o Anticorps primaires
o Kit de révélation
o Chromogène : DAB (di-amino-benzidine)
Tampons
o Toluène
o Bains d'alcool à 100%, 90% et 70%
o Tampon TBS
Matériel
o Des micropipettes
o Les lames super Frost +
o Lamelles
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Patiely Prince Darel Ray
Anticorps primaire
Anticorps primaires Clone Source Provenance Signal
EMA E29 Monoclonal sourie DAKO
Nous avons appliqué la technique selon la
procédure de type EnVision FLEX+ de DAKO
La première étape a consisté en un
prétraitement ; ce prétraitement concernait des coupes de 3u
séchées en 60 minutes à l'étuve à 37 °C afin
d'obtenir une bonne adhérence des coupes sur les lames ; Ensuite le
traitement proprement dit a été réalisé selon les
six (6) étapes ci-après :
- Déparaffinage et
réhydratation
Le déparaffinage a été
réalisé par deux bains de toluène. La réhydratation
s'est faite dans les bains d'alcool de concentration décroissante ; (i)
: alcool 97%, (ii) : alcool à 95% ; (iii) : alcool à 70%, puis
d'eau pendant 5 min à chaque fois. Chaque bain d'alcool a duré 5
minutes. - Démasquage antigénique
Le démasquage des sites antigéniques a
été effectué à la chaleur. Les tissus ont
été incubés à l'aide d'une cocotte minute contenant
une solution de démasquage à PH9 pendant 20 minutes. Cette
solution a été préalablement diluée à l'eau
distillée au 10x. Cette solution a été portée
à ébullition puis les lames ont été
immergées pendant 10 minutes.
Cette étape était suivie de 20 minutes de
refroidissement à température ambiante sur la paillasse et d'un
rinçage à l'eau distillée pendant 5 minutes, ensuite on a
sorti le bac et on l'a laissé se refroidir sur la paillasse pendant 20
minutes avant de le rincer à l'eau distillée pendant 5
minutes.
- Blocage des peroxydases endogènes
A ce moment 150 ul d'eau oxygénée (H2O2) ont
été appliqué par coupe pendant 30 minutes,
puis un rinçage au tampon de lavage a été
réalisé (TBS) pendant 5 minutes.
- Marquage immunohistochimique
C'est l'étape décisive de la technique. On
applique pendant 30 minutes environ 150 ul d'anticorps primaire monoclonal anti
MUG1, avec comme clone E29, les isotopes : IgG2a, Kappa ; dosé
a 12 ml commercialisé par DAKO; puis rinçage en tampon de lavage
(=TBS) EnVision Flex pendant 5 minutes.
- Révélation
Le polymère (pret à l'emploi) EnVision FLEX a
été incubé pendant 30 minutes, suivi d'un Rinçage
au TBST EnVision Flex (solution diluée au 20x dans de l'eau
distillée) pendant 5minutes.
Ensuite le chromogène a été
incubée pendant 30 minutes. Il s'est agi de la DAB reconstituée
(1mL de substrat + 1 goutte de chromogène, pour 10 tests), puis un
rinçage à l'eau distillée a été
réalisé pendant 5minutes.
- Contre révélation
Il s'agit de la dernière étape ; elle consiste
d'abord à appliquer de l'hématoxyline prête à
l'emploi pendant 5 minutes, suivie d'un lavage à l'eau distillée
pour bleuir les noyaux. Ensuite un Montage des lames avec un milieu de montage
aqueux et des lamelles a été effectué.
Ainsi donc, l'étude immunohistochimique de la
glycoprotéine MUC1 nous a conduit d'utiliser
deux critères
nécessaires à fin de déterminer le marquage : la
positivité et l'intensité du signal.
Le signal a été défini positif ou
négatif en fonction du pourcentage des tissus marqués,
de
sorte que :
- De 0 à 50% : signal négatif ;
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- = 50% : signal positif.
De ce résultat positif, l'intensité du signal a
été aisément appréciée : soit faiblement
intense, moyennement intense, ou fortement intense.
Cette lecture a été faite au microscope de
marque Olympus C X 31, aux grossissements 10, 20, et 40. Les images du
marquage ont été prises avec un appareil photo numérique
de marque SONY.
