IV.1.3 Préparation des milieux de culture
Le milieu gélosé utilisé pour la culture
des souches bactériennes sur milieu solide, a été
préparé à partir de 8 g d'Agar stérile dissous dans
1L d'eau distillée. La solution ainsi obtenue a été
ensuite homogénéisée et stérilisée à
l'autoclave à 115°C pendant 30min. Après refroidissement, la
solution gélosée a été transvasée dans les
boîtes de Pétri (Figure 11 et Figure 12) et laissée
à l'air libre jusqu'à solidification.
Le milieu NB, constitué de 8 g Nutrient Broth (NB)
Difco TM et de1000 ml d'eau ultra pure, additionné de nystatine, est
utilisé pour la culture des souches bactériennes et la
détermination de la microflore totale aérobie.
Le milieu Pikovskaya's (PVK) liquide (Figure 12) est
utilisé pour le dénombrement des microorganismes solubilisateurs
de phosphate (MSP), est constitué de 10g de glucose ; 0.01g de sulfate
d'ammonium hydraté; 0.2g chlorure de potassium; 0.2g de Chlorure de
sodium; 0.1g de sulfate de magnésium heptahydraté ; 0.002g de
sulfate de manganèse monohydraté ; 0.002g de sulfate de fer
heptahydraté; 0.5 g d'extrait de levure ; 5g de Tricalcium de phosphate.
Le pH du milieu PVK obtenu est maintenu entre (7-7,2) puis autoclavé
à 115 °C pendant 30min. Pour le dénombrement des
bactéries solubilisatrices de phosphate, le milieu PVK stérile
est additionné de nystatine pour éliminer toute trace de
fongiques.
Le milieu Pikovskaya's (PVK) solide (Figure 12) de composition
identique au milieu PVK liquide mais additionné d'agar (15g), de
nystatine (2 gouttes) et de bleu de Bromophénol (0,025 g) est
utilisé pour l'isolement et la sélection des bactéries
solubilisatrices de phosphate (BSP).
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Figure 11 : Remplissage des boîtes de petri.
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Figure 12 : Milieu PVK liquide (A) et Milieu PVK solide
(B).
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IV.1.4 Recherche, isolement et sélection des
bactéries solubilisatrices de phosphate
La recherche de la microflore totale aérobie et la
microflore solubilisatrice du phosphate a été
réalisée en microplaque sur les milieux respectifs, NB et PVK
liquide à partir de 1g des sols de de plateau, dans 10 ml d'une solution
physiologique (NaCl).
IV.1.4.1 Préparation de l'inoculum,
ensemencement des microplaques et des boites de pétri
Les inoculas bactériens sont obtenus à partir de
la suspension initiale de sol dans un rapport sol/solution (1/10 g/ml). Des
dilutions successives de sol de 10-1 à 10-6 sont
réalisées pour ensemencer soit les microplaques à l'aide
d'une micropipette soit les boîtes de pétri à des billes
stériles. Chaque boîte de pétri ou microplaques contenant
les milieux de culture stériles reçoit 100 ìl de
suspension-dilution de sol avec 3 répétitions par dilution, et un
témoin non inoculé pour chaque ensemencement (Figure 13). Les
boîtes de pétri ou microplaques ainsi ensemencées sont
emballées avec du papier aluminium et mises à l'étuve
à une température de 30°C, à l'obscurité,
pendant 3 jours pour le milieu NB et 7 jours pour le milieu PVK. Après
incubation, un dénombrement des colonies et une numération des
types morphologiques observés sont effectués. La distinction
morphologique des colonies est basée sur des critères
macroscopiques de taille, forme, surface, contour, couleur de colonie,
formation de spores (forme et couleur), couleur de l'envers de la culture.
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