II.2.2. METHODES
Sont présentés dans ce point, les
différentes méthodes utilisées pour réaliser cette
expérimentation.
II.2.2.1. Enquête
Un questionnaire semi-structuré a été
utilisé pour la récolte des donnés auprès des
tradipraticiens. Un consentement éclairé a été
obtenu par chaque tradipraticien avant l'enquête et une somme d'argent
était proposé aux tradipraticiens afin d'augmenter le taux de
participation et solliciter une décente sur terrain pour la
récolte d'un herbier (Marpsat & Razafindratsima, 2010).
Un rayon de 30 Km de Lubumbashi et ses environs ont
été considéré comme zone d'étude pour
l'enquête ethnobotanique durant une période de sept mois soit de
Janvier au Juillet 2021 (Amuri et al., 2017).
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II.2.2.2. Criblage phytochimique
Le criblage phytochimique a consisté à
rechercher des groupes chimiques notamment les alcaloïdes, les coumarines,
les flavonoïdes, les quinones, les saponines, les stéroïdes,
les tannins et les terpénoïde. Par ailleurs, les
anthocyanes ont été recherchés pour leur pouvoir anti
radicalaire alors que la recherche des hétérosides
cyanogènes renseignait sur une éventuelle toxicité due au
cyanure libéré par hydrolyse thermique ou enzymatique. Le
criblage phytochimique a porté sur les réactions en solution. Les
réactions en solution utilisées sont basées sur la
coloration, la précipitation ou la formation des mousses. Elles sont
décrites par Abisch & Reichstein (1960) et Harborne (1998).
a. Recherche des alcaloïdes
Deux méthodes seront utilisées : la
méthode des réactions en solution et la chromatographie sur
couche mince
Méthodes à 6 réactifs de
précipitation
Principe : La mise en
évidence des alcaloïdes consiste à les précipiter
à l'aide de six réactifs de précipitation (Abisch &
Reichstein, 1960).
Mode opératoire : 1g de
poudre de matière végétale sèche est mise à
macérer dans 10 mL de méthanol à température
ambiante pendant 24 heures. La solution obtenue est filtrée, puis le
marc lavé avec de portions de méthanol chaud. Le filtrat et
évaporé à sec à l'étuve à
50°C.
Le résidu est recueilli deux fois par 2 mL de solution
chaude d'acide chlorhydrique 1 % et est ensuite filtré. La solution
acide obtenue est alcalinisée par l'ammoniaque concentrée dans
une ampoule à décanter. Ajouter 15 mL de chloroforme dans
l'ampoule à décanter. Deux phases se forment. Agiter puis reposer
pour séparer les phases puis les séparer. Répéter
trois fois cette opération. La phase organique est
évaporée à sec à l'air libre et le résidu
est repris par le méthanol pour la CCM et laisser encore évaporer
le méthanol. Le résidu sec est repris par 0,5 mL de chloroforme,
est transféré dans un tube à hémolyse. Ajouter dans
ce tube 0,5 mL de HCl 1 % et agiter. Les alcaloïdes ayant
été protonés sont supposés se trouver dans la phase
aqueuse. Celle-ci, qui est au- dessus, est prélevée à
l'aide d'une pipette pasteur.
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Six gouttes en sont déposées sur une lame
porte-objet. Chacune de ces gouttes est traitée par l'un des six
réactifs de précipitations décrits en annexe (Abisch &
Reischtein, 1960).
La présence d'alcaloïdes n'est
considérée comme certaine que si chacun des six réactifs
donne un précipité. La méthode permet de détecter
jusqu'à des teneurs d'alcaloïdes inférieures à 0,01 %
sur une prise d'échantillon de 1g (Abisch & Reschtein, 1960)
b. Recherche des coumarines
Principe : En présence de
NaOH 10%, l'apparition d'une couleur jaune, indique la présence des
coumarines
Mode opératoire : Les
coumarines sont révélées à partir de 2 ml de
l'infusé à 5% placé dans un tube dans lequel sont
ajoutés 3 ml de NaOH (10%). Après agitation de la solution,
l'apparition d'une couleur jaune indique la présence de coumarines
(Diallo, 2000).
c. Recherche des flavonoïdes et anthocyanes
Principe : L'extrait aqueux
flavonoïque donne, en présence de l'acide chlorhydrique
concentré et de copeaux de magnésium, une coloration rose-rouge
et rouge violacée dans la couche surnageant d'alcool iso amylique.
Après chauffage au bain-marie, sans ajouter le magnésium,
1'apparition d'une coloration rouge indique la présence de leuco
anthocyanes (Bruneton, 2016)
Mode opératoire : 5 g de
matériel végétal placés dans un erlenmeyer sont
infusés dans 50 mL d'eau distillée pendant 30 minutes.
Après filtration, 5 mL de filtrat sont traités par le
réactif de SHINODA (l'alcool éthylique à 97 %, puis on y
ajoute successivement 5 mL d'eau distillée, 5 mL de HCl
concentré, quelques gouttes d'alcool iso-amylique) et 0,5g de copeaux de
magnésium. La coloration rouge-orangé (flavone), rouge ou rouge
violet (flavonones), rouge cerise (flavonol) apparaît dans la couche
surnageant (phase alcoolique) si la solution contient les flavonoïdes
(Harbone, 1998).
De même, la réaction effectuée pendant
deux minutes au bain-marie en l'absence de copeaux de magnésium permet
la caractérisation des anthocyanes lorsqu'apparaît une coloration
rouge (Harbone, 1998).
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d. Recherche des hétérosides cyanogènes
Principe : En présence
d'acide cyanhydrique, le papier picrosodé de couleur jaune vire à
l'orange ou au rouge suivant la concentration de HCN (Harbone, 1998).
Mode opératoire : 5 g de
poudre végétale sont placés dans un erlenmeyer avec 10 mL
d'eau distillée. Fermer l'erlenmeyer avec un bouchon auquel est
fixée une bandelette de papier picrosodé légèrement
humectée d'eau. Chauffer légèrement la solution. Le papier
picrosodé jaune vire à l'orange ou au rouge si l'extrait
végétal libère de l'acide cyanhydrique (Harbone, 1998).
e. Recherche des quinones
Principe : (Réaction de
Bornträger) En présence d'une base forte (NaOH ou KOH à 1 %)
les quinones donnent une coloration caractéristique allant de rouge
orange au violet pourpre (Bruneton, 2016)
Mode opératoire : 5g de
matériel végétal en poudre sont macérés
pendant une heure dans le toluène ou pendant 24 heures dans
l'éther de pétrole. Après filtration, 10 mL de filtrat au
toluène ou éthéré sont traités par 5 mL de
NaOH 1 %. L'apparition d'une coloration rouge violacée dans la phase
aqueuse indique la présence de quinones libres et celle jaune ou orange
les quinone liées (Bruneton, 2016; Harbone, 1998).
f. Recherche des saponines
Principe : La détection de
saponines est basée sur leur pouvoir moussant. Pour une mousse non
persistante, le filtrat en milieu acide en présence de dichromate de
potassium donne une coloration vert-sale ou violette virant au rouge (Bruneton,
2016)
Mode opératoire : Dans un
erlenmeyer contenant 10 g de matériel végétal broyé
grossièrement, on ajoute 100 mL d'eau distillée pour
réaliser une décoction pendant 30 minutes. Filtrer la solution
après refroidissement. 15mL de décoctés sont introduits
dans un tube à essai de 16 mm de diamètre et 160 mm de hauteur.
Le contenu du tube est agité hermétiquement pendant une minute.
Après agitation, on laisse reposer la solution pendant 10 minutes et
mesurer la hauteur de la mousse.
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En cas d'obtention d'une mousse de moins de 10 mm, tester la
présence des saponines à l'aide des réactifs
(Mélange d'acide sulfurique 1N et de dichromate de potassium10 %).
L'apparition d'une coloration violette virant au rouge ou au vert indique la
présence des saponines (Harbone, 1998).
g. Recherche des stéroïdes et
terpénoïdes
Principe : En présence de
l'acide acétique anhydre et de l'acide sulfurique concentré,
l'extrait organique éthéré ou au toluène contenant
les stéroïdes donne des colorations mauves et vertes.
L'identification des terpénoïdes suit le même schéma
en plus de l'ajout du réactif de Hirschson (acide
trichloroacétique). La couleur jaune virant au rouge indique la
présence de terpénoïd
Mode opératoire : 5 g de
matériel végétal sont mis à macérer pendant
24 heures dans l'éther de pétrole ou dans le toluène.
Après filtration, le solvant est évaporé à sec.
Dans le résidu obtenu, on ajoute successivement et en agitant, 2 mL de
chloroforme, 0,5 mL d'anhydride acétique et trois gouttes d'acide
sulfurique concentré. L'apparition de colorations mauves ou vertes
indique la présence de stéroïdes (Bruneton, 2016; Harbone,
1998)
L'identification des terpénoïdes suit le
même schéma que celle des stéroïdes. En plus du test
utilisé pour la recherche des stéroïdes, quelques gouttes de
réactif de Hirschson sont ajoutées à 4 ou 5 mL de la
solution acidifiée. La coloration jaune virant au rouge indique la
présence de terpénoïdes (Bruneton, 2016; Harbone, 1998)
h. Recherche des tannins
h.i. Tannins catéchiques
Principe : En présence de
chlorure ferrique 1 %, les extraits aqueux taoïques donnent des
colorations bleu-vert, bleu sombre et verte ou des précipités.
Mode opératoire : 5 g de
matériel végétal sont infusés dans 50 mL d'eau
contenue dans un erlenmeyer pendant 30 minutes. 5 mL de l'infusé sont
prélevés et additionnés des 1 mL de chlorure ferrique 1 %.
Le test est positif lorsqu' un précipité ou une coloration
(bleu-vert, bleu sombre ou vert) apparaît. 15 mL de réactif de
Stiasny sont ajoutés à 30 mL de l'infusé, le
mélange est porté au bain marie à 90°C. L'apparition
d'un précipité indique la présence de tannins
catéchiques (Amuri et al., 2017).
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h.ii. Tannins galliques
a. Principe : En présence de
chlorure ferrique 1 %, les extraits aqueux taoïques donnent des
colorations bleu-vert, bleu sombre et verte ou des précipités.
b. Mode opératoire : 5 g de
matériel végétal sont infusés dans 50 mL d'eau
contenue dans un erlenmeyer pendant 30 minutes. 5 mL de l'infusé sont
prélevés et additionnés des 1 mL de chlorure ferrique 1 %.
Le test est positif lorsqu' un précipité ou une coloration
(bleu-vert, bleu sombre ou vert) apparaît. 15 mL de réactif de
Stiasny sont ajoutés à 30 mL de l'infusé, le
mélange est porté au bain marie à 90°C. La solution
est ensuite filtrée, le filtrat est saturé d'acétate de
sodium avant d'y ajouter quelques gouttes de chlorure ferrique. La formation
d'un précipité dans ce cas, révèle la
présence de tannins galliques (Amuri et al., 2017).
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