II.2.2 TESTS
II.2.2.1 RVFELISA Kits,
CATTLE IgG (Kit ELISA IgG bovine - BDSL)
Procédure
Le volume utilisé est de 100 ul/puits, et tous les
lavages sont effectués 3 fois en utilisant 300 ul de tampon de lavage
par puits.
1. Couvrir les plaques avec 100 ul sérum anti-VFVR de
la souris dilué 1:2000 dans
PBS(Phosphate Buffered
Saline) et incuber les plaques couvertes à 4°C
durant une nuit. Laver les plaques à l'eau distillée.
2. Ajouter 200 ul/puits du tampon de blocage et incuber
pendant 1 heure dans une chambre humide à 37°C. Laver les plaques
à l'eau distillée.
3. Ajouter 100 ul de l'Ag de VFVR et Ag de contrôle
dilué 1 :400 dans un tampon de dilution aux lignes A-D 1-12 et aux
lignes E-H 1-12, respectivement et incuber pendant 1 heure dans une chambre
humide à 37°C. Laver les plaques.
4. Ajouter 100 ul du sérum de test et de contrôle
dilués 1 :400 dans un tampon de dilution dans des puits et incuber
pendant 1 heure dans une chambre humide à 37°C. laver les plaques.
Ajouter 100 ul/puits de conjugué anti-bovine IgG
HRPO(Ezyme Horseradish
Peroxydase) dilué 1 :1000 dans un
tampon de dilution et incuber pendant 1 heure dans une chambre humide à
37°C. Laver les plaques à l'eau distillée 6 fois.
5. Ajouter 100 ul d'ABTS/puits. Laisser les plaques pendant 30
minutes à la température ambiante (22-25°C) dans le sombre,
ajouter 100 ul de solution d'arrêt 1x concentré SDS et lire la
densité optique à 405 nm.
Le pourcentage positif (PP) du C+, du C- et du sérum
à tester a été calculé par la formule ci-dessous et
l'interprétation des résultats suivant le tableau II.2.
PP=  
Tableau II.2 : Interprétation des résultats
des tests.
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Valeur PP
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Résultat
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Interprétation
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< 4.0
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Négatif
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Pas d'anticorps détectés
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4.0 - 8.0
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Suspect
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Tester l'animal de nouveau, de préférence 10
à14 jours après le premier prélèvement
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>8.0
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Positif
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Indique la présence des anticorps
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Ce protocole d'interprétation offre un niveau de
confiance de 99% de tous les résultats de tests en dehors du groupe
suspect.
Pour les bovins, la valeur comprise entre 4.0 - 10.0 doit
être considéré suspect et la valeur supérieure
à 10 est un cas positif.
II.2.2.2 - Kit ELISA
indirect IgM, IgG ruminants - OVI
Procédure
La concentration optimale des réactifs et des
dilutions, la sélection des plaques immunisées et le protocole
des paramètres des IgG et IgMI-ELISA est déterminées par
le biais de procédures standards de titrage en damier (CROWTHER,
1995).
1. Les plaques immunisées (Maxisorb, Nunc, Denmark)
sont couvertes avec la souche rNVFVR dilué 1:500 pour les IgM et 1:2000
pour les IgG I-ELISA dans un tampon de carbonate-bicarbonate de pH=9.6 et
incuber pendant une nuit à 4°C. Laver 3 fois avec le tampon de
lavage composé de PBS à pH7.2 et entre 0.1 - 20%.
2. Les plaques sont bloquées avec 200 ul du lait en
poudre sans matières grasses de 10% (`Elite', Clover SA, Pty, Ltd.) dans
le PBS et incuber dans une chambre humide pendant 1 heure à
37°C , les laver comme indiqué ci-haut.
3. Les sérums de test et de contrôle sont
dilués 1:400 dans PBS contenant 2% de poudre de lait (tampon de
dilution) et 100 ul sont ajoutés sur les plaques. Chaque sérum de
test est testé deux fois et les sérums de contrôle et du
conjugué sont testés quatre fois. Après l'incubation dans
une chambre humide durant 1 heure à 37°C, les plaques sont
lavées 3 fois avec le tampon de lavage.
4. Ajouter 100 ul de HRPOdes conjugués anti-species IgM
et IgG respectivement dans :
§ chèvre anti-humaine u-chain des IgM
(ICN pharmaceuticals) dilués 1:500,
§ chèvre anti-humaine IgG (H+L
chain) (Zymed Laboratories, Inc.) dilués 1 :5000,
§ antisérum lapin dans u chain des IgM
mouton (ICN Pharmaceuticals, Inc.) dilué 1 :500, et
§ IgG lapin anti- mouton (H+L) (Zymed
Laboratories, Inc.) dilué 1 :3000.
Les plaques sont incubées durant 1 heure à
37°C, puis lavées 3 fois.
5. 100 ul du substrat d'Acide
Sulfonique
2,2'-azinodiethylbenzothiazoline (ABTS) est
ajouté dans chaque cupule. Les plaques sont ainsi incubées
à l'obscurité à la température ambiante pour 30
minutes maximum.
6. Les réactions sont stoppées par l'addition de
100 ul de 1% de sulfate de sodium dodecyl (SDS) et la densité optique
(OD) est lire à 405 nm.
Les résultats sont exprimés par le pourcentage
du sérum de contrôle High - positive (PP) en utilisant la
formule :
[(OD moyenne du sérum de test dupliqué/ OD
moyenne du contrôle positif)] x 100.
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