7- Estimation du degré de pureté
d'ADN
La mesure de la DO à 280 nm sert à
détecter les éventuels contaminants. La pureté de
l'échantillon est testée par comparaison des DO à 260 nm
et à 280 nm et cela pour détecter toute contamination
protéique. Ainsi les protéines absorbent à 280 tandis que
l'ADN absorbe à 260nm. Une préparation d'ADN est dite pure si
elle présente un rapport de DO 260/DO 280 entre 1.4 et 1.7.
8- Préparation des dilutions d'ADN
C'est une étape pré-PCR. On fait diluer un
volume de la solution mère d'ADN dans de l'eau bidistillée afin
d'obtenir une concentration finale de 100 ng/ul. Cette concentration est
optimale pour les réactions d'amplification moléculaire.
Dans le but de faire le
génotypage des cinq systèmes HPAs, six couples d'amorces (sens et
anti-sens) ont été utilisés : un couple d'amorces
pour amplifier une région du gène HGH, les autres pour amplifier
les régions spécifiques sont complémentaires à la
séquence à amplifier. Toutes ces amorces sont de type
séquences spécifiques (SSP), elles sont capables de
détecter les versions alléliques des différents
gènes codants. Dans notre étude, la Taq a été
diluée dans le tampon 1X a partir d'une solution mère dont la
concentration est de 5 U/ ul.
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