ANNEXES
63
Annexes
Annexes
Annexe 1:Procédure d'extraction des ADNs
1. Préchauffer de l'eau au bain marie à
60°C
2. Peser 20 à 30 mg de feuilles séchées,
mettre dans les tubes eppendorf de 2ml, ajouter 2 à 3 billes
stériles, puis broyer àl'aide d'un broyeur bille.
3. Ajouter le tampon d'extraction au CTAB (2%
cétyltrimethyl ammonium bromide, 1,4 M NaCl, 0,2%, 20mM EDTA, 100Mm
Tris-HCl, PH=8) préchauffé à 60°C au bain-marie et
vortexer.
4. Incuber le mélange à 60°C au bain-marie
sous agitation douce (à chaque 10 minutes) pendant 60 min.
5. Ajouter un égal volume de CIA (Chloroform Isoamylic
Alcool) dans les proportions (24 :1) en agitant doucement pendant 5 min.
6. Centrifuger à 12000 rpm pendant 15 min à
température ambiante pour concentrer les phases. On obtient trois phases
: une phase aqueuse (en surface) contenant les acides nucléiques, une
phase organique (au fond du tube) contenant les protéines et lipides
dégradés ainsi que d'autres composés secondaires, et une
phase intermédiaire entre les deux contenant les déchets et
débris cellulaires ainsi que beaucoup de protéines
dégradées.
7. Transférer 800ul le surnageant dans un tube
eppendorf de 1,5 ml, ajouter 0,8 de volume d'isopropanol froid (-20°C) et
mélanger doucement pour précipiter les acides nucléiques.
Incuber à -20°c pendant 30 min si nécessaire et centrifuger
à 12000 rpm pendant 15 min,
8. jeter le surnageant et ajouter 500 ul d'éthanol 70%
pour le lavage, vortexer et laisser à température ambiante
pendant au moins 20 min.
9. Centrifuger à 12000 rpm pendant 15 min, vider
soigneusement le surnageant et faire sécher brièvement à
température ambiante pour éliminer l'éthanol.
10. Ré suspendre les acides nucléiques dans
100ul de H2O et conserver à 4°C.
64
Annexes
Annexe 2:Procédure de préparation du gel et
de la migration électrophorétique des ADN amplifiés par
PCR
1. Peser 1g d'agarose et mélanger avec 100 ml de
tampon TAE 0,5% (Tris base/Acétate acétique /EDTA 0.5M pH8) dans
une bouteille en verre avec couvercle et chauffer dans une microonde pendant 5
min pour fondre l'agarose et homogénéiser la solution.
2. Ajouter 4jil de bromure d'éthidium (BET) à
0,5 jig/ml à 60°C de la solution et homogénéiser
lentement. Le BET, agent intercalant de l'ADN, permet la visualisation des
bandes sous illumination UV. Il est hautement mutagène et doit
être manipulé avec beaucoup de précautions.
3. Couler le mélange sur une plaque
d'électrophorèse sur laquelle il faut placer des peignes avec une
épaisseur du gel de 3 à 5 mm.
4. Laisser polymériser le gel et retirer les
peignes.
5. Placer la plaque de gel dans la cuve
d'électrophorèse contenant du tampon TAE (0,5%) pouvant immerger
totalement le gel.
6. Ajouter 10% de tampon de charge (0,040%
bromophénol, 7% glycérol, 6 mM EDTA) aux produits PCR,
homogénéiser et déposer 12,5jil de ce mélange dans
les puits selon l'ordre d'étiquetage des échantillons. Le
marqueur de poids moléculaires (4 jil) est déposé dans le
premier puits. Les dépôts se font du côté de la
cathode qui est chargée négativement. L'ADN migrera en fonction
de la taille vers l'anode qui est chargée positivement.
7. Couvrir la cuve et démarrer la migration
électrophorétique à 100 volts pendant 35 à 40
min.
8. À la fin de la migration, retirer la plaque de gel
et déposer le gel sur un trans illuminateur pour la visualisation des
bandes sous illumination UV.
Annexe 3:Préparation des Mix et programmes PCR
? Composition du Mix de détection des virus
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Annexes
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Réactifs
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Volume pour une réaction (ìl)
|
Conc. initiale
|
Conc. Finale
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ADN
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2
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VD360
|
1
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10 uM
|
0,5 uM
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CD1266
|
1
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10 uM
|
0,5 uM
|
|
H2O qsp20
|
13
|
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|
Taq Polymerase (Hot firepol)
|
3
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5U/ul
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1U
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Vol total mix
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20
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V' Composition du Mix de détection des
Betasatellites
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Réactifs
|
Volume pour une réaction (ìl)
|
Conc. initiale
|
Conc.
finale
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|
ADN
|
2
|
|
|
|
Beta 01
|
1
|
10 uM
|
0,5 uM
|
|
Beta 02
|
1
|
10 uM
|
0,5 uM
|
|
H2O qsp20
|
13
|
|
|
|
Taq Polymerase (Hot firepol)
|
3
|
5U/ul
|
1U
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|
Vol total mix
|
20
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|
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V' Composition du Mix pour l'amplification des
isolats à séquencer
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Réactifs
|
Volume pour une réaction (ìl)
|
Conc. initiale
|
Conc.
finale
|
|
ADN
|
2
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|
|
|
Beta 01
|
1
|
10 uM
|
0,5 uM
|
|
Beta 02
|
1
|
10 uM
|
0,5 uM
|
|
H2O qsp20
|
13
|
|
|
|
Taq Polymerase (Hot firepol)
|
3
|
5U/ul
|
1U
|
|
Vol total mix
|
20
|
|
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| 
