagothérapie face à l'antibiothérapie. L'utilisation abusive de l'antibiothérapie cause aujourd'hui une recrudescence mondiale de la résistance bactérienne aux anti-infectieux disponibles. En Côte d'Ivoire, les bactéries multirésistantes sont rapportées dans les études cliniques et environnementales. La phagothérapie méconnue du corps médical professionnel et des populations. Des études récentes ont rapporté la présence de phages à potentiel thérapeutique mais aucune application n'est rapportée. La mise au point de la phagothérapie nécessite une caractérisation morphologique et génomique complète des phages à potentiel lytique. L'objectif de déterminer le profil génomique de bactériophages isolés en Côte d'Ivoire. Spécifiquement d'analyser leur génome par la technique de l'électrophorèse en champ pulsé et par la digestion enzymatique. 5 phages dont 2 phages lagunaires de la Lagune Ebrié (p A5a, Ebrios) et 3 phages (M3, p M7, p M11) isolés des micromammifères ont été inclus dans cette étude. Les enzymes XbaI, XmnI et XhoI ont été utilisés pour la digestion des génomes. Les résultats obtenus montrent que les phages sont des phages à ADN double brin. L'analyse en champ pulsé montrent que les phages p A5a, p M3, p M7, p M11 ont une taille de génome est supérieure à 164 Kpb. La diversité génomique des phages est démontrée par les profils de restriction de l'électrophorèse en champ pulsé et de la digestion enzymatique. Cette étude montre que l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE) est une méthode plus sensible que la digestion enzymatique pour la caractérisation génomique. Par contre la digestion enzymatique des phages est simple et rapide et pour déterminer le type de matériel génétique des phages.

Mots clés : Bactériophages, Diversité génétique, champ pulsé, Digestion enzymatique, Cote d'Ivoire.

ABSTRACT

Bacteriophages or phages are the viruses of bacteria and have the ability to lyse them. This lytic action makes phages a therapeutic alternative called phagotherapy against antibiotic therapy. The misuse of antibiotic therapy is now causing a worldwide resurgence of bacterial resistance to available anti-infectives. In Côte d'Ivoire, multiresistant bacteria are reported in clinical and environmental studies. The unknown phagotherapy of the professional medical profession and populations. Recent studies have reported the presence of phages with therapeutic potential, but no application is reported. The development of phage therapy requires complete morphological and genomic characterization of phages with lytic potential. The objective of determining the genomic profile of isolated bacteriophages in Ivory Coast. Specifically, to analyze their genome by the technique of pulsed field electrophoresis and enzymatic digestion. 5 phages including 2 lagoon phages of the Ebrié Lagoon (p A5a, Ebrios) and 3 phages (M3, p M7, p M11) isolated from the micromammals were included in this study. XbaI, XhoI and XmnI enzymes have been used for digestion of genomes. The results obtained show that the phages are double-stranded DNA phages. Pulsed field analysis shows that phages p A5a, p M3, p M7, p M11 have a genome size greater than 164 Kpb. The genomic diversity of phages is demonstrated by the restriction profiles of pulsed field electrophoresis and enzymatic digestion. This study shows that pulsed field gel electrophoresis (PFGE) is a more sensitive method than enzymatic digestion for genomic characterization. On the other hand, the enzymatic digestion of the phages is simple and fast and to determine the type of phage genetic material.

Keywords: Bacteriophage, Genetic diversity, PFGE, Enzymatic digestion, Ivory Coast.