III. Milieu pour culture cellulaire
III.1. Milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle
Medium)
Le milieu DMEM (LONZA lab. LOT N 2MB103 CAT BE12-604f) est un
milieu de culture cellulaire nécessaire au maintien et à la
prolifération des cellules BHK21.
Il s'agit d'un milieu avec L Glutamine et 4.5g de glucose. Il
contient plusieurs composantes comme les vitamines, les acides aminés et
des sels inorganiques. Nous avons ajouté au milieu DMEM plusieurs autres
Figure 12: Milieu DMEM
ISTMT-IPT 2012-2013
éléments comme l'antibiotique
(pénicilline et streptomycine), le sérum de veau foetal et la
tryptose phosphate, ce qui va favoriser la croissance cellulaire. Le milieu
DMEM est utilisé à différentes concentrations: 0%, 2%, 5%
et 10% sérum de veau foetal (SVF) (annexe 1) selon les étapes de
la culture cellulaire ou au cours de l'inoculation du virus. Lors de la culture
cellulaire le milieu DMEM est conservé à +4°C (Le milieu
doit être conservé au froid et l'abri de la lumière).
III.2. Additifs pour milieu DMEM
? Sérum de veau foetal (SVF)
La présence de sérum est indispensable pour la
croissance des cellules.
Figure 13: SVF
Le sérum de veau foetal (SVF) (GIBCO BRL Cat No 10106-060
lab .LOT N40G8843F) possède divers facteurs de croissance qui permettent
la prolifération cellulaire, des hormones, des protéines, des
facteurs d'attachement, comme la fibronectine, qui contribuent à une
bonne adhésion, indispensable à la division cellulaire, et assure
un rôle protecteur.
Le SVF est d'abord décomplémenté
à 55°C pendant 30 min pour éliminer son action toxique sans
détruire les protéines.
Le sérum doit être conservé à
-20°C et à +4°C après de son utilisation.
? Solution d'antibiotique (ATB)
Figure 14: Antibiotiques
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Les antibiotiques (ATB) (annexe 1) utilisés sont la
pénicilline G et la streptomycine. La pénicilline G (Pharmachim
Bulgaria Lot NO 702321.1H) est utilisée contre les contaminations
bactériennes surtout par les bactéries Gram positives alors que
la streptomycine (Pharmadrug Production GmbH, Lot NO 4140) agit sur certains
bacilles Gram négatifs et certaines cocci Gram positives.
Ces deux ATB sont fournis sous forme de poudre. Ils sont
préparés sous forme de mélange dans 100ml d'eau
distillée.
ISTMT-IPT 2012-2013
Cette solution d'ATB est utilisée pour réduire le
risque de contamination dans la culture cellulaire.
Les solutions d'antibiotiques sont conservées à
+4°C.
? Tryptose phosphate
La Tryptose phoshate (DIFCO lab LOT 128487) (annexe 1) est un
additif (Vitamine) ajouté au milieu de culture DMEM. Le pH du Tryptose
phosphate est égal à 7,3.
Nous avons mélangé la Tryptose phosphate avec
l'eau distillée (29,5g/L) puis stérilisé à
l'autoclave.
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Figure 15: Tryptose phosphate
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III.2.1. La trypsine
La trypsine (GIBCO BRL lab.lot N3055949 Cat N25300-054, flacon
de 100ml) est une enzyme utilisée en culture cellulaire pour
détacher des cellules adhérentes sur les flasques de culture.
Figure 16: Trypsine
Le traitement par la trypsine affecte un peu la viabilité
des cellules. C'est pourquoi l'action de la trypsine doit être
limitée et inhibée par l'ajout du SVF.
Cette solution est conservée à -20°C et
à +4°C après son utilisation. La trypsine est activée
à 37°C.
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