Memoire Online - Détermination "in vitro " du pouvoir antibactérien des huiles essentielles d'eucalyptus, myrte, clous de girofle et sarriette, et leur application à la conservation de la viande fraà®che type hachée.

Ces derniers temps, plusieurs questions se sont soulevées concernant la sécurité des produits chimiques conservateurs utilisés en industrie alimentaire. En effet, la peroxydation des lipides produite au cours des processus de fabrication et de stockage des aliments sous l'effet des radicaux libres oxygénés (RLO) conduit à des modifications de goût, d'odeur et de couleur et parfois constituent un risque pour la santé du consommateur et, par conséquent à la perte de la qualité et de la sécurité des aliments (MAU et al., 2004). Les antioxydants de synthèse sont généralement utilisés en industrie alimentaire pour retarder l'oxydation des lipides se sont avérés responsables d'effets indésirables. En effet, l'hydroxyanisole butylé (BHA) et l'hydroxytoluène butylé (BHT) sont suspectés avoir des effets négatifs sur la santé du consommateur (NAMIKI, 1990). D'un autre côté, l'usage extensif des agents antibactériens chimiques dans la médication humaine ainsi que dans les élevages animaux conduit à la sélection de souches bactériennes résistantes.

Ainsi, les H.E. commencent à avoir beaucoup d'intérêt comme source potentielle de molécules naturelles bioactives (BOUHDID et al., 2006).

Les H.E. possèdent de nombreuses activités biologiques. Selon les travaux de OCHOA (2005); FREEMAN et CAREL (2006), ces activités sont liées essentiellement à la composition chimique, aux groupes fonctionnels des composés majoritaires de ces extraits et à leurs effets synergiques.

Empiriquement reconnue depuis des siècles, la confirmation scientifique de l'activité antimicrobienne des H.E. est récente. Elle ne date que du début du siècle dernier avec les travaux du Dr Gattefossé, le père de l'aromathérapie en France (PIBIRI, 2005).

Beaucoup d'études ont été réalisées au sujet de l'activité antimicrobienne des extraits de plantes et de leurs H.E. (BOUSBIA, 2004) qu'elles soient citées dans des ouvrages, dans des journaux spécialisés de microbiologie ou présentées lors de congrès d'aromathérapie scientifique. Cette activité a été utilisée dernièrement pour la conservation du patrimoine bibliographique des musées évitant ainsi l'altération des ouvrages par des petits animaux nuisibles, et elle est naissante pour traiter la qualité de l'air dans les bâtiments (PIBIRI, 2005).

On attribue aux extraits de plantes aromatiques et notamment aux H.E. un certain nombre d'activités biologiques potentielles susceptibles de trouver des applications en agroalimentaire (ALITONOU et al., 2005).

Les activités antimicrobiennes des plantes aromatiques et médicinales sont connues depuis l'antiquité. Toutefois, il aura fallu attendre le début du XXe siècle pour que les scientifiques commencent à s'y intéresser. Ces propriétés sont dues à la fraction d'H.E. contenue dans les plantes (CAILLET et al., 2007 ; BOUAOUN, 2007).

À la manière des agents chimiques, on distingue deux sortes d'effets des H.E. sur les microorganismes: une activité létale (bactéricide et fongicide) (CARSON et RILEY, 1995) et une inhibition de la croissance (bactériostatique) (FREEMAN et CAREL, 2006).

Au cours d'un travail au laboratoire, DORMAN et DEANS (2000) ont démontré que l'activité bactéricide des H.E. vis-à-vis des cellules bactériennes pourrait être expliquée par une dénaturation des protéines provoquée par le rôle solvant et déshydratant des huiles.

Une étude réalisée par COSENTINO et ses collaborateurs (1999) pour la détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et des Concentrations Minimales Bactéricides (CMB) pour 4 variétés de Thym (Thymus vulgaris) portant sur 14 souches bactériennes (dont Staphylococcus aureus) ont montré que dans la majorité des cas, les valeurs des CMI sont identiques aux CMB. Les mêmes auteurs ont conclu que les H.E. testées dans cette étude sont bactéricides.

D'autre part, certaines études ont été réalisées par BILLERBECK (2000) dans le but d'illustrer les dommages provoqués par certaines H.E. sur des cibles bactériennes à travers des images de haute résolution en utilisant la microscopie électronique.

Face au problème soulevé depuis plusieurs années par la résistance des bactéries aux antibiotiques, la seule alternative fiable à l'usage des antibiotiques semble être celle des H.E. Connue de façon empirique depuis des siècles, leur efficacité anti-infectieuse a été scientifiquement démontrée "in vitro" et "in vivo" (CAREL, 2006).

De nombreux chercheurs de l'université de Manchester (Royaume-Uni) ont montré que ces produits sont actifs contre des germes pathogènes résistants aux antibiotiques tels que S. aureus résistant à la méthicilline (MRSA), Streptococcus pneumoniae résistant à la pénicilline, Enterococcus faecium résistant à la vancomycine, Candida albicans résistant à l'azolé et Herpes simplex résistant à l'acyclovir. Ceci est dû au mécanisme original des H.E. (AVERTIT, 2004; BOUAOUN et al., 2007). Selon INOUYE et ABE (2007), l'efficacité des antibiotiques dépend de la dose et du temps de contact. Des expérimentations sur des animaux de laboratoire a permet de savoir que l'efficacité des antibiotiques reste toujours limitée. Les H.E., contrairement aux antibiotiques, sont constituées de si nombreuses molécules que les bactéries ne peuvent y résister en mutant (ENRICO et al., 2004).

Les mécanismes d'action des H.E. et leur sélectivité envers certaines bactéries restent jusqu'à présent mal élucidés (HAMMER et al., 1999; DORMAN et al., 2000; BAGAMBOULA et al., 2004). Selon ces auteurs, cette sélectivité est le résultat de la composition variée des fractions actives des huiles, qui présentent souvent des actions synergiques. Il semble que le mécanisme d'action de ces huiles est lié essentiellement à la structure de la paroi et à la perméabilité membranaire des bactéries à Gram+ et Gram-.

RAYOUR (2003) a examiné le mécanisme d'action des H.E. des Clous de girofle et d'origan (Origanum vulgare) simultanément avec ceux de deux de leurs composants, le thymol et l'eugénol, sur des bactéries: E. coli et Bacillus subtilis et qui ont été utilisées

respectivement comme modèles de bactérie Gram+ et Gram-. Les deux H.E. tout comme leurs deux composants ont été capables d'induire une lyse cellulaire. Cette action a été démontrée par la libération de substances absorbantes à 260 nm. Cette libération de substances associée à la rapide mortalité bactérienne pourrait être la conséquence de lésions sur les enveloppes induites par les agents antibactériens. L'utilisation d'un microscope électronique a permis de montrer que les H.E. attaquaient en même temps les membranes et les parois cellulaires.

Les travaux de BURT (2004) ont montré qu'une H.E. active exercera son pouvoir antimicrobien par son interférence avec la bicouche lipidique de la cellule cible grâce à sa propriété hydrophobe, ce qui entraîne une perturbation de la perméabilité et perte des constituants de la cellule. En plus, cette réaction varie en fonction de la nature de la bicouche lipidique, ce qui explique la résistance des bactéries Gram- (MAHMOUD et al., 2004). En outre, DABBAH et ses collaborateurs (1970) ont mis en évidence la grande sensibilité des bactéries Gram+ par rapport aux Gram- et aux champignons. Dans la même démarche d'étude, GORDON et ses collaborateurs (1973) et MAHMOUD et ses collaborateurs (2004) ont suggéré que l'effet antimicrobien qu'exercent les H.E. pourrait être expliqué par la destruction de certains systèmes enzymatiques incluant ceux qui participent dans la production d'énergie cellulaire et la production des composés structuraux. MAHMOUD et ses collaborateurs (2004), GUESMI et BOUDABOUS (2006) quant à eux, ont avancé l'hypothèse d'inactivation et destruction du matériel génétique et, enfin CAILLET et ses collaborateurs (2007) ont signalé que les H.E. empêchent la multiplication des bactéries, leur sporulation et la synthèse de leurs toxines.

Dans une autre étude qui a été réalisée par FREEMAN et CAREL (2006), l'H.E. d'arbre à thé (Leptospermum citratum) a provoqué des fuites d'ions potassium (K+) au niveau des membranes cellulaires d'E. coli et S. aureus. Cette fuite de K+ est la toute première preuve de l'existence de lésions irréversibles au niveau de la membrane de la bactérie. Le thymol, le carvacrol, des composants actifs d'H.E., rendent perméable la membrane des bactéries, un effet précurseur de leur mort. Les H.E. ont donc bien des propriétés bactéricides.

D'après CAILLET et ses collaborateurs (2007), l'action antimicrobienne des H.E. se déroule en trois phases:

- Attaque de la paroi bactérienne par l'H.E., provoquant une augmentation de la perméabilité puis la perte des constituants cellulaire;

- acidification de l'intérieur de la cellule, bloquant la production de l'énergie cellulaire et la synthèse des composants de structure;

Chez les bactéries à Gram+, le peptidoglycane est très épais et associé à des protéines pariétales exposées et à des structures polyosidiques (acides lipoteichoïques, acides

teichoïques...). Par contre chez les bactéries à Gram-, le peptidoglycane est très fin et associé à une enveloppe externe complexe définissant un espace périplasmique. Cette membrane externe est une bicouche lipidique asymétrique hydrophobe constituée de phospholipides, de protéines (porines...) et lipopolysaccharides (LPS). L'espace périplasmique est rempli d'enzymes qui dégradent les substances complexes pour qu'ils puissent traverser la membrane cytoplasmique, et inactivent les produits chimiques toxiques (antibiotiques, métaux lourds...) (BERCHE, 2003).

La résistance des bactéries à Gram- aux glycopeptides et aux macrolides est due à l'incapacité de ces molécules de franchir la membrane externe (BERCHE, 2003).

FREEMAN et CAREL (2006), ont signalé que les groupes moléculaires avec les plus puissantes actions antibactériennes sont également des antifongiques efficaces, mais ils doivent être utilisés sur de plus longues périodes. Expérimentalement, les H.E. des plantes aromatiques et médicinales ont fait preuve de leur efficacité antifongique parfois même supérieure à celle des agents antifongiques commerciaux.

Une étude a porté sur les effets antifongiques de l' H.E. de thym (RASOOLI et al., 2006), et plus particulièrement sur les conséquences de cette huile sur l'ultrastructure du champignon Aspergillus niger. Elle a tout d'abord permis de déterminer grâce à la microscopie électronique, que lorsque A. niger était exposé à l'H.E., celle-ci provoquait des dommages irréversibles sur la membrane cellulaire ainsi que sur les organites du champignon (BARRAL et al., 2007). Alors qu'elles inhibent la germination des spores, l'élongation du mycélium, la sporulation et la production de toxines chez les moisissures (CAILLET et LACROIX, 2007).

L'action fongicide des H.E. des clous de girofle et d'origan a été testée sur un modèle de levure Saccharomyces cerevisiae. La lyse des cellules de levure a été montrée par la libération de substances absorbant à 260 nm. Des analyses au microscope électronique ont montré que la surface des cellules traitées par les H.E. d'origan et de clous de girofle était significativement endommagée (CHAMI, 2005).

L'huile de la Menthe pouliot (Mentha pulegium) dont le composé majoritaire est la R (+) pulégone (82%) est dotée d'un fort pouvoir antifongique contre Pénicillium et Mucor (BELGHAZI et al., 2002).

Une étude a évalué l'activité antifongique de l'huile des clous de girofle sur toute une variété de champignons pathogènes, incluant ceux responsables d'infections urogénitales (AHMAD et al., 2005). Selon CHAMI (2006), l'huile des clous de girofle a démontré une puissante activité antifongique contre des champignons pathogènes opportunistes tels que Candida albicans, Cryptococcus neoformans et Aspergillus fumigatus.

GIORDANI et KALOUSTIAN (2006) ont souligné que les composés terpéniques des H.E. et plus précisément leurs groupements fonctionnels tels que les phénols et les aldéhydes réagissent avec les enzymes membranaires et dégradent la membrane plasmique entraînant une fuite du contenu cytoplasmique et donc la mort de la levure (COX, 2000).

D'après GIORDANI et KALOUSTIAN (2006), les principales espèces botaniques productrices d'H.E. dotées d'un pouvoir inhibiteur de la croissance des levures sont les suivantes:

- Sassafras albidum (sassafras), Laurus nobilis (laurier-sauce), Aniba rosaeodora; - Artemisia absinthium (armoise amère ou absinthe);

Les résultats expérimentaux de ces deux derniers auteurs ont montré que les huiles présentant un fort pouvoir antifongique, telles que celles de thym et de cannelle, pourraient constituer une solution alternative intéressante dans les thérapies antimycosiques.

Le carvacrol et le thymol, deux composés rencontrés dans la majorité des espèces botaniques possèdent une activité antifongique contre les mycètes phytopathogéne (SCHWAMMLE et al., 2001).

De nombreuses familles de molécules chimiques rencontrées dans les extraits végétaux ont montré "in vivo" une activité antivirale et, parmi elles, les monoterpénols et les monoterpénals (FREEMAN et CAREL, 2006).

Selon les travaux d'INOUYE et ABE, (2007), il existe des H.E. de plantes exotiques très puissantes qui ont un fort pouvoir antiviral et qui sont connues pour leur efficacité.

Les H.E. sont sélectivement absorbées et perturbent les fonctions des membranes biologiques de la cellule, sur la mitochondrie et autres organites vitales pour tous les organismes hormis les virus (les H.E. ne sont actives que sur les virus à enveloppe comme celui de la grippe et du VIH (virus de l'immunodéficience humaine).

Certaines études ont montré que l'activité biologique des H.E. est supérieure à celle de ses composés majoritaires testés séparément. Les composés purs, le thymol et le carvacrol ont un net effet synergique, ce qui expliquerait les différentes activités des chémotypes de Thyms. L'aldéhyde cinnamique est généralement indifférent aux deux phénols (LAHLOU, 2004).

Les effets antimicrobiens des associations d'H.E., comme pour les associations d'antibiotiques, sont définis selon quatre interactions possibles:

- Indifférence: l'activité d'une H.E. n'est pas affectée par l'autre: (A + B) = effet A ou effet B.

- Addition: l'effet de l'association est égal à la somme des effets de chaque H.E. étudiée isolément, à la même concentration que dans l'association: (A + B) = effet A + effet B.

- Synergie: l'effet est significativement supérieur à la somme de chaque H.E. étudiée isolément, à la même concentration: (A + B) > effet A + effet B.

- Antagonisme: l'association diminue l'activité de l'une ou l'autre des H.E. Elle est inférieure à la somme des effets de chaque H.E. prise séparément: (A + B) < effet A ou effet B.

Cependant, une étude réalisée par SKANDAMI et ses collaborateurs (2001) ne corrobore pas les effets de synergie mentionnés. Une combinaison de concentrations comparables en thymol et en carvacrol reproduit bien l'inhibition de l'H.E. mais les autres composés minoritaires ont pour effet de diminuer l'effet des principaux composés actifs phénolés.

Dans une étude réalisée par PIBIRI (2005), il a été observé que des associations d'H.E. de cannelle et de thym sont synergiques vis-à-vis de S. aureus. En revanche, elles sont indifférentes sur le genre Bacillus; par contre sur P.aeruginosa et E. coli (Gram-) de telles associations ne sont pas plus efficaces et sont souvent indifférentes. En revanche la cannelle testée individuellement est plus efficace que celle de thym, contrairement aux cas de présence de bactéries à Gram+.

De récentes études (CAILLET et LACROIX, 2007) montrent qu'une H.E. contient souvent de 50 à 100 molécules différentes et peut à l'extrême en comprendre jusqu'à 500. Sa composition biochimique n'est par ailleurs jamais rigoureusement identique. Il est impossible de reproduire en laboratoire cette complexité présente à l'état naturel. C'est ce qui explique notamment la grande efficacité des H.E. dans le cadre de la lutte contre les bactéries, les champignons ou les virus.

Selon BOUAOUN et ses collaborateurs (2007), la plupart des composés chimiques des H.E. sont dotés de propriétés antimicrobiennes, mais ce sont les composés volatils majeurs qui présentent les propriétés antimicrobiennes les plus importantes, et en particulier les phénols, les alcools et les aldéhydes (voir tableau II): carvacrol (origan, sarriette), eugénol (feuille de cannelle de Ceylan, clou de girofle), linalool (coriandre), cynnamaldéhyde (cannelle de Chine), thymol (thym).

L'activité des H.E. est souvent réduite à l'activité de ses composés majoritaires, ou ceux susceptibles d'être actifs. Évalués séparément sous la forme de composés synthétiques, ils confirment ou infirment l'activité de l'H.E. de composition semblable. Il est cependant probable que les composés minoritaires agissent de manière synergique. De cette manière, la valeur d'une H.E. tienne à son "totum", c'est à dire dans l'intégralité de ses composants et non seulement à ses composés majoritaires (LAHLOU, 2004).

Les phénols sont responsables des altérations irréversibles au niveau de la membrane bactérienne. Le thymol et l'eugénol sont responsables de l'activité fongicide (BENNIS et al., 2004) et bactéricide des H.E. qui en contiennent (COX et al., 2000). La molécule de thymol a un effet inhibiteur et létal sur diverses souches, dont E. coli et S. aureus, sur lesquelles elle provoque des fuites d'ions potassium (K+). En revanche elle n'est pas active sur P. aeruginosa (WALSH et al., 2003). Plus les teneurs en phénols sont élevées, plus les H.E. sont efficaces (COSENTINO et al., 1999).

Tableau II: Bioactivité de quelques principaux terpènes rencontrés dans les H.E. (HERNANDEZ et OCHOA, 2005).

Composés aromatiques	Formules développées			Caractères physicochimiques	Teneur de quelques plantes	Propriétés
	Exemples
				Densité: 0,98g/ml	-Thym (T. vulgaris)
				PM: 150,2	33%
					-Origan (origanum vulgare) 76%	-Stimulantes;
						-Toniques;
						-Antiseptiques;
						-Bactéricides;
	*carvacrol*				-Girofle	-Fongicides;
					(S. aromaticum)	-Antivirale;
					82%	-Antiparasitaires;
*Phénols*					-Bay St Thomas	-Irritantes
*Phénols*					(P. racemosa) 60%	-Irritantes
					-Poivre (P. dioica)
				Densité: 1.07g/ml PM: 164.2	54%
	*Eugénol*
				Densité: 0.88g/ml	-Palmarosa
				PM: 154.3	(C. martinii) 75-
					95% (C. helichrysum	-Anti-inflammatoire;
					spp.) 80-90%	-Antiseptiques; -Bactéricides;
*Alcools*	*Géraniol*				-Citronelle	-Fongicides; -Antivirale;
*Terpéniques*					(C. winterianus) 12- 18%	-Neurotoniques
				Densité: 0.86 g/ml	-Citronelle
				PM: 156,3	(C. winterianus)
					11-15%
	*Citroneiol*
*Aldéhydes Terpéniques*		*Citronellal*		Densité: 0.89 g/ml PM: 154,30	-Citronelle (C. winterianus) 35- 45% -Eucalyptus citronne (E. Citriodora) 90 %	-Antifongiques; -Toxicité liée à la présence du groupe aldéhyde; -Insecticide.
*Cétones*			*Carvone*	Densité: 0,96 g/ml PM: 150,2	-Carvi (Carum carvi), 50%	-Calmantes; -Antivirales; -Antifongiques; -Neurotoxiques; -Antiépileptique.
Hydrocarbures aliphatiques, sesquiterpènes	*Limonène*			Densité: 0,96 g/ml PM: 150,2	-Carvi (Carum carvi), 45%	-Fongistatique; -Bactériostatique; -Insecticides; -Nematicide; -Herbicide.

La technique de détermination du pouvoir antimicrobien des H.E. a une grande influence sur les résultats. Les difficultés pratiques viennent de l'insolubilité des constituants des H.E. dans l'eau, de leur volatilité, de la nécessité de les tester à de faibles concentrations et, des problèmes de standardisation des méthodes (BOUSBIA, 2004).

6.1- Aromatogramme

L'aromatogramme est basée sur une technique utilisée en bactériologie médicale, appelée antibiogramme ou méthode par diffusion en milieu gélosé ou encore méthode des disques. Cette méthode a l'avantage d'être d'une grande souplesse dans le choix des H.E. testées, de s'appliquer à un très grand nombre d'espèces bactériennes, et d'avoir été largement évaluée

par 50 ans d'utilisation mondiale (FAUCHERE et AVRIL, 2002). Il s'agit d'une méthode en milieu gélosé à l'agar1 réalisée dans une boîte de Pétri.

Le contact se fait par l'intermédiaire d'un disque de papier sur lequel on dispose une quantité donnée d' H.E. (Figure 13).

Le protocole des microatmosphères est techniquement proche de celui des aromatogrammes. Cette méthode en boîte de Pétri constitue une première approche pour l'étude de l'activité antimicrobienne des vapeurs de produits volatils (BILLERBECK, 2003).

Selon BOUSBIA (2004), cette méthode consiste à déposer un disque de papier filtre imprégné d'H.E. au centre du couvercle d'une boîte de Pétri (figure 14), sans que l'H.E. entre en contact avec la gélose ensemencée par les micro-organismes. La boîte est hermétiquement fermée. Il se produit une évaporation des substances volatiles dans l'enceinte de la boîte et les cellules sensibles de l'inoculum sont inhibées. La lecture du test porte donc sur la croissance ou non de l'inoculum se traduisant par un halot qui sera mesuré par un pied à coulisse.

Cette méthode ne quantifie pas l'activité antimicrobienne réelle des H.E. elle montre seulement la sensibilité du microorganisme présent aux constituants volatils à la température d'incubation (BOUSBIA, 2004).

La technique par contact direct consiste à mettre en présence l'H.E. et les micro-organismes, puis à observer la croissance de ces derniers. Le contact peut avoir lieu en milieu gélosé ou liquide (BOUSBIA, 2004).

Fig. 15: Schéma représentant la technique de contact direct (MEZAOUR, 2006).

C'est une méthode qui a été proposée par Cooper et Woodman en 1946, et reprise par la suite par Schroder et Messing en 1949, elle assure une diffusion radiale de l'H.E. à partir d'un puits en donnant une zone d'inhibition claire et facilement mesurable. La méthode consistait à découper un trou circulaire vertical dans la gélose et à y verser une solution d'H.E. de concentration connue. L'H.E. diffuse radialement créait une zone d'inhibition circulaire à la surface de la gélose préalablement ensemencée avec la suspension bactérienne (DORMAN et DEANS, 2000).

Détermination "in vitro " du pouvoir antibactérien des huiles essentielles d'eucalyptus, myrte, clous de girofle et sarriette, et leur application à la conservation de la viande fraà®che type hachée.

Introduction

6.1- Aromatogramme