III.4.2 Méthodes de Typage
moléculaire
Plusieurs techniques de typage des systèmes
plaquettaires HPAs basées sur l'étude de l'ADN ont
été développées (Drzewek. K et al., 1998; Seo.
D. H et al., 1998; Liu T.C et al., 2002). Contrairement aux
méthodes décrites ci dessus ces méthodes de typage
décrivent le polymorphisme au niveau de l'ADN. L'introduction de la PCR
(Newman. P. J et al., 1989; Arlet., 2003) a rendu la
technique de typage moléculaire directe et rapide. Pour surmonter les
limites des testes de phénotypage HPA sérologiques, plusieurs
techniques basées sur l'ADN sont valables (Meyer. O et al., 1999;
Kretzschmar. E. 2001).
La plupart des techniques basées sur la PCR ont
été développées pour étudier les SNPs
responsable des HPAs (Hurd. C. M et al., 2002).
· La
PCR-RFLP
La PCR-RFLP (Newman. P. J et al., 1989; Chen. C. H et al.,
2004), est la première technique PCR utilisée (Von Dem
Borne et Decany., 1990; Carl. B et al., 2000; Shih. M. C et al., 2003).
C'est une méthode fiable, sensible et facile à
exécuter (Hatzidimitriou Gr. Zoulas D et al., 2001).
Elle permet d'identifier le polymorphisme au niveau des sites
de restriction des endonucléases au niveau de l'allèle. L'ADN,
est digéré par des enzymes de restriction. La coupure de l'ADN se
fait en un site particulier reconnu par l'enzyme, il existe alors un
polymorphisme de restriction allèle spécifique. Chaque enzyme
reconnaît une séquence d'ADN qui lui est spécifique. Les
enzymes de restrictions appartiennent à la classe des
endonucléases, elles sont capables de cliver les liaisons phosphodiester
entre deux nucléotides à l'intérieur d'un acide
nucléique. Pour les deux variants alléliques HPA-a et HPA-b, elle
consiste en une amplification moléculaire de la région polymorphe
du gène codant. Le produit d'amplification est soumis à une
digestion enzymatique. Le produit de digestion est visualisé sur un gel
de polyacrylamide afin de déduire le génotype correspondant.
Selon le nombre de bandes générées, il y
aura la déduction de l'allèle existant puis le génotype du
sujet en question.
· La
PCR-ASA
On l'appelle aussi PCR-SSP ou PCR-ASP; c'est la technique de
choix de typage plaquettaire. Cette technique est bien adaptée à
l'urgence et aux petites séries (Metcalfe. P et Waters. A. H. 1993;
Skogen. B et al., 1994; Kjaer et al., 2002). La PCR-SSP est
utilisées pour la première fois pour le typage des
antigènes HLA (Olerup et Zetterquist., 1992; Hato. T. M. D et al.,
1997), pour le groupage érythrocytaire (Lee et al., 1995;
Cavanagh. G et al., 1997) et récemment pour le typage des
systèmes HPAs (Cavanagh. G et al., 1997). Elle a l'avantage
d'être sensible, rapide, (Kroll. H et al., 2001a) de pouvoir
faire l'amplification de tous les systèmes en même temps
(Klüter. H et al., 1996; Lyon et al., 2002). La simplicité
et l'exactitude de cette méthode chez les malades et les donneurs
recommandent son application répandue.
Cette technique est basée sur le principe que
l'amplification par la Taq Polymérase, elle n'est effective que lorsque
l'amorce est parfaitement complémentaire de la séquence de l'ADN
cible. Les couples d'amorces sont définis pour être
spécifiques d'un seul allèle. Dans des conditions très
précises de PCR, le couple d'amorces spécifiques permet
l'amplification des séquences cibles (résultat positif), tandis
que les couples d'amorces non complémentaires ne donnent pas
d'amplification (résultat négatif). Après la PCR, les
fragments d'ADN amplifiés sont séparés par
électrophorèse sur un gel d'agarose et visualisés par
coloration avec le BET sous lumière UV. L'interprétation des
résultats PCR-SSP est basée sur la présence ou l'absence
de fragment spécifique amplifié. C'est pourquoi un couple
d'amorces de contrôle interne est intégré dans chaque
réaction PCR. Ce couple d'amorces témoin amplifie une
région conservée du gène de l'hormone HGH humaine par
exemple qui est présente dans tous les échantillons d'ADN et
permet de vérifier l'intégrité de la réaction PCR.
· La
PCR-SSCP
La PCR-SSCP, est une technique très performante de
génotypage moléculaire des systèmes plaquettaires. Cette
technique est caractérisée par sa rapidité et sa
sensibilité, simplicité comme elle est applicable pour une large
série (Fujiwara. K et al., 1995). Par comparaison à la
PCR-SSP. Elle repose sur le principe suivant : lorsqu'un segment d'ADN
double brin est dénaturé par la chaleur, puis refroidi
brutalement, les brins restent séparés. Si on les soumet ensuite
à une électrophorèse non dénaturante dans un gel de
polyacrylamide faiblement réticulé, chaque brin se
renaturé sur lui-même, et prend une conformation spécifique
conditionnant sa migration électrophorétique. Une variation de
séquence aussi minime qu'une mutation ponctuelle peut se manifester par
cette différence de conformation.
· La
QRT-PCR
Historique
C'est en 1991 que Holland et al. Montrent que
l'activité exo nucléasique 5' 3' de l'ADN polymérase
de Thermus aquaticus peut être utilisée lors de la PCR pour le
clivage d'une sonde marquée, spécifique d'une séquence
cible. L'hybridation de la sonde crée un signal fluorescent
proportionnel aux produits de l'amplification.
En 1992, Higuchi et al. Mettent au point un système en
temps réel qui détecte les produits de PCR dès leur
accumulation. Ce système est base sur le marquage de l'ADN par le BET
qui a la propriété de s'intercaler dans la molécule
nouvellement synthétisée. La détection est possible
grâce a une camera CCD reliée a un logiciel informatique.
En 1993, Lee et al. Créent la sonde Taq man dont
l'hydrolyse par l'activité 5' 3' exonucléasique de la Taq
polymérase produit un signal émis vers une camera CCD
collectrice. Ce système apporte un énorme progrès par
rapport aux autres méthodes de PCR classique qui ne donnaient que des
valeurs approximatives de la quantité d'amplifiat à la fin de la
réaction
La technologie PCR Taq man
La PCR quantitative en temps réel exige seulement
les produits PCR standard et le matériel (Nauck. M. S et al., 1999;
Jone. D. C et al., 2003). Comme la PCR classique la PCR quantitative a le
même principe, sauf que cette deuxième méthode exige une
sonde interne en plus des deux amorces. La sonde est un oligonucléotide
complémentaire de l'un des brins de ;la séquence cible,
à laquelle elle s'hybride pendant la phase d'hybridation, aussi bien que
les amorces. Cette sonde est doublement marquée elle possède
à son extrémité 5' une molécule fluorescente
(reporter), et à son extrémité 3' un autre fluorochrome
(quencher). A l'état initial, aucune fluorescence n'est émise,
puisque la proximité du Quencher provoque un transfert d'énergie
de résonance du Reporter vers le Quencher, ce qui inhibe
l'émission du fluorochrome Reporter. Ensuite, si la séquence
cible d'ADN est présente, la Taq polymérase catalyse la
polymérisation à partir deux amorces hybridées sur les
deux brins d'ADN dénaturé.
Quand la Taq polymérase rencontre la sonde
hybridée elle la clive nucléotide après nucléotide
grâce à son activité 5' 3' exonucléasique.
La molécule Reporter est alors libérée, et sa fluorescence
devient détectable. Ainsi, à chaque cycle d'amplification, lors
de l'étape d'extension, une molécule de Repoter est
libérée pour chaque molécule d'ADN amplifiée. La
fluorescence est enregistrée en temps réel, individuellement pour
chaque tube réactionnel grâce à un réseau de fibres
optiques (faisceau laser) qui acheminent le signal émis vers une
caméra collectrice. Elle est normalisée par rapport à un
fluorochrome présent en quantité constante dans la
réaction.  Rn représente l'intensité de fluorescence émise.
 Rn = (Rn+) - (Rn-), Rn+ étant
l'intensité d'émission du Reporter/intensité
d'émission du Quencher, et Rn- le même rapport
mesuré avant la réaction PCR.
Chaque échantillon est caractérisé par
son cycle seuil Ct, c'est-à-dire le délai nécessaire pour
que la fluorescence dépasse un seuil fixe correspondant au nombre des
cycles de PCR á partir desquels se différencie la valeur
d'intensité de la fluorescence du bruit de fond.
Il est mesuré pendant la phase exponentielle de la
réaction lorsque les réactifs sont présents en
quantité non limitante, d'où la précision et la
reproductibilité de ces mesures.
Il a été démontré que le Ct est
inversement proportionnel à la qualité initiale d'ADN
cible : plus le Ct est faible plus le nombre de copies d'ADN cible
présent avant l'amplification est important.
Les avantages de la technologie Taq man
La spécificité de la technique dépend
bien de la région étudiée et du choix des amorces et de la
sonde, mais elle est accrue puisque la fluorescence n'est émise que si
la sonde est hybridée à la cible puis clivée lors de
l'extension. Cette technique est également théoriquement
très sensible. On parvient en effet à mesurer un cycle seuil pour
un échantillon très faible dont l'amplification commence
seulement en fin de réaction, alors qu'il aurait été
indécelable par une technique de quantification en point final.
Outre la spécificité et la sensibilité de
la quantification, les avantages majeurs de la technologie Taq man sont la
précision et la reproductibilité de la mesure, ainsi qu'une
très large gamme de détection.
Cette précision est dûe au fait à la
quantification de la séquence cible qui est déterminée par
le cycle seuil Ct calculé pendant la phase exponentielle de la
réaction et non pendant la phase stationnaire, comme c'est le cas dans
la PCR semi-quantitative classique ou la quantification des produits de la PCR
se fait a la fin de la réaction. La PCR quantitative en temps
réel est basée sur la détermination du Ct à partir
duquel la fluorescence devient détectable. Il a été
démontré de façon formelle que c'est ce cycle seuil qui
est dépendant de la quantité ou qualité d'ADN initial. A
tous ces avantages s'ajoute la rapidité.
Les applications de la PCR quantitative en temps
réelle
Cette technique possède un très large champ
d'application puisque tout ARN (avec une étape préalable de
transcription inverse) ou ADN cible d'intérêt peut être
aisément quantifié.
La technologie Taq man est déjà utilisée
avec succès dans des domaines très variés de la biologie,
particulièrement en virologie pour la mesure de la charge virale d'un
grand nombre de virus tels que le virus des Hépatites B et C ; en
bactériologie, pour quantifier l'amplification génique dans les
cancers de sein ; ou pour l'étude du polymorphisme.
La PCR quantitative est par ailleurs utilisée dans
l'étude de l'expression des gènes en général. C'est
une méthode idéale pour le diagnostic de routine et la
prévention des conditions clinique associées (mismatching) aux
HPAs. Elle peut être aussi utilisée dans l'étude des
populations et pour la recherche d'autres effets potentiels de ces
polymorphismes ; par exemple, leurs rôles comme antigènes
d'histocompatibilité dans la transplantation (Kekomaki. S et al.,
2001; Jone. D. C et al., 2003), leurs effets sur le fonctionnement des
intègrines et leurs associations possibles avec les maladies
cardio-vasculaire (Weiss. E. J et al., 1996; Zotz. R.. B et al., 1998;
Ardissino et al., 1999; Kroll. H et al., 2000; Mikkelsson. J et al., 2001;
Jone. D. C et al., 2003). Récente, cette technique à grande
sensibilité et à forte exigence peut être optimisée
pour fournir la résolution maximale à faible coût
et peut
être mise à jour pour inclure d'autres allèles HPAs de
faibles fréquences, aussi bien aux allo-antigènes plaquettaires
génétiquement caractérisés tel que le
système Gov (Schuh. A. C et al., 2002).
· Les
techniques de séquençage automatique
Cette technique permet d'obtenir directement la
séquence des gènes et de mettre en évidence des mutations
ponctuelles. Elle est utilisée pour détecter des nouveaux
systèmes HPAs (Santoso. S. A et al., 2006) en cas d'obtention
des produits PCR anormales de point de vue tailles d'amplicons. Comme elle peut
être utilisé pour faire l'alignement des séquences obtenues
avec un BLASTN (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), comparant
les séquences obtenues à toutes les séquences
nucléotidiques connues, déposées dans plusieurs banques de
données.
Il existe différentes méthodes de
séquençages, tel que la méthode de
séquençage enzymatique par les di-désoxynucléotides
développé à l'origine par Sanger et la méthode
chimique de Maxam et Gilbert.
Le séquençage repose sur le principe de
méthode de Sanger. Le marquage des fragments d'extension est
réalisé en 3' par l'incorporation de
di-déoxynucléotides triphosphates (ddNTPs) fluorescents. Son
principe est de réaliser, à partir d'un point fixe, des copies
incomplètes de la matrice d'ADN interrompues au hasard.
L'élongation de la chaîne est ainsi arrêtée à
cause de l'absence d'une extrémité 3' OH libre, ce qui aboutit a
l'obtention de fragments marqués de différentes tailles. On
utilise un mélange de 4 fluorophores correspondant chacun a une des
quatre bases.
Au cours de l'électrophorèse, la lecture se fait
en temps réel à travers une fenêtre de détection,
après extraction des fluorophores par un laser biochromatique. En effet,
la machine (séquenceur) intègre les données de migration
et les transforme en éléctrophorogrmmes sous forme de pic de
couleurs différentes et correspondant aux bases distinctes
![]()
OBJECTIFS
Dans la partie pratique de notre travail, nous nous
proposons :
1) D'étudier les bases moléculaires en
réalisant le génotype des systèmes plaquettaires HPA-1,
HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5 sur un échantillon de la population
Tunisienne.
2) D'estimer les fréquences géniques,
génotypiques et phénotypiques des systèmes plaquettaires
HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5 sur cet échantillon.
3) D'étudier l'équilibre de la population
tunisienne pour les loci des cinq premiers systèmes HPAs.
4) D'estimer les fréquences des associations
haplotypiques.
5) D'estimer le risque d'allo-immunisation chez notre
population.
6) De comparer les résultats trouvés avec ceux
rapportés dans la population tunisienne et d'autres populations.
| 
