E) Tests à Montpellier (Cirad)
Parmi les clones qui se révèleront "Très
résistants" ou "Résistants" au P. palmivora et à
M. perniciosa en Guyane, certains seront expédiés
à Montpellier pour y être testés contre P.
megakarya (et également, contre des souches très agressives
de M. perniciosa).
Les baguettes des clones retenus seront
expédiées à Montpellier dès la conclusion des tests
en Guyane. Dix plants de chaque clone seront nécessaires (5 pour les
tests M. perniciosa et 5 pour les tests-feuille vis-à-vis de
P. megakarya). Des semences seront donc expédiées de
Guyane six mois auparavant, afin de disposer en temps voulu de porte-greffes au
bon stade. Les baguettes des clones seront expédiées en deux
fois, à 2 mois d'intervalle, en juin et août de l'année 2.
Les tests à Montpellier commenceront lorsque les plants greffés
auront 6 mois.
F) Prélèvements des endophytes
Les souches endophytes des champignons Trichoderma
sont capables de former des associations endophytes dans les troncs des
arbres. Certains de ces endophytes montrent un bon potentiel pour le
contrôle des maladies du cacaoyer (Evans et al., 2003 ; Holmes
et al., 2004 ; Crozier et al. , 2006 ; Samuels et al.,
2006 ).
Les cultures de Trichoderma et/ou autres seront
obtenues à partir de deux sources : les endophytes des troncs et des
feuilles de cacao (et d'autres espèces ligneuses), d'une part, et les
endophytes issus du sol, d'autre part.
- Collecte d'endophytes des troncs
La diversité des champignons endophytes sera
étudiée dans des populations naturelles de cacaoyers. Les
prospecteurs rechercheront des cacaoyers sauvages et y échantillonneront
les endophytes des feuilles et des troncs. On recherchera en particulier des
cacaoyers apparemment résistant à la maladie du
balai-de-sorcière.
Echantiionnage
Le nombre d'arbres à échantillonner
dépendra du nombre de cacaoyers sauvages trouvés et sera donc
déterminé au moment de la prospection, l'objectif étant
d'échantillonner au moins 6 arbres sur chaque site. Les données
GPS de chaque arbre seront enregistrées.
Des échantillons issus de cacaoyers introduits
(collection de Paracou-Combi) et de la végétation dominante
environnante seront également récoltés, afin de comparer
les différentes espèces d'endophytes.
Isolement
On suivra le protocole d' Evans et al (2003).
Une surface d'écorce d'environ 8 x 6 cm sera
prélevée sur chaque tronc à hauteur d'épaule (1,5
m) à l'aide d'une machette désinfectée (alcool + flamme).
La partie exposée sera nettoyée avec un scalpel (lame n° 22)
et la couche sous-jacente avec une lame n° 10a. Dix tranches triangulaires
d'aubier (0,8 x 0,5 cm) seront prélevées et
transférées individuellement (avec des pinces stériles)
dans des boîtes de Petri (3 cm de diamètre) contenant deux types
de milieux : 5 à base de 20 % de PDA (Potato Dextrose Agar) et d'une
solution de 10 mg/l de pénicilline-streptomycine, et 5 de MEA (Malt
Extract Agar) + chloramphenicol (0,05 g/l). Les boîtes de Petri seront
scellées avec du ruban adhésif et conservées en
boîtes plastiques. Les fenêtres ouvertes dans les troncs seront
obturées immédiatement avec un mastic horticole pour blessures.
Tous les instruments seront désinfectés à l'alcool (+
flamme). Les boîtes de Petri seront envoyées au laboratoire de
l'USDA à Beltsville (USA) avec un permis APHIS (Animal and Plant Health
Inspection Service).
Les cultures seront examinées pendant une période
de 8 semaines, en incubation à 25°C. Du mycélium et des
spores seront isolés dès leur apparition.
- Collecte d'endophytes des feuilles
Echantiionnage
Sur les mêmes arbres, on prélèvera des
feuilles. De même, des échantillons de feuilles issus de la
végétation dominante seront également
récoltés, ainsi que des cacaoyers introduits, afin de comparer
les différentes espèces d'endophytes.
Isolement
Six feuilles seront récoltées sur chaque arbre.
Les feuilles seront celles de la dernière poussée foliaire et
devront être exemptes de dommages d'insectes ou de traces de maladies. 16
segments de la lamelle moyenne de chaque feuille (2 mm2 chacun)
seront prélevés, à égale distance de la nervure
médiane et de la bordure, et stérilisés dans des
tubes Sterlin de 8 ml contenant une solution d'hypochlorite de
sodium (à 5 %) pendant 5 mn. Ensuite, les segments seront rincés
successivement dans 3 tubes Sterlin contenant de l'eau distillée
stérile. Les segments seront ensuite transférés (avec des
pinces stérilisées à l'alcool) dans des boîtes de
Petri contenant de l'agar (comme dans le cas des échantillons de
troncs). L'isolement sera réalisé autant que possible dans les 4
heures suivant la collecte des feuilles, avec une cellule portable.
- Echantillonnage des Trichoderma des sols.
Des Trichoderma seront isolés du sol autour
des arbres sélectionnés, ce qui donnera une indication possible
de l'origine des endophytes des troncs. Au maximum 5 échantillons de
sols seront collectés dans un rayon de deux mètres autour du
tronc de chaque cacaoyer échantillonné. Les Trichoderma
peuvent être isolés à l'aide d'un milieu spécifique
sélectionné (Papavizas & Lumsden 1982). Des
échantillons de quelques grammes de sol seront prélevés
sous la litière, stockés dans des sacs en papier et isolés
jusqu'au retour au laboratoire.
- Essais in vitro du potentiel de contrôle microbien
Une évaluation in vitro du mycoparasitisme et
de la production d'antibiotiques des cultures sera réalisée, si
nécessaire. Une des hypothèses à tester est que le genre
Trichoderma offre le meilleur potentiel de contrôle microbien
parce qu'il ne comprend pas de pathogène de la plante et parce qu'il a
déjà été montré que des Trichoderma
sont efficaces dans le contrôle des maladies pour beaucoup de
cultures.
Aucun essai in vitro n'est fiable à 100%, mais
il est essentiel d'avoir une méthode d'estimation du potentiel du
contrôle microbien. Pour les essais sur le mycoparasitisme potentiel des
espèces de Moniliophthora, ce projet utilisera le test de
pré-inoculation modifié comme décrit par Evans et
al (2003).
Une boîte de Petri (9 cm) est inoculée d'un
côté avec le pathogène-cible. Le pathogène se
développe et remplit la boîte ; une bande d'agar (env 15 x 3 mm)
contenant le mycopathogène proposé est déposée au
côté opposé, puis la boîte est mise à incuber
(une semaine à 25 °C). Des prélèvements dans l'agar
(de 3 mm de diamètre) sont effectués le long d'une ligne allant
du point d'inoculation du pathogène à celui de l'antagoniste. Les
divers prélèvements sont placés séparément
dans des boîtes de Petri contenant du milieu PDA 20% et incubées
à 25°C. Les boîtes sont ensuite examinées pour
déterminer à quelle distance (du point de
prélèvement au point d'inoculation du myco-pathogène) on
peut retrouver le myco-pathogène.
Cette procédure est répétée chaque
semaine pendant trois semaines. Le fait de retrouver le myco-pathogène
testé dans tous les prélèvements indique un
mycoparasitisme efficace.
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