I.9.Analyses au laboratoire
I.9.1.
Prélèvement
Les échantillons de sang étaient
prélevés dans les différents centres de santé et
envoyés au Centre MURAZ. Ces échantillons étaient
reçus au Centre MURAZ sous forme de gouttes de sang total
séché sur papier filtre appelé Dried Blood Spot
(DBS), en anglais.
Figure 10:Exemple
d'échantillon valide de DBS
I.9.2. Préparation
des échantillons
Recueil des spots de sang à partir des DBS :
- A l'aide d'une perforeuse(PUNCHER) qui est nettoyée
après chaque échantillon avec du papier essuie tout imbibé
de désinfectant, découper un spot complet de la carte de papier
filtre pour chaque échantillon. Si le cercle est perforé,
utilisé une pince pour détacher la goutte de sang
séché ;
- Chaque spot est placé dans un S-tube en ajoutant 1100
ul de réactif de pré-extraction d'échantillons (SPEX)
- Les S-tubes sont placées dans un thermomixer pendant
10 minutes à 56°C
Figure
11 :Découpage des DBS avec PUNCHER (Centre
MURAZ).
I.9.3. Technique
d'extraction et d'amplification de l'ADN-VIH
v Principe du test
Le test qualitatif Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1, v2.0
est un test de diagnostic in vitro, d'amplification de l'acide
nucléique(AN) total destiné à la détection
qualitative de l'ADN et de l'ARN du HIV-1 dans les taches de sang
séché. Il est utilisé en association avec le
réactif de pré-extraction d'échantillons (SPEX) Cobas
AmpliPrep/Cobas TaqMan. Le test qualitatif Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1,
v2.0 s'appuie sur trois opérations principales :
Ø La préparation des échantillons dans le
but d'isoler les acides nucléiques du HIV-1 ;
Ø La transcription inverse de l'ARN cible pour produire
l'ADN complémentaire (ADNc) ; et
Ø L'amplification par PCR de l'ADN et de l'ADNc cible
en même temps que la détection des sondes de détection
d'oligonucléotides clivés, doublement marqués,
spécifiques de la cible et du contrôle interne (CI).
Le mode opératoire est d'écrit dans
l'annexe 2.
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