Production de glutamate par corynebacterium glutamicum 2262. Mise au point du milieu de culture à base de son de blé.

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Université Ferhat Abbas Sétif 1 Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

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DEPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE N⁰ /SNV/2016

MÉMOIRE

Présenté par

ACHACHA Hadjer KHELLAF Besma

Pour l'obtention du diplôme de

MASTER

Filière : Biologie

Spécialité : Ecologie microbienne

THÈME

Production de glutamate par Corynebacterium glutamicum 2262 : Mise au point du milieu de culture à base de son de blé.

Soutenue publiquement le 05/06/2016

DEVANT LE JURY
- ZERROUG Med. Mihoub	:	Pr. UFA Sétif-1	Président
- MOUFFOK Abdenacer	:	M.A.A UFA Sétif-1	Encadreur
- BOUSSOUALIM Naouel	:	Dr. UFA Sétif-1	Examinatrice

Laboratoire de Microbiologie Appliquée

Remerciements

Tout d'abord, nous remercions ALLAH, notre créateur de nos
avoir donné la force, la

volonté et le courage afin d'accomplir ce travail modeste.

Nous adressons le grand remerciement à notre encadreur
MOUFFOK Abdenacer qui a proposé le thème de ce
mémoire, pour ses conseils et ses dirigés du début à la fin de ce
travail .

Nous tenons également à remercier messieurs les membres de
jury pour l'honneur qu'ils
nos ont fait en acceptant de siéger à notre soutenance, tout
particulièrement :
Pr ZARROUG Med Mihoub pour nous avoir fait l'honneur de
présider le jury de cette mémoire.
Nous souhaitons exprimer notre gratitude à Dr
BOUSSOUALIM Naouel pour avoir faire
de lecteur notre mémoire, aller l'examiner et elle peut évaluer
cette mémoire. Nous vous
remercions pour l'intérêt que vous avez porté à ce travail et
pour vos précieux conseils et
remarques.

Finalement, nous tenons à exprimer notre profonde gratitude à
nos familles qui nous ont
toujours soutenues et à tout ce qui participe de réaliser ce
mémoire. Ainsi que l'ensemble des
enseignants qui ont contribué à notre formation.

HADJER

Dédicace

Louanges à Allah, seigneur de l'univers ; que les salutations d'Allah soient sur
son messager qu 'il a envoyé en qualité de miséricorde universelle, ainsi que sur ses
compagnons et ses frères jusqu'à la résurrection

Longue étaient les années de labeurs malgré cela je cueille humblement enchantée le
fruit de mon travail et je dédie tous d'abord :

la prunelle de mes yeux, celle qui a toujours brule pour avoir nous éclairer
le chemin de la réussite, MAMA.

Et celui qui m'a indiqué la bonne voie, en me rappelant que la volonté fait toujours
des miracles, ABI.

A la mémoire de mes très chers grands parents DHAOUIA , AHMED et

MOKHTAR qui aurait été fière de ma réussite (Allah yarhamhome)

À ma grande mère MA TORKIA

A la lumière de mes jours mon petit frère Mohamed Yacine et mes soeurs Hala et

Aya sans oublié mes tantes Hanane, Khalida , Soria ,et Ouahiba

A la prunelle de mes yeux ma proche tante HANANE spécialement et aussi mes
tantes KHALIDA, OUAHIBA, SORIA et leurs maris.

A mes oncles NACEREDDIN, ABDELOUAHAB, ABDERAHIM et leurs

épouses.

A toute mes tantes en particulier ma tante SALIMA et son mari ABDELDJALIL.

A ma cousine IKHLAS sans oublier HASNA, RAMI, ADEL, OUMAIMA,
ISKANDAR, KHAOULA et RAHAF.

A mes chères amies BESMA , ainsi que KENZA et GHOZLAN Et bien sûre mes amis MOHAMED , FARES et OUSSAMA

Et tous mes collègues d'étude

A tout ce qui j'ai oublié pardonner moi.

(que ALLAH soit avec eux)

Dédicace

Je tiens à exprimer ma reconnaissance envers mes parents AMMAR et NOURA, qui me
ont accompagnés, aidés et encouragés.

Je dédie mon travail à mes frères AHMED ISLAM et MOHAMMED SOHAIB, à mes
soeurs AHLEM, KARIMA et AYAT-ERRAHMENE, pour leurs contribution et leurs

patience.

A mon mari OUSSAMA pour leur encouragement et leurs conseils.
A MOHAMMED et HOUCINE.

A mes amies : HADJER, HAMIDA, KENZA, GHIZLENE, NOUR EL-HOUDA,
GHALIA et RIMA.

A mes collègues : OUSSAMA, MOUHAMED DHIA-EDDINE, AMINA et AMINE.
A mon professeur RAHMANI ABD-ERRAHMENE.
A monsieur BEN MAÏZA DJAMAL.
A tout mes proches amis.
Je ne peux pas citer tout le monde mais j'ai une pensée plus particulière.

BESMA

SOMMAIRE

Résumé I

Liste des tableaux ...III

Liste des figures IV

Liste des abréviations V

CHAPITRE I: Etude bibliographique

INTRODUCTION				.01
I.1.Acide glutamique				03
I.1.1.Historique de la production de glutamate				.....03
I.1.1.2.Présentation de la molécule				........03
I.1.1.3.Utilisations du glutamate				04
I.1.1.4.Microorganisme producteur du glutamate				.04
I.1.1.4.1. Composition du milieu de culture				05
I.1.2.Procédés de production d'acide glutamique				06
I.1.2.1.-Contraintes chimiques induisant la production d'acide glutamique				06
I.1.2.2-Contraintes physiques induisant la production d'acide glutamique				07
I.2.Métabolisme central des corynébactéries				.08
I.2.1.Entrée du sucre dans la cellule				09
I.2.2.Glycolyse				.............09
I.2.3. Voie des pentoses phosphate				10
I.2.4.Cycle de Kreps				11
I.2.5.Voie de biosynthèse du glutamate				..12
I.3.Le son de blé	13
I.3.1.Structure macroscopique	13
I.3.2.Structure microscopique	..14
I.3.3.Composition chimique du son de blé	14
I.3.4.Effets sur la santé	16
I.3.5.Valorisation des sons de blé	......17
I.3.5.1.Alimentation humaine	...17
I.3.5.2.Industrie papetière	17
I.3.5.3.Applications diverses	17
I.3.6.Conversion de la biomasse lignocellulosique	.17
I.3.6.1.Préparation de la matière première	..17
I.3.6.2.Prétraitement			...17
I.3.6.3.Hydrolyse			19
I.3.6.3.1.Hydrolyse chimique			.....19
A-Hydrolyse à l'acide dilué			19
B-Hydrolyse à l'acide concentré			19
I.3.6.3.2.Hydrolyse enzymatique			19
I.4. Modèle expérimentales			20
I.4.1.Définition et domaine d'application des plans d'expériences			20
I.4.2. Différents types des plans d'expériences			20
I.4.2.1.Plans de criblage			...20
I.4.2.1.1.Plans de Taguchi			20
I.4.2.1.2. Plans de Plackett et Burman (PB)			21
I.4.3.2. Plans de modélisation			.....21
I.4.3.2.1. Plans de Box-Behnken (BB)			21
CHAPITRE II : Matériels et Méthodes
II.1.Appareils et produits chimiques			.22
II.2.Microorganisme utilisé			23
II.3.Conditions de culture			24
II.3.1. Milieu de préculture			24
II.3.2. Milieu de production			25
II.3.3.Stérilisation			25
II.4. Procédé de culture discontinue			...25
II.4.1.Conservation de la souche			....25
II.4.2.Propagation de la souche (préculture)			25
II.4.3.Culture en Erlenmeyer			..26
II.4.3.1.Protocole des fermentations discontinues			..26
II.5. Méthode d'analyses		....27
II.5.1.Estimation de la biomasse		27
II.5.2.Dosage de glutamate		27
II.5.3.Dosage de sucres totaux		.....27
II.6.Exploitation des donnés expérimentales		..27
II.6.1.Calcule des paramétres cinétique en réacteur discontinu		27

II.6.1.1.Vitesse de réaction 28

II.6.1.2.Productivité volumétrique 28

CHAPITRE III : Résultats et Discussion

III.1. Optimisation de trois paramètres d'hydrolyse acide des sucres de son de

blé . .30 III.2. Validation du modèle ...34 III.3. Cinétiques de Corynebacterium glutamicum 2262 sur milieu de culture à
base d'hydrolysat de son de blé	. .38
Conclusion	40
Références bibliographiques	41

I

Résumé

Lors de ce travail, une mise en évidence des paramètres opératoires importants dans l'hydrolyse acide de la matière lignocellolosique de son de blé a été réalisé d'une part et, d'autre part, un modèle statistique de Box-Behnken a été appliqué, afin d'optimiser les paramètres de cet hydrolyse. Trois facteurs (concentration d'acide sulfurique, température d'hydrolyse et temps d'hydrolyse) à trois niveaux ont été évalués afin de déterminer les valeurs optimales d'hydrolyse. L'ajustement du modèle a été vérifié par le coefficient de corrélation (R²) qui est de 0,89. Les conditions optimales de l'hydrolyse des sucres de son de blé estimées par l'équation du modèle sont les suivantes : 19,13% pour l'acide sulfurique, de 89,37 °C pour la température d'hydrolyse, de 63,29 min pour le temps d'hydrolyse. La concentration de l'acide sulfurique estimée par le modèle (19,13%) est inferieure à la concentration minimale proposée (20%), donc une autre optimisation par le modèle de Box-Behnken doit être effectuée avec une concentration maximale de l'acide sulfurique de 20 %. Après la deuxième optimisation, la concentration maximale des sucres (35 g.l^-1) se situe à 85°C pour la température d'hydrolyse, à 68 min pour le temps d'hydrolyse et à 11% pour l'acide sulfurique. L'hydrolysat obtenu a été ensuit utilisée comme milieu de culture naturel pour une production de 6,63g.l^-1 d'acide glutamique par Corynebacterium glutamicum 2262.

Mots clé : son de blé, glutamate, Corynebacterium glutamicum 2262, hydrolyse acide, Box-Behnken.

II

Ig11

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Corynebacterium glutamicum

III

LISTES DES TABLEAUX

Tab.I.1. Composition de différentes couches de son sur base humide de 12 à 14 %	14
Tab I.2. Compositions chimiques de sons de blé de différentes origines	.15
Tab. I.3.Composition en sucre du son désamidonné	.16
Tab.I.4.Teneur en fibres alimentaires dans la farine et le son de blé	16
Tab. I.5.Principaux procédés de prétraitement	...18
Tab.I.6.Comparaison des différentes options d'hydrolyse de cellulose	20
Tab II.1.Caractères générales de C. glutamicum	23
Tab. II.2. Composition de milieu BMCG	.24

Tab. III.1. Niveaux choisis pour l'optimisation des paramètres d'hydrolyse de son de blé 31

Tab III.2. Matrice du modèle Box- Benhken et les résultats des expériences 31

Tab. III.3. Analyse de régression des résultats obtenus à partir du modèle Box Behnken 34

Tab. III.4. Niveaux choisis pour la deuxième optimisation des paramètres d'hydrolyse de son

de blé 34

Tab. III.5. Matrice expérimentale du modèle factoriel Box-Behnken ...35

Tab.III.6. Analyse de régression des résultats obtenus à partir du modèle Box-Behnken ....37 Tab. III.7. Paramètres cinétiques de C. glutamicum 2262 sur le milieu à base d'hydrolysat de

son de blé 39

LISTE DE FIGURES

Fig. I.1: classification hiérarchique de la classe des Actinobactéries 4

Fig. I.2 : morphologie des cellules de C. glutamicum cultivées dans un milieu riche et

observées au microscope électronique .....4

Fig. I.3: Cinétique de production du glutamate au cours d'un procédé de production 6

Fig. I.4: représentation schématique de la voie de biosynthèse du glutamate chez

Corynebacteries .....8

Fig. I.5: schéma général d'entrés des sucres chez C. glutamicum 9

Fig. I.6: Voie de la glycolyse chez C. glutamicum 10

Fig. I.7 : la voie des pentoses phosphates chez C. glutamicum 11

Fig. I.8 Voies de biosynthèse du glutamate 12

Fig. I.9: Section longitudinale d'un grain de blé 13

Fig.I.10. (a): Surface plot, (b) : Contour plot d'une réponse 21

Fig.II.1. Propagation de C. glutamicum 2262 26

Fig .II.2. Incubateur New Brunswick Scientific 26

Fig. III.1. Corrélation entre les sucres observés et les sucres prévues 32

Fig.III.2. Simulation des sucres .35

Fig.III.3.Courbes d'isoréponse et surface de réponse de la concentration des sucres de son de

blé montrant l'effet de l'interaction entre la température et le temps d'hydrolyse 37
Fig.III.4. Courbes d'isoréponse et surface de réponse de la concentration des sucres de son de

blé montrant l'effet de l'interaction entre l'acide sulfurique et le temps d'hydrolyse .37
Fig.III.5. Courbes d'isoréponse et surface de réponse de la concentration des sucres de son de

blé montrant l'effet de l'interaction entre l'acide sulfurique et la température d'hydrolyse 38
Fig.III.6. Cinétiques de croissance, de consommation des sucres et de production de

glutamate sur le milieu testé 39

V

LISTE DES ABREVIATION

C. glutamicum: Corynebacterium glutamicum.

MSG: Mono-sodique glutamate.

PTS : Système phosphotransférasique.

SP: Système perméase.

PEP: Phosphoénolpyrvate.

PYR: Pyruvate.

DHAP: Dihydroxyacétone phosphate.

G6P: Glucose-6-phosphate.

G3P: glycéraldéhyde-3-phosphate.

Ru5P: Ribose-5-Phosphate.

AK: L'acétate kinase.

PTA: phosphotransacétylase.

ODH: á-cétoglutarate déhydrogénase.

PDH: Pyruvate déhydrogénase.

GDH: Glutamate déhydrogénase.

GS : Glutamine synthétase.

GOGAT: Glutamine amide á-cétoglutarate amino transférase.

NREL: National Renewable Energy Laboratory.

PB: Plackett et Burman.

BB: Box-Behnken.

BMCG: Basal Medium Corynebacterium Growth

CHAPITRE I

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Introduction

1

Le blé est l'un des produits agricoles les plus importantes à l'échelle mondiale avec celle du riz et du maïs. Actuellement, plus de 600 millions de tonnes de blé sont produites chaque année dans le monde. Il existe différentes variétés de blé, mais la plus cultivée est le blé tendre, ou blé mou. Le grain de blé peut être consommé sous plusieurs formes : entier, concassé, soufflé, en semoule, en farine, etc. malgré que le son de blé est considéré comme déchet mais il représente un sujet d'étude dans plusieurs domaine de recherche. Les études de la composition chimique de son de blé montrent que ce dernier contient 39,2% de xylose, 25,2% d'arabinose, 0,9% de mannose, 2,1 % de galactose et 32,6% de glucose (Hromàdkovà et al. ,2008).

Le son de blé, de par leur richesse en sucre et leur conservation relativement longue, offrent de nombreuses possibilités technologiques suivant le traitement auquel elles sont soumises. En effet, elle peut servir de matière première de fermentation pour la production d'acide glutamique. L'acide aminé le plus produit dans le monde, sa production mondiale a fortement augmenté pour atteindre aujourd'hui une production annuelle dépassant deux millions de tonnes (Stefen et al., 2011). Il est utilisé dans de nombreuses industries (pharmaceutique, chimique, cosmétique). Mais son utilisation principale est l'alimentation humaine. Il est employé comme exhausteur de goût dans de nombreux aliments déshydratés (soupes, bouillons ...) qui ont perdu de leur saveur lors de leur fabrication.

En 1908 le professeur japonais Kikunae Ikeda propose alors de le nommer le 5^eme goût umami. L'acide glutamique est produit par fermentation. Les principaux producteurs mondiaux sont asiatiques. En Europe, le leader est incontestablement la société ORSAN dont la part sur le marché mondial est d'environ 10%.

Actuellement, plusieurs microorganismes peuvent permettre la production du glutamate. Il y a notamment Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum et Brevibacterium divaricatum. C. glutamicum est le microorganisme le plus utilisé à l'échelle industrielle (Dien et al., 2003).

Dans toutes les disciplines, il est fréquent de souhaiter étudier un phénomène dépendant de différents paramètres. La méthode intuitive n'est pas toujours la meilleure. Elle consiste généralement à fixer le niveau de toutes les variables sauf une et de mesurer la réponse pour plusieurs valeurs de la variable mobile. Si plusieurs paramètres doivent être étudiés, il faut répéter cette technique pour chaque paramètre. Pour résoudre ce problème, Il faut donc réduire le nombre d'expériences à effectuer sans perdre la qualité des résultats recherchés. L'utilisation d'un plan d'expériences donne alors une stratégie dans le choix des méthodes d'expérimentation.

Introduction

2

Leur succès dans la recherche et l'industrie est lié au besoin de compétitivité des entreprises, ils permettent une amélioration de la qualité et une réduction des coûts.

Nous commencerons dans le chapitre I par une étude bibliographique présentant l'essentiel des connaissances sur la fermentation glutamique, le métabolisme central de Corynebacterium glutamicum et le son de blé et sa valorisation; et enfin une partie sera consacrée à l'application de la méthode des plans d'expériences.

Le Matériel et Méthodes de ce mémoire seront décrits dans le chapitre II.

Le chapitre III inclus les résultats obtenus et leurs discussions.

Enfin, nous terminerons ce travail par une conclusion générale concernant l'ensemble de ce travail et permettant de le placer dans la problématique à laquelle il se raccroche et en laissant entrevoir les perspectives auxquelles il pourrait donner lieu.

Chapitre I Etude bibliographique

3

I.1.Fermentation glutamique

I.1.1.Historique de la production de glutamate

En 1908 le glutamate a été isolé par le professeur japonais Kikunae Ikeda à partir d'hydrolysats d'algues brunes comestibles nommées Kombu (Laminaria japonica) et il déclare en 1912 à un congrès international à Chicago : « Je crois qu'il existe au moins un goût que l'on peut ajouter aux quatre saveurs existantes. Il s'agit de ce goût particulier que nous appelons "UMAMI". Ce goût est caractéristique d'un bouillon préparé à base d'algues séchées de Kombu», il propose alors de nommer le 5^eme goût, l'UMAMI.

L'organisme Corynebacterium glutamicum a été isolé en 1957 par Kinoshita et collègues à partir d'un échantillon de sol recueilli au zoo d'Ueno à Tokyo et à ce moment-là désigné comme micrococcus glutamicus (Jutta et al., 2009).

Les principales sociétés productrices de glutamate sont les sociétés japonaises Ajinomoto, Kyowa Haklco Kogyo, Asahi Chemical, Takeda et Tanabe Seiyaku, la société coréenne Cheiljedang, la société américaine Stauîfer Chemical et la société franco-belge ORSAN-Amylum (Burkovski et Kramer, 2002; Crueger et Crueger, 1984; Eggeling et Sahm, 1999). La société ORSAN-Amylum représente environ 10 % de la production mondiale annuelle d'environ un million de tonnes. La croissance du marché de glutamate arrive à maturité avec un taux de croissance annuel de 4 à 5 %. (Davin, 2003).

I.1.1.2.Présentation de la molécule

Le glutamate monosodique se présente sous forme de cristaux ou de poudre cristalline

blanche. Il est inodore. Sa formule brute est C5H8NO4Na. H2O et sa masse moléculaire est de

187.13 g/mol.

Parmi ses caractéristiques physico-chimiques on distingue:

- Il est très soluble dans l'eau.

- Il est légèrement soluble dans l'éthanol.

- Il est insoluble dans l'éther.

- Le pH d'une solution saturée est de 6,7-7,2.

Cette substance est naturelle et on la trouve dans : les algues, les haricots de soja, le

gluten de maïs, de blé et la betterave à sucre. En effet, elle est présente naturellement dans

presque tous les aliments en particulier ceux riches en protéines :

Chapitre I Etude bibliographique

4

- les produits laitiers comme les fromages (parmesans)

- les viandes et les poissons

- les fruits de mer.

- de nombreux légumes comme les tomates, les oignons, les champignons.

I.1.1.3.Utilisations du glutamate

L'acide glutamique est un acide aminé non essentiel utilisé principalement comme additif alimentaire sous forme mono-sodique glutamate (MSG, E621). Et il est largement employé dans la cuisine asiatique comme exhausteur de goût (Jutta, 2014) et il est considéré par les Japonais comme étant à l'origine d'un 5^ème goût : le goût UMAMI.

En Europe, la dose journalière admissible est de 0 - 120 mg /1 kg de poids corporel, alors que cette molécule est considérée comme additif non toxique au Japon.

Le glutamate est également utilisé, en beaucoup plus faible quantité, par les industries pharmaceutiques et cosmétiques (Davin, 2003).

I.1.1.4. Microorganisme producteur du glutamate

Le genre Corynebacterium est un membre de la classe des Actinobactéries, de l'ordre des Actinomycétales, de la famille des Corynebacteriaceae (Stackebrandt et al., 1997). (Figure I.1)

Fig.I.1: Classification hiérarchique de la classe des Actinobactéries selon Stckebrandt et al. (1997).

Fig. I.2. Morphologie des cellules de C. glutamicum observées au microscope électronique. Dimension 1,4 à 2
um (Wehrmann et al., 1998).

Chapitre I Etude bibliographique

5

Actuellement, il y a environ 50 espèces validées de Corynebacterium et certaines présentent un intérêt industriel dont C. glutamicum.

C. glutamicum est une bactérie du sol aérobie facultative, non pathogène, des bacilles à Gram-positif, non sporulante (Takuo et al., 2008) immobiles et auxotrophe pour la biotine (Sung-Jin Jo et al., 2009) et sont caractérisés par un ADN génomique riche en guanine et en cytosine (G+C% est compris entre 53 et 58) (Boulahya, 2010).

Cette bactérie est utilisé industriellement pour la production à grande échelle des acides aminés, en particulier l'acide glutamique et de la lysine (Volker et al., 2006).

I.1.1.4.1. Composition du milieu de culture

Quand une souche a été sélectionnée, elle doit être cultivée dans des conditions permettant une productivité maximale en métabolite ou en biomasse.

Il doit apporter aux micro-organismes les molécules nécessaires pour la production d'énergie, l'augmentation de la biomasse et la synthèse de métabolites.

a. Source de carbone Elle constitue la source d'énergie des cellules et intervient dans la synthèse de toutes les molécules organiques. La nature de la molécule influence la production de biomasse ou de métabolites.

b. Source d'azote

L'influence est très importante sur la productivité des métabolites secondaires. Comme pour les sucres, la synthèse de certaines molécules ne débute que si la totalité de la source d'azote facilement assimilable a été consommée (NH4). L'addition d'une source d'azote dans un milieu de culture influence le pH en permettant le maintien de celui-ci à une valeur donnée en raison du pouvoir tampon de certaines molécules azotées. (Das et al., 1995).

c. Substrats naturels complexes

L'utilisation de ce type de substrat s'explique par leur coût moins élevé que celui des molécules organiques ou inorganiques purs. Les produits ont également comme avantage d'apporter aux micro-organismes des mélanges en vitamines, acides aminés et sels minéraux. On obtient ainsi des croissances rapides.

d. Sels

Certains sels minéraux sont très importants comme le sulfate de magnésium indispensable à la croissance de la membrane cellulaire ou le carbonate de calcium qui maintient le pH. (Kumagai, 2000).

Chapitre I Etude bibliographique

6

I.1.2. Procédés de production d'acide glutamique

La production de L-glutamate par C. glutamicum résulte de l'application des contraintes (Figure I.3).

Fig. I.3: Cinétique de production du glutamate au cours d'un procédé de production.

Initialement, la source carbonée est utilisée pour la croissance (synthèse de la biomasse), puis une contrainte est appliquée aux C. glutamicum de façon à faire excréter du glutamate parce que l'acide glutamique n'est pas excrété spontanément par les cellules. (Boulahya, 2010).

On distingue deux types de contraintes: contraintes chimiques et contraintes physiques.

I.1.2.1.Contraintes chimiques induisant la production d'acide glutamique

a. Limitation en biotine

C. glutamicum est une bactérie auxotrophe pour la biotine ,cette auxotrophie est due à l'absence du gène bioF qui code la 7-céto-8 aminopilargonate synthétase responsable de l'une des étapes de synthèse de la biotine chez C glutamicum (Hatakeyama et al., 1993a; Hatakeyama et al., 1993b) sa limitation pendant la fermentation glutamique provoque une réduction de la synthèse des phospholipides et une augmentation du rapport acides gras saturés / acides gras insaturés. Cette modification métabolique permet un basculement de la croissance vers la production du glutamate (Clément et al., 1984 ; Clément et Lanéelle, 1986 ; Demain et Bimbaum, 1968; Shibukawa et Ohsawa, 1966).

b. Ajout de pénicilline

La pénicilline inhibe la synthèse du peptidoglycane mais ne modifie ni la teneur en acide gras ni la teneur en phospholipides membranaire (Shibuvkawa et.al, 1968).master 2013. L'ajout de pénicilline permet de produire l'acide glutamique tout en utilisant des matières premières riches en biotine (Sommerson et Philips, 1962).

e. Chapitre I Etude bibliographique

7

Ajout de tensioactif

L'ajout de tensioactif diminue la quantité de phospholipides cellulaires de plus de 50% et le rapport acides gras saturé / acides gras insaturés est augmenté contrairement à la pénicilline (Huchenq et al.,1984 ).

l'ajout de tensioactifs comme des acides gras saturés et ses dérivés dans un milieu riche en biotine permet d'excréter du glutamate (Duperray et al., 1992; Takinami et al., 1965; Takinami et al., 1968).

Marquet et al. (1986) ont montré que l'ajout de tensioactifs tel que le polyéthyléneglycol stéarate, polyéthyléneglycol palmitate, ou laurylamine permet d'obtenir un titre final en glutamate compris entre 80 et 100 g.l^-1. Dans un milieu riche en biotine, l'ajout des détergents tels que poly-oxyéthyléne sorbitane mono palmitate (Tween 40) ou le poly-oxyéthyléne sorbitane monostéarate (Tween 60) favorise la production de glutamate (Duperray et al., 1992 ; Takinami et al.,1965 ).

f. Ajout d'anesthésique local

Dans un milieu riche en biotine, C. glutamicum excrète jusque 15 g.l^-1 de glutamate en présence d'un d'anesthésique local tel que la tétracaine (Lambert et al., 1995) ce qui provoque une altération physique de la membrane sans aucune modification de sa composition ni ses propriétés biochimiques.

g. Limitation en acide oléique et glycérol

Des souches de Corynébacteries auxotrophes pour le glycérol ou des acides gras comme l'acide oléique produisent de glutamate (Kanzaki et al., 1967 ; Nakao et al.,1970). Dans un milieu limité en acide oléique, 100 g.l^-1 de glutamate a été atteint avec du glucose comme source de carbone (Miescher, 1975). L'équipe de Nakao s'est intéressée à Corynebacterium alkanolyticum auxotrophe pour le glycérol. La carence en glycérol chez cette bactérie induit l'excrétion d'acide glutamique quelle que soit la source de carbone utilisée (Nakao et al.,1970).

I.1.2.2.Contraintes physiques induisant la production d'acide glutamique

a. Température

La température reste généralement constante lors de production du glutamate par les procédés précédents pendent toute la fermentation. Chez C. glutamicum 2262, l'excrétion du glutamate est induite par une augmentation brutale de la température du milieu de culture de 33°C à 39°C, ce changement est moyen efficace permet une déviation du flux du carbone

Chapitre I Etude bibliographique

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(métabolisme) vers une production du glutamate (production de 85 g.l^-1 de glutamate en 24h et en mode semi continu) (Delaunay, 1999).

b. pH

Le pH optimum qui assure une vélocité maximale de transport de glutamate par C. glutamicum est de 7,4 à 7,8. (Shah et al., 2002).

c. Oxygène

L'oxygène (O2) est un élément important pour la production d'acide glutamique par C.glutamicum. En présence d'excès d'O2, le métabolisme sera orienté vers la production de l'á-cétoglutarate (Çalik et al., 2001; Crueger et Crueger, 1984 ; Kinoshita et Nakayama, 1978). Par contre dans des conditions insuffisantes en O2, une quantité importante de lactate, de pyruvate et de succinate sont accumulés (Çalik et al., 2001; Dominguez et al., 1993).

Pour cela, plusieurs études ont été consacrées à l'étude de l'effet de l'O2 sur la production de glutamate. Tavakkoli et al. (2009) ont montré que le contrôle du débit d'air à son optimum est essentiel pour une production maximale de glutamate.

I.2.Métabolisme central des corynébactéries

L'á-cétoglutarate est le précurseur immédiat dans la synthèse du glutamate. Les différentes voies classiques du métabolisme central responsables à la synthèse du glutamate chez corynebacteries sont schématisées dans la figure I.4.

Fig. I.4: représentation schématique de la voie de biosynthèse du glutamate chez Corynebacteries.PTS : système
phosphotransférasique ; PDH : pyruvate déhydrogénase ;ODH : á-cétoglutarate déhydrogénase et Gdh :
glutamate déhydrogénase.

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I.2.1.Entrée du sucre dans la cellule

Les sources de carbone préférées dans les procédés biotechnologiques industriels sont les sucres, surtout le glucose, le saccharose et le fructose. Ces sucres peuvent pénétrer dans la cellule par deux moyens: le système phosphotransférasique (PTS) et le système perméase (SP) (Figure I.5).

Le PTS catalyse la phosphorylation de ces sucres (soit le glucose-6-phosphate ou soit le fructose-6-phosphate) en utilisant du phosphoénolpyruvate (PEP) et générant du pyruvate (Dominguez et Lindley, 1996; Mori et Shiio, 1987).

Notons que, le fructose intracellulaire, qui est formée au cours de la croissance à partir du saccharose, est d'abord éliminé par un système d'exportation inconnu, puis est repris et phosphorylé en fructose-1-phosphate par un PTS (Dominguez et Lindley, 1996).

Fig. I.5. Schéma général d'entrés des sucres chez C. glutamicum. PEP : phosphoénolpyrvate ; PYR :pyruvate ;
SP : système perméase ; PTS : système phosphotransférasique.

Le système perméase représente jusqu'à 15% du flux total d'entrée des sucres lors d'une croissance rapide (Cocaign-Bousquet et al., 1996). Ce système catalyse la phosphorylation de glucose par une glucokinase (GLK). (Gourdon et al., 2003; Park et al., 2000).

Une fois l'entrée des sucres et la phosphorylation réalisée, le métabolisme des sucres phosphate se produit via des voies métaboliques centrales.

I.2.2.Glycolyse

La glycolyse joue le principal rôle du métabolisme des sucres Chez C. glutamicum. Elle est l'ensemble des réactions enzymatique qui permettent le passage du glucose -6-phosphate au pyruvate dans le but de générer de l'énergie (3 ATP et 2 NADH). Elle est localisée entièrement dans le cytoplasme et divisée en deux parties :

- Les réactions de la première partie permette la conversion des hexoses-phosphate (G6P) en une molécule de dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et une molécule de glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). (Gunsalus et Shuster, 1961).

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-Les réactions de la deuxième partie permette la conversion des trioses phosphate en pyruvate.

Fig. I.6. Voie de la glycolyse chez C. glutamicum

I.2.3.Voie des pentoses phosphate

Le rôle général de la voie des pentoses phosphate est la synthèse de précurseurs des acides nucléiques tels que le ribose-5-phosphate et de permettre l'utilisation des pentoses ou du gluconate comme source de carbone. Elle est constituée de sept enzymes interagissant avec la voie de la glycolyse. Elle ravitaille la glycolyse au niveau du fructose 6P et de glycéraldéhyde 3P.

-Les trois premières enzymes, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, la 6-phosphogluconolactonase et la 6-phosphogluconate déshydrogénase constituent une voie oxydative irréversible dans laquelle le glucose-6P est converti en ribose-5-P (Ru5P) avec la formation de 2 moles de NADPH par mole de Ru5P.

- Les réactions suivantes sont catalysées par la transaldolase, la transacétolase et la ribose 5-P-phosphate constituent une voie non oxydative et réversible.

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Fig. I.7. la voie des pentoses phosphates chez Corynebacterium glutamicum: (1) :glucose-6-phosphate
déhydrogénase, (2) : 6-phosphogluconolactonase , (3) : 6- phosphogluconate déhydrogénase , (4) :ribose-5-

phosphate isomérase (5), ribulose-5-phosphate epimérase , (6) : transcétolase et (7) : transaldolase .

I.2.4. Cycle de Kreps

Généralement, l'approvisionnement du cycle de Kreps en acétyl-CoA previent de pyruvate quand les cellules poussent sur des sources de carbone à 5 ou 6 carbone ou du lactate.

Chez C. glutamicum, la pyruvate déshydrogénase catalyse la décarboxylation oxydative du pyruvate en acétyl-CoA en aérobiose.

L'acétate kinase (AK) et la phosphotransacétylase (PTA) sont deux activités combinés pour former l'acétyl-CoA lorsque l'acétate est utilisé comme source de carbone par C. glutamicum. (Reinscheid et al., 1999 ; Chiio et al., 1969).

L'acétyl-CoA est condensé avec l'oxaloacétate pour former du citrate qui sera ensuite isomérisé en isocitrate. Au lieu d'être décarboxylé, isocitrate est clivé par l'isocitrate lyase en succinate et glyoxylate.(boulahya, 2010) . L'une des enzymes clés du cycle de Krebs impliquées dans la production du glutamate est le 2-oxoglutarate déshydrogénase (ODH). Elle catalyse la décarboxylation irréversible de 2-oxoglutarate en succinyl-CoA avec libération d'une molécule de NADH. Nakamura et al. (2007) ont montré que l'activité de ce complexe enzymatique diminue au cours de la production du glutamate par induction.

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I.2.5.Voie de biosynthèse du glutamate

Chez les microorganismes, le glutamate est synthétisé par deux voies métaboliques :

-soit par le glutamate déshydrogénase (GDH).

-soit par la glutamine synthétase (GS) couplée avec glutamine amide á-cétoglutarate amino transférase GOGAT.

Fig. I.8. Voies de biosynthèse du glutamate. GDH : glutamate déhydrogénase, GS :
glutamine synthétase, GOGAT : glutamine amide á-cétoglutarate amino-transférase.

La biosynthèse du glutamate chez Corynebacterium est principalement dépendante de l'activité GDH. Celle-ci catalyse la réaction réversible de la synthèse du glutamate et de NADP⁺ à partir d'á- cétoglutarate , de NADPH et d'ammonium lorsque ce dernier est présent à de fortes concentrations (> 1 mM).

L'activité GS est une réaction indésirable lors de la fermentation glutamique car elle utilise une partie du glutamate en synthétisant la glutamine.

La synthèse du GS/GOGAT chez C. glutamicum est induite lorsque la concentration d'ammonium diminue dans le milieu de culture (Tesch et al., 1998; Elke et al., 1993; Börmann et al., 1992).

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I.3. Son de blé

I.3.1.Structure macroscopique

Le grain de blé possède trois parties principales : le germe, l'endosperme et le son.

Fig.I.9. Section longitudinale d'un grain de blé (Boudreau et Ménard, 1992)

La plus grande partie du blé est l'endosperme avec 81- 84,5 %, suivie du son avec 1415 % et du germe avec 3 %.

Le son de blé (Triticum aestivum) est un co-produit de la minoterie, il représente avec la farine et le germe, l'une des trois fractions de la mouture et il sert de barrière protectrice physique ou chimique pour l'endosperme et le germe (Hoseney, 1986; Peterson et Fulcher, 2002). Le son de blé peut être séparé en trois couches selon leur composition et leur position à l'intérieur du grain : la couche à aleurone, la couche intermédiaire et le péricarpe.

La couche à aleurone collée à l'endosperme du grain tandis que le péricarpe est la couche externe du grain. Chaque couche principale du son de blé (aleurone, couche intermédiaire et péricarpe) est constituée de matériel complexe et hétérogène, possédant une composition distincte qui affecte la fonctionnalité et la composition des produits (Izydorczyk et al., 2002).

Chapitre I Etude bibliographique

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Tab.I.1. Composition de différentes couches de son sur base humide de 12 à 14 %. Adapté de Pomeranz (1988)

et Pyler (1988).

	Couche aleurone	Couche intermédiaire	Coche péricarpe
Protéines (N x 507)%	18	9,7	5,0 - 7,6
Cendres (%)	14,3 - 17,2	n.d.	1,7 - 4,3
Matières grasses (%)	7	0,5	1
Cellulose (%)	6	23	32
Arabinoxylanes (%)	30	17 - 30	35
Activité de la protéase^1	4,8 - 6,9	n.d.	n.d.

Protéase : ul de NaOH 0,1N en 24h à 37°C par mm³ de tissu.
n.d.: non déterminé

I.3.2.Structure microscopique

D'un point de vue histologique, le son du blé est un empilement de couches cellulaires très différentes botaniquement, cytologiquement et biochimiquement. Il comprend le

tégument, le manteau, la couche nucellaire et la couche aleurone (Piot, 2000).

? Le tégument est constitué du péricarpe externe et du péricarpe interne

? Le manteau de la graine, est constitué de la testa et d'un film pigmentaire interpénétré. Ces deux tissus sont combinés l'un à l'autre. La testa joue un rôle important dans la circulation de l'eau entre l'extérieur et la graine et participe à la régulation de la germination.

? La couche nucellaire, encore appelée « bande hyaline » ou « épiderme du nucelle ». Elle recouvre immédiatement la couche aleurone et forme une interface qui limite tissus fille/tissus mère et constitue un plan de clivage lors du broyage.

? La couche aleurone, également appelée assise protéique, constitue d'un point de vue histologique la couche externe de l'albumen, elle l'entoure complètement et en fait partie, mais elle ne contient pas d'amidon. Ses rôles physiologiques sont nombreux, en particulier au cours de la germination de la graine.

I.3.3.Composition chimique du son de blé

La répartition des composants du son dans les différentes couches se traduit par une grande hétérogénéité qualitative et quantitative. Outre les nombreuses espèces et variétés de blé, et les divers procédés de mouture, la composition chimique est aussi fonction de la taille de l'amande, de la maturité de la plante, de la taille du germe, de l'épaisseur des couches

Chapitre I Etude bibliographique

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externes, de la durée et des conditions de stockage et du conditionnement des grains avant la mouture et des différences dans les méthodes de dosage utilisées.

Tab I.2 : Compositions chimiques de sons de blé de différentes origines

	(Raynal-Ioualalen, 1996)		(Bataillon et al., 1998)		(Maréchal, 2001)
	Son brut	Son désamidonné	Son brut	Son désamidonné	Son désamidonné
Cellulose*	9,1^(1)	15,5^(1)	11 ,0^(2)	25,0^(2)	18,7^(1)
Hémicelluloses*	37,0^(1)	60,0^(1)	19,0^(2)	45,0^(2)	62,3^(1)
Lignine*	6,7^(1)	8,0^(1)	6,0^(1	3,0^(1)	3,8^(1)
Amidon*	20,0^(3)	n.d.**	29,0^(4)	1,0	n.d.**
Protéines*	14,8^(5)	15,2^(5)	14,0^(5)	9,0^(5)	15,6^(5)
Lipides*	n.d.**	n.d.**	6,0	6,0	n.d.**
Matières minérales*	5,3^(6)	1,0^(6)	4,0^(6)	1,0^(6)	1,5^(6)

* Les résultats sont exprimes en % de la matière sèche. ** n.d. = non déterminé.

1 Cellulose, lignine et hemicelluloses dosees par la methode de Van Soest and Wine (ADF/NDF) (Van Soest et al., 1968).

2 Determinantion simplifiee des monosaccharides neutres par chromatographie gaz-liquide (Hoebler et al., 1989; Gruppen et al., 1992).

3 Methode polarimetrique de Ewers (ISO, 1998).

4 Determination apres traitement termamyl et hydrolyse enzymatique.

5 Dosees par la methode de Kjeldhal (N x 5,7 ou 6,25 selon les sources).

6 Calcination à 550 °C.

Les hémicelluloses sont, après l'amidon, les constituants majoritaires des sons de blé. Elles sont principalement constituées d'arabinoxylanes, comme en témoigne la composition en sucres simples présentée au tableau I.3. Par ailleurs, il peut être observe qu'une part non négligeable de protéines est présente, provenant de la couche aleurone.

Une caractéristique de ces fibres de son est que la fraction en hémicelluloses est particulièrement importante (60 a 70 % de la somme des trois constituants de la fraction fibre) et que la fraction de lignine est peu représentée (généralement inferieure a 10 %) alors que la fraction cellulose est minoritaire (Zeitoun, 2011). Une désamidonnassions du son permet d'augmenter la proportion relative des hémicelluloses qui représentent alors la fraction majoritaire des constituants du son.

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Tab. I.3. Composition en sucre du son désamidonné.

Xylose*	39,2
Arabinose*	25,2
Mannose*	0,9
Galactose*	2,1
Glucose*	32,6

* Les résultats sont exprimes en % de la totalité des carbohydrates doses. La composition en sucres est déterminée après hydrolyse acide et chromatographie en phase gazeuse.

I.3.4.Effets sur la santé

Le blé, particulièrement le son de blé, est une source de protéines, de vitamines et de minéraux. Mais c'est surtout une source de fibres alimentaires.

Tab.I.4.Teneur en fibres alimentaires dans la farine et le son de blé (Nandini et Salimath, 2001).

Type de fibres	Son de blé, (%)
Fibres insolubles	35.8
Fibres solubles	4.0

Selon Bingham et al. (2003), la consommation de fibres alimentaires pourrait réduire le risque de cancer colorectal

Les fibres diminuent de façon modeste, mais significative, le taux de cholestérol sanguin (Caballero et al., 2004).

Nombreuses bactéries du tube digestif étaient capables de métaboliser le son in vitro et, d'autre part, que de nombreux métabolites bactériens du tube digestif apparaissaient, disparaissaient ou étaient quantitativement modifies quand on ajoutait du son au régime alimentaire, divers auteurs ont postulé que cette ingestion de son était capable de modifier la flore microbienne du tube digestif.

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I.3.5.Valorisation des sons de blé

I.3.5.1.Alimentation humaine

Le son de blé est largement utilisé dans le domaine de l'alimentation humaine en tant que `fibres alimentaires', notamment dans le domaine de la boulangerie sous la forme de pains et de biscuits. Ceci signifie qu'il fait partie des aliments, mais qu'il n'est pas dégradé par des enzymes propres à l'homme (Selvendran et al., 1980 ; Ralet et al., 1990). I.3.5.2.Industrie papetière

Le son de blé peut être employé dans les domaines de l'industrie papetière où sa faible teneur en lignine peut représenter un avantage.

I.3.5.3.Applications diverses

Il pourrait être inclus comme agent de charge pour la fabrication des panneaux de particules.

Il a aussi été étudié, pour la fermentation en vue de produire de l'éthanol, de l'acide citrique, des produits de cosmétologie, ou pour la production de champignons ou d'enzymes.

Les arabinoxylanes de son de blé peuvent gélifier grâce aux substituant d'acides phénoliques. Cette propriété leur ouvre des applications médicales sous la forme de gels utilisés pour recouvrir des blessures et accélérer la cicatrisation (Greenshields, 1993). Les propriétés filmogènes des arabinoxylanes de son de blé permettent aussi d'envisager des débouchés dans le domaine de l'enrobage des semences.

I.3.6.Conversion de la biomasse lignocellulosique

I.3.6.1.Préparation de la matière première

Plusieurs opérations (broyage, séchage, stockage...etc) sont importants dans étape de préparation de biomasse lignocellulosique avant de l'introduire dans les principales étapes de transformation.

Le broyage simple sert à fragmenter la biomasse dans le but d'obtenir des tailles de 2 mm afin d'augmenter le rendement et de faciliter la séparation des compositions. I.3.6.2.Prétraitement

Le but de prétraitement est de rendre la cellulose accessible à l'hydrolyse (modifier les propriétés physiques et physicochimiques du lignocellulose) par différentes méthodes.

Il existe trois procédés de prétraitement ; physique, chimique, physicochimique. (Tableau II.3).

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Tab. I.5 : Principaux procédés de prétraitement (Daniel, 2006 ; Marcos et Toshinori, 2007)

	Description
Prétraitement physico- chimique	Thermo hydrolyse	Cuisson à l'eau de la biomasse à des températures de 200- 230°C et P de 50 bar pendant 15 à 60 min.
	Explosion à la vapeur (auto- hydrolyse)	Chauffage rapide de substrat (160 à 260°C) par injection de vapeur à (10 ou 50 bar) puis une détente brutale. cette technique est peu efficace dans le cas des bois tendres.
	Explosion à la vapeur en conditions acides	En présence de H2SO4 ou de SO2 , meilleure pénétration du réactif, amélioration du rendement, toxique, demande limitée en énergie, simplicité de mise en oeuvre, bonne adaptation aux particules de grande taille.
	Explosion au CO2	Explosion à la vapeur dans laquelle le CO2 est un réactif chimique, bonne efficacité.
	Procédé AFEX (Ammonia Fiber Explosion)	La matière lignocellulosique est mise en contact avec de l'ammoniac liquide (50-70°C) et (30 min), plus adapté aux plantes herbacées.
Procédés chimiques	Prétraitement à l'acide dilué	En présence de H2SO4 ou [H3O^+ Cl^-] dilué en proportion de 0,5 à 3%,
	Prétraitement en milieu alcalin	L'ajout de NaOH (8 à 12%) et 80 à 120°C, 30 à 60 min, beaucoup plus efficace sur les résidus agricoles Nécessite de lavage et neutralisation du résidu solide ainsi qu'un recyclage de la soude, relativement onéreuses.
	Procédé organosolv	Solubilisation et extraire la lignine et les hémicelluloses dans un solvant organique, et conduit à un résidu solide de cellulose, en présence de HCl ou H2SO4, permet de récupérer la lignine, mais reste plus onéreuses.
	Procédés d'oxydation	Les hémicelluloses sont dégradées et la cellulose reste intacte, limitation de la production de composés inhibiteurs, la grande quantité d'ozone nécessaire rendant le procédé trop onéreux
	Procédés biologique	Mettant en oeuvre des enzymes, peu de consommation d'énergie, douce sur l'environnement. coût des enzymes lignolytique élèves.
Prétraitements physiques	Prétraitements mécaniques	broyage mécanique, augmenter les surfaces accessibles, énergie trop élevée pour une application industrielle.
	Thermolyse	température < 300°C, décomposition de la cellulose.

Chapitre I Etude bibliographique

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Le choix du prétraitement est fortement dépendant du substrat utilisé. Le procédé de prétraitement universel et idéal n'existe pas.

I.3.6.3.Hydrolyse

Du fait de la structure de la cellulose, de sa cristallinité et de son association avec la lignine et les hémicelluloses encore présentes même après l'étape de prétraitement, son hydrolyse en monomères fermentescibles est une opération difficile qui peut être réalisée par deux méthodes: hydrolyse chimique catalysée par un acide ou hydrolyse enzymatique. I.3.6.3.1.Hydrolyse chimique

A. Hydrolyse à l'acide dilué

Le NREL décrit les conditions d'utilisation suivante : 3 minutes à 190°C en présence de 0.7 % d'acide sulfurique pour la première étape, 3 minutes à 215° C en présence de 0.4 % d'acide sulfurique pour la seconde.

B. Hydrolyse à l'acide concentré

Ce type d'hydrolyse est généralement plus efficace. Elle combine deux étapes :

-Une première étape de décristallinisation de la cellulose.

-Une seconde étape d'hydrolyse par de l'acide concentré.

Dans le procédé Arkenol la première étape est obtenue par l'addition de 70-77 %

d'acide sulfurique à une température < 50° C. ensuit, une dilution à 20-30 % est réalisée par l'ajout d'eau. L'ensemble est chauffé à 100° C pendant 1 heur (Ballerini, 2006).

I.3.6.3.2.Hydrolyse enzymatique

Dans la nature, la biodégradation de la cellulose est essentiellement réalisée par des microorganismes (eubactéries et champignons), bien que certaines bactéries produisent des cellulases ayant une activité spécifique (vitesse d'hydrolyse par unité massique de protéines) élevée.

Les enzymes produites par ces champignons sont récupérés, puis sont mise en contact avec le matériau prétraité en assurant l'homogénéité de la suspension et en maintenant les conditions optimales qui sont pour les cellulases, une température de 45-50 °C et un pH de 4,8. Le temps d'action est fonction de la quantité d'enzymes ajoutée et de leurs activités (Daniel, 2006).

Chapitre I Etude bibliographique

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Tab. I.6.Comparaison des différentes options d'hydrolyse de cellulose

Hydrolyse	Conditions	Avantages	Inconvénients
Hydrolyse à l'acide dilué	215°C, 3min. H2SO4 < 1%.	Rendement 50-70%. Réaction simple.	Risque de dégradation des sucres, les produits.
Hydrolyse à l'acide concentré	50°C , 2-6h. H2SO4 30-70%.	Rendement 90%, rapide, conditions faciles.	Corrosion des matériaux, consommé de l'énergie (recyclage de l'acide), complexité de procédé.
Hydrolyse enzymatique	50°C , pH = 4,8, 1,5jour, cellulase	Rendement 75-95% peu d'effluents, pas corrosif	Long temps, le coût d'enzyme.

I.4. Modèle expérimentales

I.4.1.Définition et domaine d'application des plans d'expériences

Le modéle expérimentale est une méthode de planification ou d'organisation des expériences scientifiques et industrielles dans le but de retirer l'information correspondante à l'objectif fixé préalablement (Pierre, 2005; Pierre, 2008). Leur but est l'obtention un maximum d'informations avec un minimum d'expérimentations par rapport à l'objectif que fixé.

Différents domaines des sciences comme l'agronomie, la biologie, les calculs numériques, la chimie, l'électronique, le marketing, la mécanique, la physique... appliquent ces plans d'expériences (Pierre, 2005).

I.4.2. Différents types des plans d'expériences

I.4.2.1.Plans de criblage

Il existe plusieurs types de ces plans, parmi les on site :

I.4.2.1.1.Plans de Taguchi

Afin d'obtenir des améliorations rapides de la qualité et des coûts de production, la méthode de Taguchi vise à combiner un ensemble de techniques. De nombreux statisticiens, Hunter (1985), Kackar (1985), Box (1988), ont donc essayé de retrouver dans sa présentation les idées générales de la statistique sous-jacentes à sa démarche dont les justifications étaient

Chapitre I Etude bibliographique

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un peu confuses au départ. La "méthode Taguchi" vise essentiellement à simplifier la mise en oeuvre des plans d'expériences.

I.4.2.1.2. Plans de Plackett et Burman (PB)

Ces plans sont quelques fois dits plans de criblage ou matrices d'Hadamard et se présentent sous forme de matrices carrées orthogonales dont les éléments sont égaux à #177;1. Ils sont utilisés dans le but de sélectionner les facteurs les plus influents sur la réponse Y et où les interactions sont négligeables ou supposées négligeables.

I.4.3.2. Plans de modélisation

Il existe plusieurs types de ces plans, parmi les on site :

I.4.3.2.1. Plans de Box-Behnken (BB)

Box et Behnken (1960) ont introduit un type différent de plans d'expériences pour les modèles du deuxième ordre qui permettent l'estimation de certaines interactions.

Le modèle Box-Behnken est un modèle factoriel fractionnaire à trois niveaux développée par Box et Behnken (Box et Behnken, 1960). Le modèle peut être considéré comme une combinaison entre un modèle factoriel à deux niveaux et un modèle à blocs incomplets. Dans chaque bloc, certain facteurs sont soumis à toutes les combinaisons du modèle factoriel, tandis que les autres facteurs sont maintenus à leurs niveaux centraux.

Dans la Figure I.10, le modèle polynomial du second ordre peut être affiché comme une parcelle de surface ou un tracé de contours en variant seulement deux niveaux de facteurs, tout en gardant les autres niveaux de facteur constants.

Fig.I.10. a,b (a) : Surface plot, (b) : Contour plot d'une réponse (Wang and Wan, 2009) Xi : Facteur 1. Xj : Facteur 2. Y : La répons

CHAPITRE II

MATéRIELS ET MéThODES

Chapitre II Materiels et Méthodes

II.1.Appareils et produits chimiques

Appareils

Produits chimiques et réactifs

- Incubateur avec un système d'agitation et de régulation de température, New Brunswick Sientific.

- Autoclave, SELECTA.

- Bain-marie agité, Bioblock Scientific.

- pH mètre, MeterLab. - Spectrophotomètre,

SPECTRONIC 20 Genesys.

- Balance de précision, KERN ALJ 220-4M.

- Vortex, stuart.

- Centrifugeuse, Hettich EBA 12. - Centrifugeuse, SIGMA 3- 16 PK. - Agitateur magnétique, Heidolph. - Agitateur magnétique, Fisher

Scientific.

- Lecteur de microplaque, Biotek.

22

- Mg SO4.7H2O, Fluka.

- Fe SO4.7H2O, Panreac. - FeCl3.6H2O, Panreac.

- ZnSO4.H2O, Merck.

- Cu Cl2.2H2O, Riedel-de Haën. - Mn SO4. H2O, Prolabo.

- Na2 HPO4, Fluka.

- KH2PO4, SIGMA-ALDRICH.

- Na Cl, Scharlau.

- (NH4)2 SO4, SIGMA-ALDRICH.

- -CaCO3, Prolab.

- Glucose, SIGMA-ALDRICH.

- Urée, SIGMA-ALDRICH.

- Thiamine, SIGMA.

- Biotine, SIGMA-ALDRICH.

- Ca Cl2, Fluka.

- Bitaine, Sigma.

-Acide sulfurique 96%, SIGMA-ALDRICH.

- NaOH, Biochem Chemopharma.

- Kit enzymatique pour le dosage du glutamate, r-

biopharm.

Chapitre II Materiels et Méthodes

23

II.2.Microorganisme utilisé

La souche utilisée dans ce travail est un Corynebacterium glutamicum 2262, qui a été fourni par le laboratoire de Génie des Procédés Biotechnologique, (Institut National Polytechnique de Lorraine Nancy - France). Les caractéristiques de la souche sont présentées dans le tableau (Collins et Cummins, 1986).

Caractères principaux

· Bactérie à Gram positif

· Bacille : droit ou légèrement incurvé, ovale, massue, souvent réarrangées en V

· Colonies jaunes pâle à jaune, régulières et lisses sur gélose

· Dimension : 0,7 à 1 um x 1 à 3 um

· Auxotrophe pour la biotine

· Non-sporulant

· Non-mobile

· Alcoolo-acido-résistantes

· Aérobie facultative

· Production d'acide glutamique

· % G+C : 53 à 58%

· Paroi : présence d'acide méso-diaminopimétique et d'arabinogalactane Condition de culture

· pH optimal de croissance : 7,3 à 7,4

· Température optimale de croissance : 25 à 37°C Substrats consommés (+) ou non consommés (-)

· (+) Glucose, Frucose, Saccharose, Maltose, Tréhalose et Mannose

· (-) Rhamnose, Galactose, Raffinose, Arabinose, Lactose, Xylose, Dextrine, Salicine, Amidon

Activités enzymatique caractéristiques

· (+) : Catalase, Uréase, réduction de nitrate en nitrite, Hippurate

· (-) : Hydrolyse gélatine, hydrolyse caséine, Esculine

Tab II.1. Caractères générales de C. glutamicum d'après Collins et Cummins, (1986)

Chapitre II Materiels et Méthodes

24

II.3.Conditions de culture II.3.1. Milieu de préculture

Le milieu utilisé comme un milieu de base pour la croissance de C. glutamicum est le BMCG (Basal Medium Corynebacterium Growth). Les éléments qui composent ce milieu sont donnés dans le tableau suivant

Tab. II.2. Composition de milieu BMCG

Eléments	Pré-culture (g/l)
Mg SO4	0,40
Fe SO4	0,040
Fe Cl3	0.004
Zn SO4	0,001
Cu Cl2	0,0004
Mn SO4	0,004
Na2 HPO4	15,00
KH2PO4	3,00
Na Cl	1,00
(NH4)2 SO4	8,00
Glucose	34,00
Urée	4.00
Thiamine	0,01
Biotine	0.0002
Ca Cl2	0,084

Chapitre II Materiels et Méthodes

25

II.3.2. Milieu de production

Le milieu BMCG à été remplacé par un milieu naturel contenant de l'hydrolysat de son de blé. Le milieu est ensuite enrichi par des sources d'azote (sulfate d'ammonium et urée), des vitamines (biotine et thiamine) et des sels minéraux.

II.3.3.Stérilisation

La stérilisation des solutions est réalisée par autoclavage ou par filtration. L'Erlenmeyer dans lequel se déroule la fermentation est stérilisé à l'autoclave avec le milieu de production. La stérilisation est effectuée à 121°C pendant 15 minutes. Pour éviter les réactions de brunissement non enzymatique, l'hydrolysat de son de blé et les solutions supplémentaires (sources d'azote et sels minéraux) sont stérilisés séparément. Les solutions de vitamines sont stérilisées par filtration sur filtres Minisart (0.2um).

? L'hydrolyse de son de blé

Le son de blé est tout d'abord broyé mécaniquement jusqu'à obtention de fragments de taille inférieure à 2 mm, puis macéré dans l'acide sulfurique pendant 14 heurs. Le mélange est ensuit chauffé dans un bain marrie agité. L'extrait obtenu est centrifugé à 4000 rpm pendant 20 minutes dans le but de séparer les débris cellulosiques. Le surnageant récupéré est utilisé en tant que source de carbone après être neutraliser (pH 7,6). Les paramètres d'hydrolyse (concentration d'acide sulfurique, la température d'hydrolyse et le temps) sont à optimisés.

II.4. Procédé de culture discontinue II.4.1.Conservation de la souche

La conservation de la souche est réalisée sur milieu à base de glycérol (glycérol stock). Une culture de la souche C. glutamicum 2262 est effectuée en milieu liquide BMCG. Après atteindre la phase exponentielle de la bactérie, le glycérol stérile est ajouté à raison de 20%. La suspension bactérienne est ensuite répartie dans des tubes stériles (1 ml) puis congelée à - 20°C.

II.4.2.Propagation de la souche (préculture)

Les cultures stocks sont décongelées au fur et à mesure des besoins, puis utilisées. Le tube de conservation sert à inoculer le milieu de préculture. La préculture est prise à l'ensemencement en phase exponentielle de croissance (14 heures).

Chapitre II Materiels et Méthodes

26

i ii iii

Fig.II.1. Propagation de C. glutamicum 2262

i-Tube de conservation à -20°C

ii-Préculture (milieu BMCG ,33°C ,14 heurs, 330 rpm) iii-Culture en Erlenmeyer (milieu de production) II.4.3.Culture en Erlenmeyers

Après l'ajustement de pH à 7,6, le milieu de culture est réparti dans des Erlenmeyers de 500 ml à un volume de 100 ml. Puis ils sont stérilisés à 121°C pendant 15 minutes. Le milieu de culture est inoculé par la préculture à raison de 10% (v/v), ensuit incubé à 33°C sous agitation de 330 rpm dans un incubateur New Brunswick Scientific. (Figure II.2). Les cultures sont initiées à 33°C jusqu'au l'atteint de la phase exponentielle de croissance (d'environ 5 heurs) puis un choc thermique est réalisé à 39°C dans le but d'induire la production du glutamate.

Fig .II.2. Incubateur New Brunswick Scientific

II.4.3.1.Protocole des fermentations discontinues

Le volume final de réaction est fixé à 100 ml. L'inoculum est de 10%. Les conditions de culture sont :

? pH ajusté à 7,6

? Température de croissance : 33°C

Chapitre II Materiels et Méthodes

27

? Agitation : 330 rpm

? Température d'induction : 39°C

? Temps d'induction : 5h

? Les prélèvements sont effectués au cours de la fermentation. La densité optique est lue immédiatement et le reste de l'échantillon est centrifugé. Le surnageant est récupéré puis congelé à -20°C, les différents dosages étant réalisés ultérieurement.

II.5. Méthode d'analyses

II.5.1.Estimation de la biomasse

La biomasse est suivie par la détermination de la densité optique. Cette mesure est faite à 570 nm. Une mesure gravimétrique a été réalisé pour établi les corrélations entre la densité optique et le poids sec des cellules. Le coefficient de conversion de la densité optique en biomasse est de 0,4.

II.5.2.Dosage de glutamate

Le glutamate est dosé par un kit enzymatique (Biopharm). Le principe de la réaction colorimétrique est la suivante:

Glutamate déshydrogénase

Glutamate + NAD + H2O á-cétoglutarate + NADH +NH4
Diaphorase

NADH + iodonitrotétrazolium ???????? NAD + formazan

L'apparition de formazan est détectée à 492 nm. L'intensité de coloration est proportionnelle à la concentration en glutamate. Une courbe étalon dont la gamme s'étend de 0 à 0,07 (g.l-1) de glutamate permet de déterminer la concentration en glutamate des échantillons. Au-delà de cet intervalle une dilution est nécessaire.

II.5.3.Dosage de sucres totaux

Le dosage des sucres totaux est réalisé selon la méthode de Dubois (1956). Brièvement, la solution à analyser est chauffée à 100° C pendant 5 minutes en présence de phénol à 5% et d'acide sulfurique concentré. Avant analyse, le mélange est ramené à température ambiante. Chaque analyse est réalisée trois fois. L'étalonnage est réalisé avec une solution de glucose. La gamme étalon est réalisé avec 5 à 6 concentrations comprises entre 10 et 100 mg de glucose /L. Chaque point est réalisé 3 fois. La concentration de l'échantillon est calculée en équivalents glucose, en utilisant une courbe de calibration construire à partir de solutions standards de D- glucose.

II.6. EXPLOITATION DES DONNES EXPERIMENTALES II.6.1 Calcule des paramètres cinétiques en réacteur discontinu

V : Volume de milieu (l).

X : Concentration en biomasse (g/l).

S : Concentration en substrat (sucres totaux) (g/l).

P : Concentration en produit (L'acide glutamique) (g/l).

Chapitre II Materiels et Méthodes

28

Culture discontinue

II.6.1.1. Vitesse de réaction

A partir des cinétiques de croissance, de consommation des substrats et de formation de produits, il est possible de calculer les différentes vitesses à chaque instant t en déterminant la dérivée de la variable considérée par rapport au temps.

Les bilans matières de la biomasse X, du substrat S et du produit P, donnent :

Y P

_{S S}

_S - _S

_YX :

_YP :

Avec :

^rX

vitesse de croissance (g/l.h)

vitesse de consommation du substrat (g/l.h)

vitesse de production d'un produit (g/l.h)

vitesse spécifique de croissance (h^-1)

vitesse spécifique de consommation du substrat (g/g.h)

vitesse spécifique de production d'un produit (g/g.h)

Les rendements globaux Yx/s et Yp/s sont définis comme les rapports de masse

de biomasse (poids de cellules sèches) (X) ou de métabolites formés (P) par la masse de

substrat carboné consommé (S) depuis le début de la fermentation:

_YX

₀

_S

Avec :

Concentration de substrat dans le fermenteur à t = 0 (g/l)

Concentration de produit dans le fermenteur à t = 0 (g/l)

_{P?P0 S0 X-X0} Rendement apparent de production de biomasse à partir du substrat (g/g)

Rendement apparent de production de produit à partir du substrat (g/g)

_{P P 1}

? 0

II.6.1.2. Productivité volumétrique

_{V d}

La productivité volumétrique est la quantité par unité de temps et de volume du fermenteur

?

Chapitre II Materiels et Méthodes

29

Avec :

t : durée de la fermentation (h)

: Productivité volumétrique (g/l.h).

CHAPITRE III

RéSULTATS ET DISCUSSION

Chapitre III Résultats et Discussion

30

III.1. OPTIMISATION DE TROIS PARAMETRES D'HYDROLYSE ACIDE DES SUCRES DE SON DE BLÉ

Dans cette partie nous avons appliqué le modèle statistique Box-Behnken à 3 facteurs et trois niveaux, afin d'optimiser les paramètres d'hydrolyse du son de blé.

Le modèle Box-Behnken est un modèle statistique permettant de limiter le nombre d'essais à réaliser lors d'une expérimentation afin de déterminer une réponse pour un grand nombre de facteurs étudiés. En effet, un phénomène étudié peut toujours être modélisé sous la forme mathématique : Y = f(x1, x2,...,x_n).

Y étant la réponse à laquelle on s'intéresse et qui est dans notre cas les sucres de son de blé et la production du glutamate, f la fonction mathématique exprimant le mieux les variations de la réponse selon les différentes valeurs des facteurs (ou variables appelées xi).

Le nombre des expériences (N) nécessaire pour le développement du modèle Box-Behnken est défini comme N= 2k (k-1) + C0, (ou k est le nombre des facteurs et C0 est le nombre des points centrales). Le Box-Behnken est un bon modèle pour la Méthodologie nommée Surface de Réponse (MSR) (Ferreira et al., 2007):

Cette étude est basée sur deux points essentiels, d'une part, la mise en évidence des paramètres opératoires potentiellement importants dans l'hydrolyse acide de la matière lignocellolosique de son de blé et, d'autre part, l'application d'un modèle statistique de Box-Behnken à trois niveaux, afin d'optimiser les paramètres de cet hydrolyse. L'impact de ces trois facteurs : la concentration de l'acide sulfurique, la température d'hydrolyse et le temps d'hydrolyse ont été évalués (Tableau III.1). Comme le montre le Tableau III.1, les trois facteurs choisis pour cette étude ont été désignés comme X1, X2, X3 et prescrits en trois niveaux, codés 1, 0, -1 pour une valeur élevée, intermédiaire et faible, successivement.

La matrice du modèle et les résultats des expériences sont donnés dans le Tableau III.2. L'analyse de la régression polynomiale a été réalisée par le logiciel JMP 11 Discovery. L'expression mathématique caractérisant l'équation de régression est la suivante :

Y (sucres g/l) = 27,16 - 9,67 X1 + 1,62 X2 + 3,21 X3 - 5,79 X1 X2 + 6,18 X1 X3 + 2,88 X2 X3 - 7,06 X1 ² - 4,09 X2 ² + 1,78 X3 2

Chapitre III Résultats et Discussion

31

Tab. III.1. Niveaux choisis pour l'optimisation des paramètres d'hydrolyse de son de blé

Variables	Codes des		Niveaux des variables
	variables	-1	0	1
Acide sulfurique (%)	X1	20	45	70
Température d'hydrolyse (°C)	X2	50	70	90
Temps d'hydrolyse (min)	X3	30	60	90

La réponse pour l'hydrolyse acide des sucres de son de blé a montré une grande hétérogénéité des résultats, qui prouve l'importance de ces facteurs sur le procédé d'hydrolyse. En effet, la concentration des sucres a changé suivant les niveaux des facteurs dans une gamme de 4,22 à 34,33 g.l^-1 (Tableau III.2). Cette variation reflète l'importance de l'optimisation pour atteindre une meilleure hydrolyse des sucres. En effet, l'écart de réponse du modèle par rapport aux résultats expérimentaux est représenté par les variations résiduelles. Ces dernières montrent qu'en moyenne, la différence (entre les sucres mesurés et celui simulés) des concentrations des sucres est proche de 2, ce qui indique que le modèle estimé est proche de la réalité expérimentale (Figure III.1).

Tab III.2. Matrice du modèle Box- Benhken et les résultats des expériences

Expériences	Acide sulfurique (%)	Température d'hydrolyse °C	Temps d'hydrolyse (min)	Sucres mesurés (g/l)	Sucres simulés (g/l)	Variation résiduelle (g/l)
1	45	70	60	23,81	22,52	1,29
2	45	50	30	21,75	22,27	-0,52
3	45	90	90	29,36	28,84	0,52
4	20	70	30	34,33	29,6	4,72
5	70	70	90	12,79	17,51	-4,72
6	45	70	60	22,03	22,52	-0,49
7	70	90	60	8,56	6,35	2,2
8	45	50	90	23,04	19,97	3,06
9	70	70	30	4,22	5,36	-1,14
10	45	70	60	21,72	22,52	-0,8
11	45	90	30	15,07	18,13	-3,06
12	20	70	90	26,99	25,84	1,14
13	20	50	60	14,06	18,26	-4,2
14	20	90	60	27,71	29,37	-1,66
15	70	50	60	12,38	10,71	1,66

Chapitre III Résultats et Discussion

33

Fig. III.1. Corrélation entre les sucres observés et les sucres prévues.

L'analyse de régression polynomiale réalisée par le logiciel IMP 11 Discovery a permis de confirmer la fiabilité du modèle quadratique. En effet, la valeur de la probabilité P a été utilisée pour vérifier la signification de chaque coefficient, qui indique également les effets de l'interaction entre les variables. Plus la valeur de P est faible, plus l'effet du paramètre étudié est significatif. Les coefficients de régression ainsi que les valeurs de probabilité correspondantes (P) sont donnés dans le Tableau III.3. Dans notre cas la valeur de P du modèle est de 5% avec un intervalle de confiance de 95%.

A partir des donnés du Tableau III.3, on peut conclure que le coefficient linéaire du X1 (la concentration d'acide sulfurique) est très significatif avec une valeur de P de 3%. Les autres coefficients X2 et X3 et les coefficients d'interaction _X1.X3 ^et _X2.X3 et le coefficient quadratique X3² ont un effet positif sur l'hydrolyse des sucres avec une valeur de P non significative. Le coefficient d'interaction _X1.X2 et les coefficients quadratiques X1² et X2² ont un effet négatif sur l'hydrolyse des sucres avec des valeurs de P non significatives.

Chapitre III Résultats et Discussion

34

Tab. III.3. Analyse de régression des résultats obtenus à partir du modèle Box Behnken.

Variables	Estimation	Erreur standard	t ratio	Prob. > |t|
Constant	27,16	5,622372	4,83	0,0048*
X1	- 9,67	3,442986	-2,81	0,0376*
X2	1,62	3,442986	0,47	0,6576
X3	3,21	3,442986	0,93	0,3936
X1 X2	- 5,79	4,869117	-1,19	0,2872
X1 X3	6,18	4,869117	1,27	0,2599
X2 X3	2,88	4,869117	0,59	0,5793
X1^2	- 7,06	5,067937	-1,39	0,2223
X2^2	- 4,09	5,067937	-0,81	0,4557
X2^3	1,78	5,067937	0,35	0,7389

III.2. Validation du modèle

L'ajustement du modèle a été vérifié par le coefficient de corrélation (R²) qui est de 0,89, indiquant que 89% de la variabilité dans la réponse pourraient être estimé par le modèle. Les conditions optimales de l'hydrolyse des sucres de son de blé estimées par l'équation du modèle sont les suivantes : 19,13% pour l'acide sulfurique, de 89,37 °C pour la température d'induction, de 63,29 min pour le temps d'hydrolyse.

La concentration de l'acide sulfurique estimée par le modèle (19,13%) est inferieure à la concentration minimale proposée (20%), donc une autre optimisation par le modèle de Box-Behnken doit être effectuée avec une concentration maximale de l'acide sulfurique de 20 %.

Tab. III.4. Niveaux choisis pour la deuxième optimisation des paramètres d'hydrolyse de son de blé

Variables	Codes des		Niveaux des variables
	variables	-1	0	1
Acide sulfurique (%)	X1	2	11	20
Température d'hydrolyse (°C)	X2	50	70	90
Temps d'hydrolyse (min)	X3	30	60	90

Chapitre III Résultats et Discussion

35

L'écart de réponse du modèle par rapport aux résultats expérimentaux est représenté par les variations résiduelles (Tableau III.5). Ces dernières montrent qu'en moyenne la différence entre la concentration des sucres mesurés et celui simulés est inférieure à 1, ce qui indique que le modèle estimé est proche de la réalité expérimentale (figure III.1).

Fig.III.2. Simulation des sucres.

Tab. III.5. Matrice expérimentale du modèle factoriel Box-Behnken.

Expériences	Acide sulfurique (%)	Température d'hydrolyse °C	Temps d'hydrolyse (min)	Sucres mesurés (g/l)	Sucres simulés (g/l)	Variation résiduelle (g/l)
1	11	70	60	17,44	19,01	-1,57
2	11	50	30	6,55	7,47	-0,92
3	11	90	90	20,72	19,80	0,92
4	2	70	30	18,25	16,82	1,43
5	20	70	90	24,32	25,75	-1,43
6	11	70	60	20,66	19,01	1,65
7	20	90	60	21,44	20,93	0,51
8	11	50	90	12,59	10,78	1,81
9	20	70	30	21	19,70	1,31
10	11	70	60	18,92	19,01	-0,09
11	11	90	30	17,58	19,39	-1,81
12	2	70	90	13,18	14,49	-1,31
13	2	50	60	2,88	3,39	-0,51
14	2	90	60	25,47	25,08	0,39
15	20	50	60	21,29	21,68	-0,39

Chapitre III Résultats et Discussion

36

L'analyse de régression polynomiale réalisée par le logiciel JMP11 Discovery a permis de confirmer la fiabilité du modèle. En effet, la valeur de la probabilité P a été utilisée pour vérifier la signification de chaque coefficient, qui indique également les effets de l'interaction entre les variables. Dans notre cas la valeur de P du modèle est de 0,5% avec un intervalle de confiance de 99,5 %.

L'expression mathématique caractérisant l'équation de régression est la suivante :

Y (sucres g/l) = 1,61 - 3,53 X1+5,23 X2+ 0,92 X3 - 5,61 _X1X2 + 2,09 X2X3 - 0,72 _X1X3 + 1,79

2

X1 ² -3,03 X2 ² + 19 X3

Les coefficients de régression, avec les valeurs de la probabilité P correspondantes, pour le modèle des concentrations des sucres sont présentés dans le Tableau III.6. A partir de ces derniers, on peut conclure que les coefficients linéaire X1 et X2 (acide sulfurique (%) et température d'hydrolyse °C) est significatif avec une valeur de P de 0,5%, le coefficient d'interaction X1 X2 (acide sulfurique * température d'hydrolyse) est significatif avec un P de 0,5% Le coefficient quadratique X2² (température d'hydrolyse) a un effet significatif avec un P de 5%. Les coefficients d'interaction X2 X3 (température d'hydrolyse * temps d'hydrolyse) et X1 X3 (acide sulfurique * temps d'hydrolyse) ont un effet négatif sur l'hydrolyse des sucres et c'est la même chose pour l'effet quadratique X2² (température d'hydrolyse * température d'hydrolyse). Le coefficient quadratique X3² (temps d'hydrolyse * temps d'hydrolyse) et le coefficient linéaire X3 (temps d'hydrolyse) ont un effet positif sur l'hydrolyse des sucres avec un P non significatif.

Tab.III.6. Analyse de régression des résultats obtenus à partir du modèle Box-Behnken.

Variables	Estimation	Erreur standard	t ratio	Prob. > |t|
Constant	19	1,2044	15,78	<,0001*
X1	3,53	0,7375	4,79	0,0049*
X2	5,23	0,7375	7,10	0,0009*
X3	0,92	0,7375	1,26	0,2635
X1 X2	-5,61	1,0430	-5,38	0,0030*
X1 X3	2,09	1,0430	2,01	0,1005
X2 X3	-0,72	1,0430	-0,70	0,5180
X1 ^2	1,79	1,0856	1,65	0,1591
X2^2	-3,03	1,0856	-2,79	0,0383*
X3^2	-1,61	1,0856	-1,49	0,1971

Chapitre III Résultats et Discussion

37

Les figures III.(3, 4 et 5) représentent l'effet la température d'hydrolyse, le temps d'hydrolyse et la concentration de l'acide sulfurique ainsi que leurs interactions réciproques sur la concentration des sucres. La concentration maximale des sucres se situe à 85°C pour la température d'hydrolyse, à 68 min pour le temps d'hydrolyse et à 11% pour l'acide sulfurique.

Fig.III.3. Courbes d'isoréponse et surface de réponse de la concentration des sucres de son de blé montrant l'effet
de l'interaction entre la température d'hydrolyse et le temps d'hydrolyse.

Fig.III.4. Courbes d'isoréponse et surface de réponse de la concentration des sucres de son de blé montrant l'effet
de l'interaction entre l'acide sulfurique et le temps d'hydrolyse.

Chapitre III Résultats et Discussion

38

Fig.III.5. Courbes d'isoréponse et surface de réponse de la concentration des sucres de son de blé montrant l'effet de l'interaction entre l'acide sulfurique et la température d'hydrolyse.

Validation du modèle

L'ajustement du modèle a été vérifié par le coefficient de corrélation (R²) qui est de 0,96, indiquant que 96% de la variabilité dans la réponse pourraient être estimé par le modèle. Les conditions optimales de l'hydrolyse des sucres se son de blé estimées par l'équation du modèle sont les suivantes : 11,83 % d'acide sulfurique, 85°C pour la température d'hydrolyse et 65 min pour le temps d'hydrolyse. Afin de vérifier la validité du modèle, les conditions théoriques optimales ont été appliquées. La concentration des sucres obtenue sous ces conditions est de 35 g/l.

III.3. Cinétiques de C. glutamicum 2262 sur milieu de culture à base d'hydrolysat de son de blé

Cette partie consiste à tester le milieu de culture à base de l'hydrolysat de son de blé et étudier les besoins nutritionnels de C. glutamicum 2262 pour la croissance et la production du glutamate.

Les cinétiques de croissance, de consommation des sucres et de production de glutamate sur le milieu testé sont montrées sur les figures III.6.

Chapitre III Résultats et Discussion

²⁷

²⁴

²¹

³³

³⁰

¹⁸

¹⁵

¹²

⁰

⁹

⁶

³

^{0 2 4 6 8 10 12 14 16 18}

^{Temps (h)}

^{Biomasse (g/l)}

^{Glutamate (g/l)}

^{Sucres totaux (g/l)}

39

Fig.III.6. Cinétiques de croissance, de consommation des sucres et de production de glutamate sur le milieu testé

A partir de ces courbes, plusieurs paramètres ont été calculés.

Tab. III.7. Paramètres cinétiques de C. glutamicum 2262 sur le milieu à base d'hydrolysat de son de blé.

Paramètres cinétiques Valeurs des paramètres

X (g/l) 4,28

Glutamate (g/l) 6,63

umax (h^-1) 0,20

q_p (g./g.h) 0,40

ä (g./l.h) 0,66

Taux de consommation des sucres (%) 96,42

(X): biomasse, _(umax): vitesse spécifique maximale de croissance, (q_p): vitesse spécifique de la production du glutamate, (ä): productivité volumétrique de production d'acide glutamique.

En effet pendant la croissance à 33°C, les sucres sont métabolisés pour être transformés principalement en biomasse. Après un choc thermique de 33 à 39°C la biomasse augmente et atteint un maximum de 4,28 g.l^-1 ensuite elle diminue et se stabiliser au bout de fermentation, et le flux du carbone se dévier vers la production de 6,63 g.l^-1 du glutamate après 10h de fermentation .La vitesse spécifique maximale de croissance _(umax) atteint une valeur de 0,20 h^-1 et la quasi totalité des sucres est consommé (96,42%)

Ces résultats montrent que l'hydrolysat de son de blé est favorable à la croissance et à la production d'acide glutamique à partir de C. glutamicum 2262.

40

Conclusion

L'objectif de ce travail était l'optimisation des paramètres d'hydrolyse de son de blé dans le but de l'utiliser comme milieu de culture naturel de C. glutamicum 2262 pour la production glutamtique.

La première partie de ce travail a essentiellement été basée sur l'optimisation des paramètres d'hydrolyse de son de blé en utilisant le model statistique Box Behnken. Nous avons montré que les valeurs optimales de l'hydrolyse sont les suivants : 85°C pour la température d'hydrolyse, 68 min pour le temps d'hydrolyse et 11% pour la concentration d'acide sulfurique.

Dans la deuxième partie on a démontré que l'hydrolysat de son de blé contient les différents éléments nutritionnels (source de carbone, source d'azote et sels minéraux) qui peuvent être utilisés par C. glutamicum 2262 afin de produire l'acide glutamique.

Finalement, l'objectif du travail est atteint. Cependant de nombreuses perspectives peuvent être envisagées :

- L'enrichissement de milieu de culture par d'autres sources d'azote et de vitamine.

- Utilisation de model Plakett Burmen pour étudier l'effet des éléments nutritionnels sur la production glutamique.

- Utilisation le mode semi-continu ou le mode continu pour une meilleure productivité.

- Valorisation des autres parties de blé tel que la paille de blé.

- Utilisation des enzymes spécifiques capables d'augmenter le rendement de l'hydrolyse de cellulose.

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