IV.1.4.2 Isolement de souches bactériennes
solubilisatrices de phosphate sur les boites de pétri
L'isolement s'est fait en trois étapes : une
pré-culture, une sélection et une purification des souches
bactériennes sur le milieu PVK.
· Pré-culture : 100 ul de la suspension
de chaque dilution (10-1 à 10-6) de sol sont
utilisés pour ensemencer les microplaques contenant le milieu PVK
liquide pendant 7 jours d'incubation. Après l'incubation, un lecteur de
microplaque est utilisé pour déterminer au
spectrophotomètre les DO à 620 nm le nombre de puits positifs,
correspondant à l'apparition d'un trouble bactérien. Les
résultats sont traités par un programme statistique
déterminant le Nombre le Plus Probable (NPP) de bactéries
présente dans l'échantillon qui est exprimé en UFC (nombre
d'Unités Formant Colonies) / g de sol sec.
· Sélection : après 7 jours
d'incubation à 30°C sur le milieu PVK liquide, les puits positifs
des plus faibles dilutions sont prélevés pour réensemencer
les boites de pétri contenant le milieu PVK solide contenat du bleu de
Bromophenol. Après 7 jours d'incubation, les souches sont
sélectionnées et isolées selon leur diversité
morphologique. La distinction morphologique des colonies s'est basée sur
des critères décrit par Sharna et al (2011). Il s'agit
de la forme, la couleur de la colonie, l'aspect, le diamètre de colonies
et des halos de solubilisation, puis l'indice de solubilisation (Figure13).
En effet, l'apparition d'un halo (zone claire) transparent autour
des colonies en croissance détermine la solubilisation du phosphate
(Figure13 et Figure 14), due à la présence d'acides produits par
les BSP. Ainsi, le diamètre de la colonie et du halo qui l'entoure sont
mesurés, puis l'indice de solubilisation (IS) est calculé par la
formule suivante :
IS =
Diamètre de la colonie + Diamètre de
Halo
Diamètre de la colonie
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Halo de dissolution Colonie bactérienne
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Figure 13 : Microplaque ensemencée
présentant un halo de solubilisation autour d'une colonie.
Figure 14 : Microplaque témoin non-ensemencée
? Purification : Les isolats ayant un IS >2 sont
sélectionnés puis réutilisés pour
réensemencer à nouveau des boites de pétri contenant le
milieu PVK solide (Figure 14). Cette procédure est
répétée cinq (05) fois jusqu'à l'obtention de
souche bactériennes pures. La souche ayant l'indice de solubilisation le
plus élevé a été utilisée pour la mise en
place de notre expérimentation.
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