Caractérisation biochimique d'isoenzymes d'estérases au cours du processus germinatif des graines d'espèces annuelles du genre "médicago " pour la tolérance au stress salin

BioTechWorld 2007Colloque International sur les Biotechnologies"Quelles biotechnologies pour les pays du sud ?"24-25 Novembre 2007, Oran, Algérie

CARACTÉRISATION BIOCHIMIQUE D'ISOENZYMES D'ESTÉRASES AU COURS DU PROCESSUS GERMINATIF DES GRAINES D'ESPECES ANNUELLES DU GENRE MÉDICAGO POUR LA TOLÉRANCE AU STRESS SALIN.

AMOURI A**, FYAD-LAMECHE F.Z** et ABDELGUERFI A*. Laboratoire de Génétique et d'Amélioration des plantes. Département de Biologie. Faculté des Sciences. Université d'Oran-Es-Sénia. Oran**. INA El Harach. Alger*. [e-mail]

Résumé. L'activité des estérases qui est liée au stade physiologique et métabolique de la cellule, peut être affectée par les facteurs environnementaux tels que le stress salin. Pour cela, une étude a porté sur l'électrophorèse native et la révélation spécifique des isoenzymes d'estérases, chez deux écotypes appartenant à deux espèces différentes du genre Medicago, l'une tolérante (Tru 42) appartenant à l'espèce M.truncatula, et l'autre sensible (Pol 248) appartenant à l'espèce M.polymorpha. L'étude de la synthèse des isoenzymes d'estérases durant le processus germinatif des graines en conditions normales et durant le stress salin à différentes concentrations de salinité (0.4 %, 0.6 % et 0.8 %), a mis en évidence des variations quantitatives et qualitatives pour la synthèse de ces isoenzymes , entre ces deux écotypes, avec une cinétique d'apparition différente des nouvelles bandes, ce qui permettra la possiblité de localiser les QTLs en question.

Mots clés : Medicago - stress salin - germination - isoenzymes - estérases.

Abstract. The activity of the esterases wich is related to the physiological and metabolic stage of the cell, can be affected by the environmentals factors such as the salt stress. For that, a study was carried on the native electrophoresis of the isoenzymes of the esterases, on two ecotypes from two different species of Medicago, the tolerant (Tru 42) from M.truncatula and the sensitive one (Pol 248) to M.polymorpha. The study of the synthesis of the esterases isozymes during the germinatif process of seeds under normal and stress condition with different salt concentration (0.4?, 0.6 ? and 0.8 ?), showed a relationship between quantitative and qualitative variation of isoenymes patterns of the two ecotypes and the stress variation application, with a different apparition of new bands. This study will allow the possibility to locate the QTLs in question.

Keys words: Medicago - salt stress - germination - isoenzymes - esterases.

Introduction

L'activité des estérases qui est liée au stade physiologique et métabolique de la cellule, peut être affectée par les facteurs environnementaux tels que la température de culture, le stress hydrique, le stress salin et les agents polluants. Les estérases (E.C.3.1.1.2) EST, appartiennent au groupe des hydrolases. Au cours de la germination des graines (oléagineuses, amylacées et protéagineuses), il y a mobilisation des réserves par différentes hydrolases, lipases et /ou protéases dans une chronologie qui reste à déterminer (Khemiri.H et al., 2004). Le présent travail, a pour but de rechercher un éventuel marqueur isoenzymatique pour la tolérance au stress salin chez deux écotypes appartenant à deux espèces différentes du genre Medicago, l'une tolérante (Tru 42), et l'autre sensible (Pol 248). Le choix de ces deux écotypes n'est pas fortuit car ces résultats ont été obtenus après une étude biométrique (germination des graines et croissance de jeunes plantules) parmi six écotypes appartenant à des espèces différentes de Medicago (M.truncatula, M.polymorpha et M.ciliairis), sous différentes concentrations de salinité (0.4 %, 0.6 % et 0.8 % NaCl) (Amouri A et Fyad-Lameche F.Z., 2005).

Matériels et méthodes:

Matériel végétal :

Un lot de graines de deux écotypes appartenant à des espèces annuelles du genre Medicago (Tru 42 et Pol 248) fournis par l'INA El Harach (Alger), sont désinfectées, scarifiées puis ensemencées dans quatre boites de petri, tapissées de papier filtre. Les graines de la boîte témoin pour chaque écotype sont imbibées d'eau distillée et les graines des trois autres boites traitées sont imbibées d'une solution NaCl à différentes concentrations (0.4, 0.6 et 0.8 %). la germination des graines des boites témoins et traitées se déroule à l'obscurité et à 27°C #177; 1, après neuf jours d'imbibition.

Préparation des extraits isoenzymatiques d'estérases

En conditions normales, l'extraction est faite d'une façon journalière pendant les neuf jours d'imbibition. Pour les graines traitées, l'extraction est faite directement après neuf jours sous différentes concentrations en NaCl (0.4, 0.6 et 0.8 %). L'extraction est menée à froid dans un mortier en présence de sable et de tampon Tris-Kcl, pH=7, les extraits sont soumis ensuite à une centrifugation à froid (4°C) pendant 20 mn, à une vitesse de 13000 tours/ mn. La conservation des extraits a lieu dans un cryoconservateur contenant de l'azote liquide.

Electrophorèse native sur gel de polyacrylamide :

La migration s'effectue sur un gel continu de polyacrylamide à 8%, dans du tampon Tris Borate EDTA (TBE) pH= 8.3. Le tampon cuve est constitué de tampon gel dilué 10 fois. La migration se déroule à 5°C pendant 6 h sous une intensité constante de 30 mA et une tension de 150 V. La révélation s'effectue dans une solution contenant du Na2HPO4, 0.1M à pH=6.2, après l'ajout d'un substrat á naphtyl butyrate 1% mélangé avec de l'acétone et du Fast Blue RR salt. Après révélation les gels sont séchés et conservés.

Résultats

Analyse des profils électrophorètiques d'isoenzymes d'estérases :

Les figures 1-a et 1-b, représentent les zymogrammes du système Estérase chez l'écotype tolérant (Tru 42) sous différentes concentrations en NaCl. Les différents dépôts de j1 à j9 correspondent à des extraits de jeunes plantules témoins après un jour d'imbibition jusqu'au neuvième jour après imbibition. Les dépôts T1, T2 et T3 correspondent à des extraits de plantules traitées durant neuf jours sous différentes concentrations en NaCl (0.4, 0.6 et 0.8 %) respectivement.

Les figures 2-a et 2-b, représentent aussi les zymogrammes du même système enzymatique chez l'écotype jugé sensible (Pol 248) sous différentes concentrations en NaCl citées ci dessus.

Les bandes sont identifiées par leur Rf respectif, ainsi que leur intensité. Chaque écotype possède son propre profil et des bandes qui lui sont spécifiques

Chez l'écotype tolérant (Tru 42) :

Afin de faciliter l'interprétation de ces différents profils eléctrophorètiques, nous avons notés les bandes comme suit :

Bande 1 : rf (0.35-0.4), Bande 2 : rf (0.47-0.5), Bande 3 : rf (0.60), Bande 4: rf (0.65-0.67), Bande 5: rf (0.85-0.90).

Chez l'écotype sensible (Pol 248) :

Nous avons aussi notés les bandes comme suit : Bande 1 : rf (0.15), Bande 2 : rf (0.22), Bande 3 : rf (0.27-0.3), Bande 4: rf (0.4), Bande 5: rf (0.5), Bande 6: rf (0.7), Bande 7: rf (0.8), Bande8:rf (0.85).