3- Tests d'activité antimicrobienne des H.E.
3.1- Critères de sélection des
souches
Le choix des souches est basé sur plusieurs
paramètres:
- Les souches sont d'origine hospitalière, responsables de
Toxi-infections Alimentaires (TIA) (S. aureus, S. paratyphi A.);
- pour leurs fréquences élevées à
contaminer les denrées alimentaires et particulièrement la viande
et produits carnés;
- les souches sont choisies pour leur résistance
naturelle à divers types d'agents antimicrobiens. (S. aureus
est souvent retenu comme bactérie-test dans les normes
d'évaluation de l'activité des antiseptiques et
désinfectants (AFSSA, 2003).
3.2- Souches bactériennes
Six souches bactériennes ont été
utilisées dans notre travail. Des bactéries Gram-positif (G+):
S. aureus et B. cereus, et des bactéries
Gram-négatif (G-): S. paratyphi A., S. flexneri,
E. coli et P. aeruginosa. Cinq (05) de ces souches
bactériennes ont été isolées cliniquement à
l'Hôpital Universitaire de Tizi Ouzou tandis que la souche P.
aeruginosa a été isolée directement à partir
de la viande et produit carnés au niveau du Laboratoire
Vétérinaire Régional de Draa Ben Khedda (Tizi Ouzou).
Les souches qui ont été testées, nous ont
été en partie, aimablement fournies par Dr HOUALI Karim,
Maître de conférences (Département de Biochimie
Microbiologie, Faculté des Sciences Biologiques et des Sciences
Agronomiques, Université Mouloud Mammeri Tizi Ouzou). Les souches ont
été reçues dans des tubes à gélose
inclinée, conservés à une T° de
réfrigération (2#177;1 °C). La souche de P. aeruginosa
nous a été également, aimablement fournie par
Melle MALKI Ouiza du Laboratoire Vétérinaire
Régional de Drâa Ben Khedda (Tizi Ouzou).
3.3- Confirmation des souches
Pour chacune des souches un pré-enrichissement a
été effectué sur le milieu d'isolement sélectif
(cf. figure 20) puis une coloration de Gram a été
réalisée selon le modèle suivant :
- Préparer un frotti ;
- recouvrir le frotti avec de violet de Gentiane ; laisser agir
1mn ; rincer à l'eau distillée ;
- verser du Lugol et le laisser agir pendant 1 mn ;
- décolorer à l'alcool à 95°, entre 15
et 30 secondes ; rincer à l'eau distillée ;
- fixation avec de la fuchsine pendant 10 à 30 secondes ;
rincer à l'eau distillée ; - sécher au-dessus de la flamme
d'un bec Bunsen ;
- observation au microscope optique à l'objectif x 100
à immersion, les Gram+ se colorent en violet tandis que les Gram-
apparaissent colorés en rose.
Tableau IV : Coloration de Gram et morphologie des
souches bactériennes utilisées.
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Souches
|
Milieu de culture
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Gram
|
Morphologie microscopique
|
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S. aureus
|
Gélose Chapman
|
+
|
Coccobacilles en grappes de
raisin
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B. cereus
|
Gélose lactosée
au
bromocrésol
pourpre (BCP)
|
+
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Bacilles
|
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S. paratyphi A
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Gélose Hektoen
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_
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Coccobacilles
|
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S. flexneri
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Shigelles
Salmonelles (SS)
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_
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Coccobacilles
|
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E. coli
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Gélose Hektoen
|
_
|
Bacilles
|
Fig. 20: Aspect des souches bactériennes
repiquées sur milieux spécifiques. -
Confirmation des souches de S. aureus
Test catalase
Ensemencer des boîtes de gélose Chapman par
l'inoculum. Incuber entre 33 et 37 °C pendant 24 à 48 h. Les
colonies jaunes entourées d'une zone jaune, sont des Staphylocoques.
Colonies jaunes + H2O2 Effervescence (Catalase +)
H2O2 CATALASE H2O + 1/2 O2
L'effervescence se traduit par un dégagement gazeux, ce
qui signifie que cette souche est à catalase +.
Le deuxième test qui confirme la souche de S.
aureus fait appel au test coagulase libre. Test coagulase libre
(ou épreuve de la coagulase)
Parmi les cocci à Gram+ et catalase+, les souches de
S. aureus provoquent la coagulation du plasma oxalaté de lapin
en 24 h, les autres espèces et sous-espèces de staphylocoques
d'origine humaine ne possèdent pas la coagulase libre sauf S.
schleiferi subsp. coagulans (DELARRAS,
2007).
Mélanger dans un tube à hémolyse
stérile 0,1 mL de plasma de lapin et 0,3 mL de la culture en bouillon de
la souche. Incuber le mélange incliné à l'étuve 37
°C. Les lectures se font après 6 h, 8 h et 24 h d'incubation.
Il a été remarqué qu'après 6 h
d'incubation, le plasma a été entièrement coagulé
avec prise de masse. Selon les résultats obtenus (coloration de Gram,
tests de catalase et coagulase), la souche de Staphylococcus était bel
et bien S. aureus.
La confirmation du reste des souches bactériennes n'a pas
été effectuée car on ne dispose pas de réactifs
nécessaires pour réaliser la galerie biochimique.
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