2- Lyse des leucocytes
Au culot des blancs, on ajoute 600 ul de (SLB : tris-HCl
10mM pH 7,5 ; EDTA-Na2 10 mM ; NaCl 50 mM ; SDS 0,2%)
pour la micro méthode afin de solubiliser les membranes des leucocytes
et de la protéinase K à raison de 20 mg/ml. La suspension
obtenue, fortement agitée, et incubée une nuit à 42°C ou 3
heurs à 56°C sous agitation. Après refroidissement à
température ambiante, on ajoute à l'extrait 200 ul du NaCl (6
M).
3- Précipitation des protéines
La suspension obtenue est vortexée vigoureusement
jusqu'à avoir un aspect laiteux. Cette dernière est par la suite
centrifugée 30 mn à 15000 trs/mn afin de précipiter les
protéines. On obtient ainsi une phase inférieure organique
contenant les débris (protéines, lipides...), une phase
supérieure aqueuse contenant l'ADN et l'interface contient en
majorité des protéines et peu l'ADN. Le surnageant, contenant
l'ADN dispersé, est récupéré dans un tube de 5
ml.
4- Précipitation de
l'ADN
On ajoute un volume égal d'éthanol à
haute force ionique (95%) au surnageant récupéré
précédemment. On laisse l'ADN se précipiter par agitation
douce en retournant délicatement le tube jusqu'à ce que les
filaments d'ADN forment une méduse; on récupère l'ADN dans
un tube Eppendorf (0,5 ml) ; la méduse d'ADN ainsi condensée
est lavée 3 fois à l'éthanol 70% afin d'éliminer
les traces de sels : à chaque lavage, ajouter 1 ml l'éthanol
70% afin d'éliminer les traces de sel et elle est séchée
dans un lyophilisateur pendant 30 mn.
5- Dissolution de l'ADN
L'ADN séché est solubilise dans un volume d'eau
distillée qui sera choisi en fonction de la taille de la méduse.
Cette solubilisation nécessite une agitation continue pendant une nuit a
42 °C. Après dissolution complète, la DO de la solution d'ADN
obtenu est mesurée à 260 nm et à 280 nm afin de
déterminer la concentration et la pureté de l'ADN extrait. L'ADN
dissout peut être conservé à +4°C pendant quelques jours ou
à - 20°C pour une conservation à plus long terme. D'ailleurs,
l'ADN pure se conserve à - 20 °C, plus de 10 ans.
6- Estimation de la concentration de l'ADN
La méthode de spectrophotométrie est
utilisée pour une quantification précise de l'ADN. Ainsi, la
concentration en ADN est déterminée par mesure de la DO au
spectrophotomètre à la longueur d'onde de 260 nm pour des
solutions diluées au 1/50 ou 1/100, sachant que l'ADN a un spectre
d'absorption en UV maximum à 260 nm. Ce spectre d'absorption est
proportionnel à la concentration de l'ADN (une unité de
densité optique (DO) à 260 nm correspond à 50ug d'ADN
double brin ou à 25ug ADN ou d'ARN simple brin par ul) en tenant compte
de la dilution réalisée.
L'estimation de la concentration de l'ADN est
déterminée selon la formule suivante :
1 unité de DO
50 ng d'ADN
N unités de DO
50 × N ng d'ADN
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[ADN] = DO 260 × facteur de dilution ×50 en
ng/ul
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