Détermination "in vitro " du pouvoir antibactérien des huiles essentielles d'eucalyptus, myrte, clous de girofle et sarriette, et leur application à la conservation de la viande fraà®che type hachée.

REPUBLIQUE AL

GERIENNE DEMOCRATIQUE ET

POPULAIRE

UE

CHERCHE
fraîche

'ENSEIGN sécur it E

SCIENTIFIQ

MINISTERE DE L

MENT SU

é sanit aire

PERIEUR E

des T DE LA RE viandes

UNIVE

RSITE MOULOUD

Facult é

s Biologique s Biochimie e t

MAMMERI DE TIZI OUZOU (UMM TO)

et Agrono miques Microbiolo gie

de

n d'étu

Mémoire de fi

En

vue d'ob

Alimentaire au

robiologie

Promotion 2007-2008

Optio

tention du diplôme

Sciences Biol o

n : Cont rôle de Q u

d'Ingé nieur d'E t

giques

alité et Analyses

at en

D étermin ation "i n vitro " du pou v

ess entielles d'Eucalyptus, Myrte, C l

l eur application à la conservation

haché e

oir anti bactérie n

ous de girofle e t

de la viande fr

des h uiles

Sarrie tte, et

aîche type

Président: M^r DJERBAL

Promoteur: M^r D J

Examin ateur: M^r

Examin atrice: M^m

Invité e d'honneur

M.: Dr v é

Dr

âa

D., Maîtr e ., Maître a s

Z., Maître

ALKI O

Laborato

s

l'UM M
travaux pr a
rvice de Mi c
t

de Drâa

^e KOLL I

: Melle M

ENAN E

YESLI A

térinaire, Directeur

Ben Khedda, charg

de conférences à l'UMM

sistant, chargé de cour

assistant, chargée de Respon sable du se

ire Régional Vétérin a

iredu L

é de

UMMTO

TO

iques à l'

aborat oire Régional Vétérinaire de

Cours à l'UMM TO

TO

.

Ben Khedda

des Science

Département de

REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail, nous tenons à remercier tout particulièrement:

- Notre promoteur, Docteur DJENANE Djamel, Maître de Conférences à l'Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou de nous avoir permis de découvrir un domaine de recherche passionnant et de nous avoir guidé tout au long de notre trajet d'investigation scientifique; qu'il trouve ici le témoignage de notre haute considération et profond respect.

- Notre co-promoteur, Docteur AMROUCHE Tahar, Maître de Conférences à l'Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou pour son aide précieuse et ses conseils de rigueur et d'humilité qu'il nous a dispensés. Ce fut un grand plaisir de travailler avec vous !

Nos vifs remerciements vont aussi au Professeur PEDRO RONCALES de l'Université de Zaragoza (Espagne) ainsi que le Ministère Espagnol des Affaires Extérieures (Agencia Española de Cooperación Internacional) pour le financement de notre Travail.

Nous adressons également nos sincères remerciements à Mr. DJERBAL Mouloud, Docteur vétérinaire, Directeur du Laboratoire Régional Vétérinaire de Drâa Ben Khedda (Tizi-Ouzou) et chargé de cours à l'Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou, pour nous avoir accueillis dans son laboratoire et qui nous a fait l'honneur d'accepter de présider le jury de notre soutenance, qu'il trouve ici le témoignage de notre haute considération et profond respect.

Aussi, nos plus sincères reconnaissances à:

- Tout le Personnel du Laboratoire Vétérinaire Régionale de DBK en particulier Melle MALKI Ouiza; M^r BELHADJ Hcène, ^Melle DADI Nadia, M^r BALOUL Saïd et Mr ALLEM Rachid pour tout leur soutien logistique;

- Docteur HAOUALI Karim, Maître de Conférences à l'Université Mouloud Mammeri TIZI OUZOU) pour nous avoir procuré les souches bactériennes;

- M^me NASSER BEY, chef du Laboratoire Huiles essentielles de SAIDAL (Mohammadia, el Harrach, Alger) pour nous avoir accueillis dans son laboratoire pour l'extraction des huiles essentielles;

- M^r ASLA Tarik, Maître assistant chargé de cours (Département de Biologie et Physiologie Végétale et Animale, Faculté des sciences Biologiques et Agronomiques à l'UMMTO), d'avoir mis à notre disposition le matériel de son laboratoire pour les opérations d'extraction des huiles essentielles.

Mme KOLLI ZOHRA, Maître assistant chargée de TP (Département de Biochimie Microbiologie, Faculté des sciences Biologiques et Agronomiques à l'UMMTO) d'avoir accepté d'examiner notre travail.

Mr YESLI Abdennour, Maître assistant, chargé de cours (Département d'Agronomie, Faculté des sciences Biologiques et Agronomiques à l'UMMTO) qui nous a fait l'honneur d'accepter de faire partie du jury de notre travail.

DEDICACES

Je dédie ce modeste travail :

Au Bon Dieu qui nous a donné foi, santé et le courage de mener ce travail;

À mes parents que je remercierai éternellement pour leur amour et leur appui inconditionnel durant toutes ces années;

À mes frères Mohammed, Boubekeur, Kouceîla et ma soeur Amina; À Moumouh, un grand merci pour ton soutien moral;

À tous mes amis(es) notamment Siham, Thiziri, Nora, Lynda, Zahra et Safia pour leur intarissable soutien, en souvenir de toutes ces années passées ensemble;

À ma grande famille;

À l'âme de ma tante Dehbia;

À mon binôme Nafaa et sa famille, sans oublier la promotion 5^ème A CQA (2007-2008).

SOUHILA

Je dédie ce modeste travail:

Au Bon Dieu, le père tout puissant pour m'avoir donné la santé et la force de mener ce travail;

À mes parents pour leurs dévouements, leurs amours, leurs sacrifices et leurs encouragements. Que ce travail soit, pour eux, un faible témoignage de ma profonde affection et tendresse;

À mes frères : Madani, Omar et surtout Yanis pour sa grande contribution dans la réalisation de ce travail;

À mes soeurs, en particulier Nouara et Nabila pour leur soutien moral et financier;

À mes deux amis Larbi et Amar pour leur disponibilité et leur pardon ainsi que pour leurs familles;

À mes camarades de la promotion 5^ème A CQA (2007/ 2008); À mon binôme Souhila, ainsi qu'à sa famille.

SOMMAIRE

RESUME INTRODUCTION

Première partie : données bibliographiques

CHAPITRE I : Les huiles essentielles

1- Historique des huiles essentielles 03

2- Terminologie et définition des huiles essentielles 04

3- Répartition botanique et localisation des huiles essentielles dans la plante 04

3.1- Répartition botanique 04

3.2- Localisation 05

4- Les huiles essentielles dans la plante 06

5- Modes d'extraction des huiles essentielles 06

5.1- Entraînement à la vapeur d'eau 06

5.2- Extraction par expression 07

5.3- Extraction par solvant 07

5.4-Procédés utilisant les huiles et les graisses 07

5.5- Extraction par gaz supercritique 08

6- Propriétés physicochimiques des huiles essentielles 09

7- Qualité et caractérisation chimique des huiles essentielles 09

7.1- Méthodes d'analyses physiques et chimiques 10

7.2- Méthodes de détermination des constituants de l'huile 10

8- Composition chimique des huiles essentielles 10

8.1- Terpénoïdes 11

8.2- Composés aromatique 13

8.3- Composés d'origines diverses 13

9- Paramètres influençant la composition quantitative et qualitative

des plantes aromatiques 14

10- Stabilité des huiles essentielles 15

11- Autooxydation des huiles essentielles 15

12- Photooxydation des huiles essentielles 16

13- Chémotypes 16

14- Toxicité des huiles essentielles 17

15- Applications thérapeutiques 17

16- Description des plantes utilisées 17

16.1- Girofle 17

16.2- Eucalyptus 19

16.3- Myrte commun 20

16.4- Sarriette CHAPITRE II: Activités Biologiques des huiles essentielles 1- Activité antibactérienne 1.1- Bactéricide et bactériostase 1.2- Huiles essentielles et bactéries résistantes aux antibiotiques 1.3- Mécanismes d'action des huiles essentielles sur les bactéries 1.4- Résistance des bactéries Gram- à certaines huiles essentielles			21 ...23 24 24 24 26
2- Activité antifongique			27
2.1- Mode d'action des huiles essentielles sur les levures			28
2.2- Les principales huiles ayant un pouvoir antifongique			28
3- Activité antivirale			28
4- Activité antioxydante			29
5- Combinaison entre les huiles essentielles			29
6- Activité liée à la composition chimique			30
7- Les principales techniques de détermination	de	l'activité
antimicrobienne des huiles essentielles			32
6.1- Aromatogramme			32
6.2- Technique de microatmosphère			33
6.3- Technique par contact direct			34
6.4- Méthode de diffusion en puits ou en cylindre			35
6.5- Méthode de dilution			35

CHAPITRE III : Application des huiles essentielles dans le domaine

agroalimentaire

1- Systèmes de sécurité sanitaire des aliments en Algérie 37

2- Quelques évènements récents sur les intoxications alimentaires en

Algérie 39

3- Les applications alimentaires des huiles essentielles 39

4- Facteurs influencent les propriétés antimicrobiennes des huiles essentielles

dans les aliments 40

5- Bactéries responsables des toxi-infections alimentaires 41

5.1- Staphylococcus aureus 41

5.2- Bacillus cereus 42

5.3- Pseudomonas aeruginosa 42

5.4- Salmonella paratyphi A 43

5.5- Escherichia coli 44

5.6- Shigella flexneri 45

Deuxième partie : Etude expérimentale

Matériel et méthodes

1- Matériel 46

1.1- Matériel végétal 46

1.2- Milieux de culture 47

2- Extraction et conservation des huiles essentielles 47

2.1- Clous de girofle 47

2.2- Myrte et Eucalyptus 50

2.3- Calcul du rendement 51

2.4- Conservation des huiles essentielles 51

3- Tests d'activité antimicrobienne des huiles essentielles 51

3.1 - Critères de sélection des souches 51

3.2- Souches bactériennes 51

3.3- Confirmation des souches 52

3.4 - Préparation des précultures 54

3.5- Tests antimicrobiens "in vitro 54

3.5.1- Aromatogramme 55

3.5.2- Microatmosphère 55

3.5.3- Diffusion en puits 56

3.5.4- Nature de l'activité antibactérienne des huiles essentielle 56

3.5.5- Détermination des concentrations minimales inhibitrices 57

3.5.6- Combinaison entre les huiles essentielles 59

3.6- Activité antimicrobienne des huiles essentielles en présence des pathogènes

inoculées dans la viande hachée bovine 59

3.6.1- Préparation de la viande 59

3.6.2- Optimisation de la CMI appliquée à la viande par des tests Sensoriels 59

3.6.3- Préparation des échantillons 61

3.6.4- Analyses Microbiologiques 63

Résultats et discussion

1- Rendement en huiles essentielles 65

2- Tests de sensibilité microbienne envers les huiles essentielles 66

2.1- Essais aves les Clous de Girofle 67

2.2- Essais avec la Sarriette 70

2.3- Essais avec l'Eucayptus 73

2.4- Essais avec le Myrte 76

3- Interprétation de la nature de l'activité des huiles essentielles 79

4- Concentrations minimales inhibitrices (CMI) 80

3.1- Clous de Girofle 80

3.2- Sarriette 81

3.3- Eucalyptus 82

3.4- Myrte 83

5- Combinaison entre les huiles essentielles 84

6- Application des huiles essentielles dans la viande 85
6.1- Optimisation de la quantité d'huile appliquée dans la viande par des tests

préalables de dégustation 86

6.2- Effet des huiles essentielles appliquées dans la viande sur la flore pathogène 88

6.2.1- S. aureus 88

6.2.2- S. paratyphi A 90

6.2.3- E. coli 91

6.2.4- S. flexneri 93

Conclusion et perspectives 96

Références bibliographiques

Annexe

Liste des tableaux

· Tableau I : Avantages et inconvénients de l'extraction par CO2 supercritique.

· Tableau II : Bioactivité de quelques principaux terpènes rencontrés dans les H.E.

· Tableau III : Présentation des plantes employées pour l'extraction des H.E.

· Tableau IV : Coloration de Gram et morphologie des souches bactériennes utilisées.

· Tableau V : Répertoire des résultats obtenus par la méthode des aromatogrammes.

· Tableau VI : Valeurs des dilutions (ul d'H.E./mL d'eau).

· Tableau VII : Le rendement (%) en H.E. des différentes plantes utilisées.

· Tableau VIII : Halos d'inhibition (mm) provoqué par l'H.E. des Clous de girofle.

· Tableau IX: Halos d'inhibition (mm) provoqués par l'H.E. pure de la Sarriette.

· Tableau X : Diamètres (mm) des halos entourant les disques exprimant la sensibilité à l'H.E. d'Eucalyptus (état pur et dilué à 1/2) des bactéries pathogènes.

· Tableau XI : Halos d'd'inhibition (mm) en présence d'H.E. de Myrte.

· Tableau XII : Récapitulatif des aromatogrammes des H.E. avec six souches bactériennes pathogènes.

· Tableau XIII : Nature de l'activité antimicrobienne des différentes H.E. testées après repiquage sur BHIB puis sur gélose nutritive.

· Tableau XIV : Récapitulatif des valeurs de CMI des H.E. testées sur les 6 souches pathogènes (en ul/Ml d'eau).

· Tableau XV : Résultats des interactions entre les différentes H.E. testées par la méthode des aromatogrammes (zones d'inhibition en mm).

· Tableau XVI : Résultats du test de dégustation selon le critère du goût.

· Tableau XVII : Résultats du test de dégustation selon le critère d'odeur.

· Tableau XVIII : Résultats du dénombrement de S. aureus dans chaque échantillon (log10 ufc/g).

· Tableau IXX : Résultats du dénombrement de S. paratyphi A. dans chaque échantillon (Log/temps).

· Tableau XX : Résultats du dénombrement d' E. coli dans chaque échantillon (Log/temps).

· Tableau XXI : Résultats du dénombrement de S. flexneri dans chaque échantillon (Log/temps).

Liste des figures

· Fig. 1 : Etas du CO2 en fonction du T° et de la pression.

· Fig. 2 : Structure de quelques monoterpènes rencontrés dans les H.E.

· Fig. 3 : Structure de quelques sesquiterpènes rencontrés dans les H.E.

· Fig. 4 : Structures de quelques arènes dérivées du phénylpropane.

· Fig. 5 : Quelques composés d'origines diverses.

· Fig. 6 : Illustration simplifiée de CPG de 4 chémotypes différents de thym.

· Fig. 7 : Clous de Girofle.

· Fig. 8 : Feuilles d'Eucalyptus.

· Fig. 9 : Feuilles de Myrte commun.

· Fig. 10: Sarriette des jardins.

· Fig. 11 : Structure de la paroi bactérienne Gram+.

· Fig. 12 : Structure de la paroi bactérienne Gram-.

· Fig. 13 : Illustration de la méthode d'aromatogramme.

· Fig. 14 : Illustration de la méthode de microatmosphère.

· Fig. 15 : Schéma représentant la technique de contact direct.

· Fig. 16 : Montage de l'hydrodistillateur réalisé au département de Biologie et Physiologie Végétale à l'UMMTO.

· Fig. 17 : Distillat.

· Fig. 18 : Étapes de séparation des phases du distillat.

· Fig. 19 : Montage de l'hydrodistillateur semi-pilote du Groupe SAIDAL.

· Fig. 20 : Aspect des souches bactériennes repiquées sur milieux spécifiques.

· Fig. 21 : Préparation de l'inoculum.

· Fig. 22 : Détermination de la nature de l'activité antimicrobienne des H.E.

· Fig. 23 : Schéma du test de l'activité antibactérienne des H.E. sur une viande contaminée par les souches pathogènes.

· Fig. 24 : Test de l'effet des H.E. sur la conservation de la viande hachée.

· Fig. 25 : Rendement en H.E.obtenues par hydrodistillation.

· Fig. 26 : Photos montrant les témoins réalisés par la méthode d'aromatogramme.

· Fig. 27 : Photos montrant l'activité antimicrobienne de l'H.E. à l'état pur des Clous de Girofle par la méthode d'aromatogramme.

· Fig. 28 : Photos montrant l'activité antimicrobienne de l'H.E. des Clous de Girofle diluée à ¹/2 par la méthode de puits.

· Fig. 29 : Photos montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. de sarriette par la méthode d'aromatogramme.

· Fig. 30 : Photos montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. de Sarriette par la méthode de microatmosphère.

· Fig. 31 : Représentation graphique des deux tests antimicrobiens de l'H.E. de Sarriette.

· Fig. 32 : Photos montrant l'activité antimicrobienne de l'H.E. d'Eucalyptus par la méthode d'aromatogramme.

· Fig. 33 : Photos montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. d'Eucalyptus par la méthode de diffusion en puits.

· Fig. 34 : Photo montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. d'Eucalyptus par la méthode de microatmosphère.

· Fig. 35 : Photos montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. du Myrte par la méthode d'aromatogramme.

· Fig. 36 : Photo montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. du Myrte par la méthode de diffusion en puits.

· Fig. 37 : Représentation graphique des effets antimicrobiens des H.E. vis-à-vis de 6 souches bactériennes pathogènes par la méthode d'aromatogramme.

· Fig. 38 : Photos montrant les CMI de l'H.E. des Clous de Girofle vis-à-vis de certaines bactéries pathogènes.

· Fig. 39 : Photos montrant les CMI de l'H.E. de Sarriette vis-à-vis de certaines bactéries pathogènes.

· Fig. 40 : Photos montrant les CMI de l'H.E. d'Eucalyptus.

· Fig. 41 : Photos montrant les CMI de l'H.E. du Myrte.

· Fig. 42 : Représentation graphique des valeurs de CMI des quatre H.E. sur 4 souches bactériennes testées.

· Fig. 43 : Effets dans la viande des H.E. des Clous de girofle et d'Eucalyptus vis -à -vis de S. paratyphi.

· Fig. 44 : Évolution de la croissance de S. paratyphi A. en présence et en absence d'H.E.

· Fig. 45 : Effets dans la viande des H.E. des Clous de Girofle et de Sarriette vis-à-vis de E. coli.

· Fig. 46 : Effets dans la viande de l'H.E. de Sarriette vis-à-vis de S. flexneri.

· Fig. 47 : Exemple d'un effet antioxydant des H.E. appliquées dans la viande hachée.

Liste des abréviations

Les abréviations retenues sont:

- H.E. : Huile(s) Essentielle(s);

- CG : Clous de Girofle;

- CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse;

- SM : Spectroscopie de Masse;

- ° C : degré Celsius; - T °: température;

- h : heure;

- ISO : International Organisation for Standardisation;

- CMI : Concentration Minimale Inhibitrice;

- CMB : Concentration Minimale Bactéricide;

- PM : poids moléculaire;

- mn : minute;

- cm : centimètre; - um : micromètre; - nm : nanomètre; - BHIB : Brain Heart Infusion;

- RLO : radicaux libres oxygénés;

- ? : diamètre ;

- AFNOR : Association Française de Normalisation ;

Résumé

Les huiles essentielles et leurs constituants ont une longue histoire comme agents antimicrobiens, cependant leur utilisation comme additifs antimicrobiens dans le domaine agroalimentaire a été rarement rapportée. Ce travail a pour but d'apporter une contribution à la mise en évidence de l'activité antimicrobienne des huiles essentielles. Dans un premier temps, cette étude est axée à l'extraction de ces métabolites à partir de plantes autochtones de Kabylie à savoir l'Eucalyptus et le Myrte commun, et d'une épice importée « Clous de Girofle » par le procédé d'hydrodistillation à deux échelles (hydrodistillateur type Clavenger, et semi-industriel). La quatrième huile testée est celle de Sarriette des jardins certifiée extraite en France.

Dans un second temps, le travail est orienté vers la mise en évidence de l'activité antibactérienne de ces huiles sur les souches bactériennes pathogènes, les plus incriminées dans les empoisonnements alimentaires (S. aureus, B. cereus, S. paratyphi A., S. flexneri, P. aeruginosa et E. coli) en employant trois méthodes : méthode d'aromatogramme, de microatmosphère et celle de diffusion en puits. Les huiles faisant l'objet de l'étude ont montré une forte activité antibactérienne sur l'ensemble des souches testées, parmi lesquelles S. aureus s'est révélée être la plus sensible tandis que P. aeruginosa est la plus résistante. Les concentrations minimales inhibitrices sont déterminées par la méthode de dilutions en milieu solide. La plus faible CMI étant exercée par l'huile essentielle de Sarriette avec 10,1 ul / mL sur la totalité des souches testées. Tandis que celle de Myrte exerce un effet antibactérien non significatif.

Ces résultats, laissent entrevoir une issue favorable dans le domaine de la sécurité sanitaire du consommateur. On évoquera l'application de ces propriétés dans le maintien de la salubrité d'une viande hachée conservée à une température de réfrigération.

Mots-clés : huiles essentielles, activité antibactérienne, hydrodistillation, pathogène, CMI, viande.

INTRODUCTION

INTRODUCTION

La viande peut être le siège d'une contamination et d'une prolifération microbienne, car elle constitue un excellent milieu de croissance pour un grand nombre d'espèces bactériennes (LABIE, 1993). La qualité hygiénique des viandes dépend, d'une part de la contamination pendant les opérations d'abattage et de la découpe, et d'autre part du développement et de la croissance des flores de contamination pendant le refroidissement, le stockage, distribution et préparation des viandes et produits carnés (ZWEIFEL et al., 2005). En effet, l'abattoir constitue l'un des points critiques majeurs de l'hygiène des viandes. Il est considéré comme l'étape où les plus grandes opportunités de contamination (80 à 90%) de la microflore des viandes parvenant aux consommateurs (JOUVE, 1990).

Parmi les micro-organismes rencontrés dans la viande, on peut citer les bactéries qui peuvent toucher la santé du consommateur en lui causant des toxi-infections alimentaires et celles qui peuvent altérer les caractères organoleptiques de la viande (KOOHMARAIE, 2005).

En Algérie, les maladies d'origine alimentaire qui résultent des viandes contaminées avec des bactéries pathogènes constituent une grande préoccupation pour les pouvoirs publics. Généralement, ce genre de problème touche des populations massives. Près de 6000 cas ont été enregistrés par exemple en 2008 à l'échelle nationale. Les intoxications alimentaires collectives surviennent notamment des restaurations collectives en raison du non-respect des conditions d'hygiène lors de la préparation des produits. Un chiffre qui pourrait être multiplié par 4 ou 5 du fait qu'il n'y a que les cas d'hospitalisation et de consultations médicales qui sont déclarés et notifiés par les services concernés. Il est utile de signaler que près de 40 % des cas d'intoxication sont dus à l'ingestion de viandes et dérivés impropres à la consommation. Selon une étude de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), on compterait quelque 500 décès par an en Algérie dus à des intoxications alimentaires, 3600 hospitalisations et 4000 intoxications par défaut d'étiquetage. En outre, "chaque cas d'hospitalisation coûtera entre 3000 et 4000 dinars algériens".

Aujourd'hui, différentes stratégies sont appliquées dans le but de contrôler les pathogènes dans la viande. Un intérêt particulier a été manifesté ces dernières années pour les huiles essentielles (DEMIRCI et al., 2008), considérées comme des produits naturels et sains et, qui constituent une alternative effective pour les produits de conservation chimique. Pour mieux appuyer cette hypothèse, voici une vive déclaration d'un citoyen algérien victime d'une intoxication alimentaire : "C'est après avoir consommé des pâtisseries que je fus pris de malaises suivis de vomissements accompagnés de dysenterie; ce qui a forcé mon transfert aux Urgences où je fus traité au Spasfon. C'était tout dire le soulagement ressenti sur le coup. Malheureusement, il n'en fut rien. La seule issue était de me retourner vers les plantes médicinales qui, dès leur absorption, m'ont soulagé".

L'évolution des esprits et le refus du "tout chimique" qui se manifeste de plus en plus, ouvrent un peu plus la porte au "retour au naturel". La gravité des toxi-infections alimentaires collectives, couplée à la tendance des bactéries à résister aux agents antimicrobiens nous a

conduit à nous intéresser à l'inépuisable source de produits naturels à vertu antimicrobien: les plantes médicinales.

Les huiles essentielles (H.E.) sont des substances qui occupent une place particulière dans leur utilisation en médecine, en aromathérapie et en agroalimentaire (ROTA et al., 2008). Nos ancêtres utilisaient des huiles essentielles de certaines plantes comme le lentisque pistachier (Pistacia lentiscus), pour la désinfection des carcasses de certains animaux de chasse. Très peu d'études ont été réalisées jusqu'à présent sur les propriétés antibactériennes des plantes et herbes aromatiques d'Algérie.

L'objectif de notre travail est basé sur l'évaluation "in vitro" de l'activité antimicrobienne de quelques huiles essentielles extraites par hydrodistillation à partir des espèces végétales de la région Kabyle et d'autres régions du monde. La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été déterminée pour chaque huile essentielle vis-à-vis de certaines bactéries pathogènes entre autres: Staphylococcus aureus (S. aureus), Salmonella paratyphi A. (S. paratyphie A.), Bacillus cereus (B. cerues), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa); Escherichia coli (E. coli) et Shigella flexneri (S. flexneri). Les huiles qui s'avèrent avoir une significative activité antimicrobienne "in vitro", seront appliquées directement dans la viande fraîche bovine conservée à 2 #177; 1°C. L'optimisation des doses appliquées à la viande est estimée par des analyses sensorielles.

DONNEES

BIBLIOGRAPHIQUES

effe dernirevtiliation rév ré

Les huiles essentielles HE

HAPITRE I: Les huiles essentielles (H.E.)

Il 1 Historique ^de des huiles ^standard essentielles

Dprèspeut varier BOUZOUITA et l^de (006 vue _l'histoe se des plante ^desaromatiques personnes et ^deméicinales est associée à l'évoltion aussi des civilisations humaine des botanistes, des physico-chimistes, des L'homme des préhistorique quiou des avait très peu de mo

Les ueilltte et ^onte la étéhase initialement En assimint la flor végéta"^esp^rit" localp^uis il a décovert Durant les ^unlanes utiles international et indispensables avait pour survivre en 1983 Ce^au régime essentiellement une végétarien ^deétait le berceau d'utilsation denomination des produits naturls a été À cette époue au bien que^{de celle}les hus d' "huile essntielles ne soient seul pas en signalées nommémen

Déj mo 40 000 an avant rai _JsusChrist du (av soit J-C les aborigènes a _laautralien vapeur _utilisaient ou san le

presence plantes aromatiques soit p^arpour traiter les infections des par fumigation de fruits ou cataplasme citrals et dans lesque l'eu l'argile des et les pantes les _montraient aux huiles leur efficacité table _synergique Les Mais c'est autour du ^debasi^ce huiles rendent leur extraction a la méditerranéen que la science médicale va vraiment s'établir avc On _les les _grandes appelle civilisation Egyptienne comme _{Babyloniennel'essence} elles puis Grecque ^Onet ^lesRomaine Ce d'ailleurs sont cependant parfois essences.les texte

Les ui apportent les descriptions les plus avec _détaillées d'autres _Les procédés plantes étaient ceux utilisée^cites dans tousne so le
domaines de l ^lavie pour abrique^d'^huile les parfums donnée de coméiques maide l'Associatio:aussi pou

l'embaumement de des défunts Cette dernièr Ceux-ci _utilisation alors _révèle les nomsla parfate maîtrise par le
Égyptiens des vertus absolue antibactérienne et antiputrides de certaines 2000; huiles essentie 2007).

pres TURGEON (2001), on distingue trois v JC les Perse semble avoir inventé la ditillation mai il faudra les attendr^huiles 2000 que ce les _procédé rectifiéessoit _sensblement les huiles _{perfectionné} fractionnées. C'

Les huiles brutes ou naturelles sont obtenues par distillation une man (9801037) qui produit la première HE de roses Pour cela il met ^auquan _point 1 e matieres c Il écrit de nombeux végétales ouvrages médicaux dans aiguilles, lesquels il fait une large pace Elles a sont ssentielles (FREE

ae is 918 RenéMaurice Gattefossé chimiste i entramement et parfumeu a is frança

Enfin, explosion dans son^de laboratoire Par éflexe i huiles plongeait sa main dansOn les _un obtient _récipient en d'HE d ^leslavande (Lavndula hybrda) en diverses Le soulagement fractions, selon était ^leursimmédiat la guérison de e et sa cica

Pour rprenant l'ncitait certaines _à mauvaisesse consacer à l'étud lesdes es propriétés antibactérienns des on _huiles pent :traire directement sentielles Il crée en 1928 la sontnotion les «aromathérapie» et publie en 1931 un ouvrage mandarins du même om ^Cettedans ^extractionequel il décrit s'effectue la relaion entre^exp^ression la strucure a froid _bochimique zestes frais.de _l'huile On _essentielle dans ^ceet son^cas essence tivité biologique (FREEMAN de et CAREL 2006) Pour les autres plantes aromatiques, 1'extraction

o D' è CAILLET

f dun remède naturel Il existe aujourd'hui approximativement 3000 HE d sont réellement commercialisées

rfums.

2- Terminologie et défnition des huiles essentielle

Il n'existe pas de définition standard pour l'huile essentielle «la notion d'huile essentielle peut a varier avec

rofessionnelles aussi dissemblablement

· usels des parfumeurs ou des pharmacologues» Thyms (Thymus vulgaris) ; Romarins HE ont été initialement appelées "esprit" pui

ü ional qui avai lieu en 1983 au Singapour et pour une considération de n e lesnomination essences a été aandonnée au profit de clle d' hue essenelle» seul n usage actuel

· les Lauracees

· el TREINER (999) « l' H.E représente l'ensemble des sub

d moléculaire extaites du végétal soit par ntraînement la vapeur (avec ou sans e d'eau)

es rendent leur extra

ue, comme l'essence elles s'enflamment. On les appelle d'ailleurs p

e roduits obtenus par extraction avec d'autres procédés que ceux cit

· pris dans la défnition d'huile essentie

n se de Normaisation (AFNOR). Ce

a résinoïde, absolue (BRUNETON, 1993; AF

· baies (genevrier : Juniperus communis);

· ès TURGEON (2001), on distingue trois catégories d'H urles, les huiles rectifiées et les huiles fr

- Les huiles brutes ou naturelles

sont pas raffinées parties dune plante contiennent ces huiles, mais elles sont souvent

- Les huiles rectifiées sont des huiles brutes purifiées, c'es-à-dire que cetains résidus de la distilltion ont éliminés par 'entraînement à la vapeur.

- Enfin, es H.E. de qualité supérieure sont des huiles fractionnées. On les obtient en sépaant les composés volatils en dive

ou éviter certaines mauvaises définitions, es seules planes aromatiques dont on peut directem

. tte extraction seffectue par expresson à froid des zestes frais On parle d

· ssce dorange, dessence de citron, et. Pour les

«huiles essentielles».

3- Répartition botanique et localisation des HE da

armi les 800.000 espèces végétals environ,

ynthtiser une HE. sont peu nombreuses(VERRECK, 2007). Seuls 10 % du _règneal., végéta en a la possibilité

Qu

attractif, vis-à-vis Les Lamiacees: Lavandes (Lavandula favoriser h_ybrida₎, Th_yms ₍Th_ym

de barriere contre 1"

^(Roarprotecteur par ^ffina), action antiseptiqueà en g

p p )

l Mt Elt ⁽El lbl⁾ l d

pig

i

l Abi Pi ⁽Pi it)
·
· comme _Si aes ^sources(Abi ibiic^ae

Pde controler ou Cit reguler sont l environnementCb (role ii) ecologiq Pl . r r

. .

a H.E. possed

HE pe entre ^êles plantes^xa pour ^fsla germination ^parti et^d la^l pⁿcroissance) ores ides et peuvent servir de 1 t bioactifs des ur (pé r om jmn Jminm gfrm)_I

' (ROBERT et al..199

?orces

^{de frt}

^(tron

o es

ex rac

ion aes nuiies essentielles

urs baies (genévrier : Juniperus communs);

boutons floraux : (clous de girofle : Syzygium aromaticume^xt^raⁱts n fruits (persil a _Petroselinum Chaque sativum);

En principe toutes les parties d'une plante contiennent ces huiles mais eles sont asouvent majoritairement dans l'une d'elles La synthèse et l'accumulaion des HE dans les végétaux sont généralement lies à l'existece de structres histolgiques spéciaisées localisées en certains points des

TREINER 1999)a Ce structures peuvent être:

internes;

des poils sécréteurs internes (labiées, géraniacées) ou externes (eucalyptus); i des canaux sécréteurs (ombelifère conifères)

ebullition. Les vapeurs heterogenes sont condens

elon TRENER (1999) la teneur des plantes en HE est généralement considérée faible e est de l'ordre de 1 à 3 % à l'exception du clou de girofle (14 à 19 %) du macis (10 à 13 de la noix de muscade (8 à 9 %) et de la cdamon (4 à 10 %)

4- Les huiles essentielle dan la plante

es rôles biologiques des HE son souvent ma connus (SLUSARENKO t al 1993)

rtains des auteurs PARIS (1981) et MAINEBLAU (1994) ont suggéré qu'elles auraie _

cteur attracif visàvis despa^r uⁿnsectes afin dede favoriser la pollinsation;

de bè solubles t l'ét; idissement de c

s spécialistes considèrent le

L plante de contrôler ou réguler sont deenvironnement (rôle écologique): attraction desa insectes a _{pollinisateurs} la action répulsive sur le prédateurs le bas. inhibition de la des germination des graines est voire communication entre les végétaux de(mision e sinaux chimiques sgnalnt par a présence d'animaux herbivores par exemple) (HURTEL 2006) et un certain Hombre de produits plus

Les HE possèdent des popriétés anifongiquesles anibacériennes ce _{alllopathiques} ne

(compétition entre a les plantes pour la un germination et la croissance) chez les plantes des

région

égétau (ROBERT e al 1993) (2002), cette technique comporte toutefois certains

Entînt~mpie sans ie cas à _la expression apu d'

s aromatiques s'effectuera simple

d d

ssence, lors de l'expression a froid. On obtientainsi

une_g leme bteue p imp pn à fr

méthd ti ps enn e l pu e s prochedunaturel(le

codificationparvoieenzymatiquelieeal'oxydationparfairtaemnt illt

9 oj dtu, ._1!ernisé, le prmet dextrire le

é t ft itnip

mp

i

.

, on obtient une mass

.

y

h d _di

l

et ,,

- ,, pour les gommes, les grains, les baumes et les resins. Cette ma;

_cires

(ether de pet ,, _{y p g g}

eent oy) dns n bic₉ rmp ,, du _{quifiltration} st ue _dissolute prée
^'ethanol ex. mimosa: Acacia sp.).

ulit L p ^égès

di C

les graisses

_p

'll d fi d d "builli" à l'H

es plantes Elle pe

ette isomérisation etc)est le mileu la pouvant avoir un pH a relativement acide (BRUNETTON

¹⁹⁹⁹⁾

grans p

il

^till

Pendant l'hydrodistillation, l'eau, l'acidité et la température peuvent provoquer la formation de produits indésirable vore même la destruction des produis labiles sans oublier des réarrangements que peuvent subir ces produits (NÉPOMUSCÈNE 1995).

- Le matériel végétal est séparé de l'eau: la plante est placée sur la grille perforée dun extracteur et traverée par un courant de vapeur deau. Les H.E. entraînées par la vapeur d'eau, peu solubles dans l'eau, sont alors séparées du distillat par décantation, après refroidissement de ce dernier. Cette méthode est industrielement la plus

52 Hydrodiffusion

essence L'hydrodiffusion consisteest alors à pulser d la vapeur d'au à trè ^desfaible presson grasses (002 à 015^a bar) travers la masse ^cettevégétale du haut^est trésvers delicate, le bas La compostion et des produits obtenus est^au ant alitativement sensibleme 2004).

urds non volatils tels que les flavonoï

Il orrespond plus à une H.E Le procédé permet un gain de temps et d'énergie (BRUNETTON 1999)

Selon LIQUET et WEYNANS (2002) cette echnique comporte toutfois certains inconvénients majeurs: a haute température de fonctionnement le (100-120a °C) entraîne la destruction aou la etmodification d'un it grand nombre de produits thermolabies et la etgenèse d'artefacts.

⁵² Extraton ^presente pr ^isxpresip^arncu

ivants lsans _d risquer _l de laisser d' d P

i

_-

auparavant de l'huile végéale ou un mélange de graisse de porc et de graisse de boeuf, épuré et stabilisé avec d

soit saturé	vée à lalcool é
drnir condui à une pommade appelée "abo	lue (ex. jasmin: Jasminum;
Lenfeurage à chaud st dentique, mais ave	de la graisse chauffée au bain-marie et après
filtration et évaporation de léthanol, on o	une crème parfumée (H
- le CO2 est bon marché, abondant, fmam2mable etch inerte ;
- Dans ce procédé, les végétaux sont imm
Lessence absolue ;
Malheureusement, cette méthode est t solvant (BOUSBIA, 20
-absence de reaction avec les autres solvants.

sagit dun nouveau procédé d'extraction des matières premières

es extraits « coeur de la nature » souvent proches de lodeur de la matère premère traitée et exemts e solvant organiques (BOUSBIA, 204). Elle utilise une propriété sngulière du gaz carbonique_en orsqu'il ateint un état supercritique (lorsque le CO2 est une tmpérature supérieue à 31C et sous-pressio, il présente u éta intermédiaire entre gazeux e le liquide figur 1).

liposolubles (solubles daps les corps gras): quand on conserve des plantes aromatiques (ou un
Danflacon cet éat, i présente la partcularité de pouvoir comme _undssoudre de nomreux composés_ou de

tissus vvants sns risquer e laisser de aces de prouits indsirables come les solvnts.

bleau I: Avantages et inconvénients de l'extraction par

ENNAR, 2002).

Avantages Inconvénients

- La capacité d

rieure à celle des solvants habituels _saux extraits classiques1'

et cm_quemnt ne

'e sd' hi nt

tion avec les autres ae solvantsmasse

eiie 6 Prpiétés ie aomame _{aappphysicochimiques} ion est _dse p hules e en essentielles u. i in ertet,

iformations concernant la composition élémentaire d'un éch , la structw

Lolécules ^jité inorganiques, d HE organiquest d liuid et biologiques; tè lé la composition l HE qualitative ^loé et quanti g

e HE d Cnell Cinmu licum) e bl (HE de Mtii Mi

hill⁾ vt ⁽HE d

tmpérature ambiante ell

énéal plus légères que l'eau dans laquelle elles ne se mélangent pas car elles ont liposolubles (solubles dans es corps gras): uand on cnserve de plntes aromatiques (u un flacon d'HE ma bouché) dans un endroit fermé comme un réfrigérateur les fromages ou le beurre voisin prendront rapidement l'odeur de lhuile essentielle (HURTEL 2006)

La grande majorité des HE sont généralement deinsolubles dans l'eau mais soubles dans
les liquies orgniques comme l'alcol l'éther e le huiles végétaes (JOCTEUR 2006) la

Ce sont des molécules légères qui sont entraînées par la vapeur d'eaula lors de la distillation; l'huile se sépare de leau du distillat ma

illée aromatisée) à laquelle on aoute parfois de l'alcool, de

onservateurs (HURTEL, 2006)

riferant et non pour indiquer leur structure chimique, c

7- Qualité

ifférnts essai, cmme le tst de miscibilité à l'thanol e certaines meures phsiques comme la détermination de l'indice de rfraction du pouvoi roatoire et de la densité elative La couleur et 'odeur sont aussi considérées comme des paramètres mportants (PIBIRI 2006)

71- Méthodes d'analyses physiques et chimiques

Ces méthodes permettent d'obtenir le caractéristiques physiques et chimiques propres à chaque hulele ssentiee On peut citer: la densité indic de réfraction le etpouvoir rotatoire le point de congélation les indices dacide d'ester et de carbonyle la solubilité dans l'éthanol (AFNOR 1989 produits sont les monoterpenes qui repondent a la formule brute de C10

72 Méthodes de détermination des ^C nstituants ^it de l'huil

hi

epoxyaes

aues. g (C

·
·

·
·

⁹dan

dans Spectroscopie de masse _une (SM)

el CHIHOUNE (2005), l SM es sans dout, parm toutes es techniues analytiques, ont le domaine dapplication est le plus

rations concernant la composition élémentaire dun échantillon; la structure de les inorganiques, organiques et biolo

8.1- - Coupla

développement impo

nstituants des HE. es rendu possible grâce au couplage du CPG directement à la spectrmétrie de masse (GARNERO, 1978). Lors du coupge, la chromaographie (CPG) permet dans un premier niveau de séparer et d'isoler chacun des contituants du mélange qui est injecté séparément dans la chambre d'io

veau). Grâce à cette innovation importante, la spectroscopie de masse est devenue la technique la plus sensible pour obtenir des données importantes sur la structure de composés organiques nconnus (PEYRON et alC, 1992) r

eprésent

Dans ompoés présents des en tace possèdent un rôle lesimportant du fait qu'ls augmentent le pouvoir ceux antimicobien de l'huile grâce à leurs activités mono synergiques avec les compsés De majeurs ⁽MAHMOUD ²⁰⁰⁴

Les H.E.= non seulement sont des mélanges complexes de constituants hétérogènes, elles appartiennent de façon exclusive à deux groupes caractér

ditinctes, le goupe des terpnoïdes d'une part et le groupe aromtique et aliphatique (alcanes, alcènes, alcénols phénols, etc.) d'aure part

umt, ngde quelques d _j, i d

3: les hi

es cqs (UEL, sont6).

8.1- Terpénoïdes est represents

8.1.1 Généralités en espagnol) et qui sont importants en pharmacognosie en raison de

Ves le milieu du XIXe siècle, les ravaux sur lesnce de térébnthine sont à lrigine du terme terpènes donné aux hydrocarbures de formule brute _C10H16. On les trouve fréquemment dans les huiles vlatles des plante, nommées H.E., cr elles renfermnt la

Quinta essentia, la fragrance de la plante

Dans e cas des H.E., seuls seront rencontrés es terpènes les plus volatils, c'est-à-dire ceu

8.2- Composés aromatiques

Les composés aromatiques sont moins fréquents, mais néanmoins très importants: eugénol, anéthole, etc.

Fig. 4: Structures de quelques arènes dérivées du phénylpropane (HURTEL, 2006).

Ces composés aromatiques constituent un ensemble important, car ils sont généralement responsables des caractères olfactifs et organoleptiques des H.E.: par exemple, l'eugénol est responsable de l'odeur du clou de girofle (Syzygium aromaticum) (HURTEL, 2006).

8.3- Composés d'origines diverses

Il s'agit là de produits résultants de la transformation de molécules non volatiles. Ces composés contribuent aux aromes de fruits. Compte tenu de leur mode de préparation, les concrètes⁽¹⁾ et les absolues⁽²⁾ peuvent en renfermer. Il en est de même pour les H.E. lorsqu'ils sont entraînables par la vapeur d'eau (BRUNETON, 1999).

Fig. 5: Quelques composés d'origines diverses (OCHOA, 2005).

(1) Concrète: produit solide ou semi-solide obtenu après l'extraction au solvant (éther de pétrole) des principes odorants de certaines matières premières végétales (jasmin, rose, mousse de chêne, etc.,) (PIBIRI, 2006).

(2) Absolue: les absolues sont des essences obtenues à partir de concrètes ou de résinoïdes par lavage de concrète à l'alcool éthylique. Après glaçage et filtrations pour éliminer les cires, elles sont concentrées par distillation sous pression réduite afin d'éliminer l'alcool (PIBIRI, 2006).

Il est important de signaler que parmi les H.E., on peut rencontrer des huiles que l'on pourrait qualifier de simples (riches en un composé prépondérant), de complexes (ne possédant aucun composé prépondérant) et tous les intermédiaires sont possibles.

L'un des exemples typiques d'une huile simple est celui de l'huile de girofle qui contient au moins 80 % d'eugénol et de petites quantités d'autres produits. Le cas extrême de complexité peut être illustré par l'huile de vétiver (Vetiveria zizanoides) qui contient une centaine de composants (JOUHANNEAU, 2000).

9- Paramètres influençant la composition quantitative et qualitative des

plantes aromatiques

Selon VERRECK (2007), la composition d'une H.E. peut varier fortement en fonction de: - L'origine de la plante;

- l'ensoleillement;

- la nature du sol;

- la source botanique;

- période de récolte;

- la technique d'extraction des H.E.

Le premier paramètre influençant la composition chimique est sa biosynthèse et donc son profil génétique. C'est la raison pour laquelle, une même espèce peut présenter plusieurs chémotypes⁽¹⁾ de profils chimiques différents (BENINI, 2007).

Les H.E. contiennent un nombre considérable de familles biochimiques, dont on vérifiera la présence, par le biais d'un Chromatogramme qui nous donnera la composition chimique exacte d'une H.E. (JOCTEUR, 2006). Si tous les organes d'une même espèce peuvent renfermer une H.E., la composition de cette dernière peut varier selon sa localisation (NÉPOMUSCÈNE, 1995).

Selon COLETTE (2004), la plante change d'aspect et voit sa composition chimique se modifier. Ceci se traduit par un changement d'odeur et de couleur. C'est le cas, par exemple, pour les racines de valériane (Valeriana officinalis) inodores à l'état frais et qui deviennent nauséabondes en séchant par dégagement d'acide valérianique.

La composition varie aussi suivant les organes de la plante concernée. Les biosynthèses y sont différentes. Par exemple, l'H.E. d'écorce de cannelle (Cinnamomum zeylanicum) sera riche en cinnamaldéhyde, alors que l'H.E. de feuille le sera en eugénol (BENINI, 2007).

(1): La composition chimique de l'H.E. de certaines plantes peut varier à l'intérieur d'une même espèce; ces variétés chimiques sont communément appelées chémotypes.

Le chémotype, également appelé chimiotype, permet de définir la ou les molécules biologiquement actives majoritairement présentes dans l'H.E. Associé à la dénomination latine, la précision du chémotype permet la compréhension précise du mode d'action des H.E.

Les conditions environnementales influencent aussi la composition. La température, la quantité de lumière, la pluviométrie, les conditions édaphiques représentent autant de causes potentielles de variations de la composition chimique d'une plante aromatique donnée (CURADO et al., 2006).

Les conditions culturales telles que la date de semis, date de récolte, les traitements phytosanitaires, l'emploi d'engrais, ainsi que les techniques de récolte... influencent aussi la composition (ANTON et al., 2005). Peut-être faut-il, à ce stade, s'attarder sur la notion de chémotype qui sera utilisée à de nombreuses reprises dans cette étude. Un chémotype est une race chimique. En fait, une même espèce végétale peut fournir des H.E. de compositions chimiques différentes. Ces différences sont dues à la période de récolte des plantes, au mode d'extraction utilisé, aux facteurs environnementaux (altitude, ensoleillement, nature du sol, ...). Prenons l'exemple du basilic (Ocimum basilicum) (DE MASI et al., 2005). On dira qu'il s'agit d'un Ocimum basilicum à méthyl chavicol, sous-entendu de chémotype méthyl chavicol.

On utilise également la notion de chémotype pour établir une classification des H.E. et les caractériser (MOCKUTE et al., 2006).

Le nombre des molécules chimiquement différentes qui constituent une H.E. est variable (jusqu'à 500 molécules différentes dans l' H.E. de Rose) (PIBIRI, 2006).

10- Stabilité des huiles essentielles

Les H.E. sont volatiles et généralement très sensibles aux phénomènes d'oxydation. Elles sont souvent associées à d'autres substances, telles que les gommes et les résines et tendent même à se résinifier par exposition à l'air. Ces phénomènes d'altération modifient fortement la composition chimique des H.E. Les procédés qui conduisent à l'altération naturelle sont en général les activités causées par la chaleur et l'oxygène (O2) de l'air et sont catalysées par la lumière et la présence de certains métaux (CHIRON, 1996).

- Conservation des huiles essentielles

Les H.E. sont fragiles et volatiles (ANTON et LOBSTEIN, 2005). Elles doivent êtres conservées dans des flacons colorés, hermétiquement fermés, à l'abri de l'air, lumière et variations de température.

Si les conditions citées ci-dessus sont respectées, les H.E. peuvent être conservées jusqu'à 2 à 5 ans en maintenant les flacons en position verticale.

11- Autooxydation des huiles essentielles

L'autooxydation des H.E. est spontanée dont font l'objet certains solides ou liquides par l'oxygène moléculaire dans son état fondamental triplet (³O2), à la température ambiante ou à son voisinage et à la pression atmosphérique (760 mm Hg) (ANONYME, 2005).

12- Photooxydation des huiles essentielles

La photooxydation est une action conjuguée de l'oxygène et de la lumière en présence de sensibilisateurs efficaces (bleu de méthylène, chlorophylle, rose de Bengale, dicyanoanthracène, oxyde de titane....). Le rôle du sensibilisateur est d'exciter l'oxygène afin de le faire passer de son état fondamental triplet à son état excité singulet (¹O2)dans le cas de la sensibilisation par les colorants et de son état fondamental triplet à son état de superoxyde dans le cas de la sensibilisation par les composés pauvres en électrons (e^-). Ces deux états excités sont moins stables, mais plus réactifs (ANONYME, 2005).

13- Chémotypes

Dans ce contexte, la science moderne nous fournit un outil fondamental et incontournable, le "chémotype" (ou race biochimique de l'H.E.). Il permet de définir avec précision les composants biochimiques présents dans une H.E., et donc d'en déduire ses propriétés thérapeutiques. Biochimiquement différents, deux chémotypes issus d'une même plante présenteront non seulement des activités thérapeutiques différentes, mais aussi des toxicités variables. Les techniques utilisées pour la détermination du chémotype permettent également de contrôler la qualité d'une H.E. dans la mesure où elles permettent de mettre en évidence les traces de dénaturation par ajout de molécules de synthèse ou d'autres H.E. ou la présence de résidus d'engrais ou de pesticides (CHASSAING, 2006).

Le chémotype indique le ou les composants qui confèrent à l' H.E. une action thérapeutique particulière sans que ceux-ci soient nécessairement majoritaires (JOCTEUR, 2006).

Fig. 6: Illustration simplifiée de CPG de 4 chémotypes différents de thym (PIBIRI,
2006).

14- Toxicité des huiles essentielles

Alors que de nombreux ouvrages font référence à la toxicité de nombreux produits sur le marché, la toxicité des H.E. est moins investiguée. Les interactions de ces produits avec les médicaments ne sont pas bien connues (PIBIRI, 2006).

Les H.E. restent toujours notoires grâce à leurs diverses propriétés médicinales en l'occurrence les propriétés anti-inflammatoires, antiseptiques, antivirales, stimulantes, toniques, calmantes, etc. (KABERA et al., 2002).

D'autres parts, elles peuvent être toxiques. Cette toxicité est liée à la présence de certains sites oxygénés (VIAUD, 1993). Parmi les propriétés indésirables, on peut souligner entre autres : les propriétés vésicantes, nécrosantes, allergiques, hépatotoxiques, neurotoxiques, etc. (KABERA et al., 2002).

15- Applications thérapeutiques

Selon la plante dont elles proviennent, les H.E. sont recommandées en usages antibiotiques, antiviraux, antiseptiques, fongicides, cicatrisants, digestifs, anti-inflammatoires, sédatifs... on les utilise par voie orale, à la manière d'un médicament, usage en inhalation, en diffusion dans l'atmosphère avec un diffuseur d'essence, en massage (mélangée à une huile de base) (ODOUL, 2003).

16- Description des pantes utilisées

La flore méditerranéenne occupe une vaste aire de répartition. Elle s'étend autour de la Méditerranée, de l'Espagne à la Turquie en passant par les côtes d'Afrique du Nord et plus particulièrement l'Algérie. Ce qui caractérise ces plantes, c'est l'adaptation à leur environnement et au climat méditerranéen caractérisé par un été chaud et sec et hiver doux et humide (MACAIRE, 2004).

- Classification des plantes utilisées Embranchement: Spermatophytes;

Sous-embranchement: Angiospermes; Classe: Magnoliopsides (Dicotylédones).

Les trois plantes suivantes (le girofle, l'eucalyptus et le myrte) appartiennent à la famille des Myrtaceae.

16.1- Girofle

Espèce: Syzygium aromaticum.

Synonymes: Caryophyllus aromaticus, Eugenia aromatica, E. caryophyllata, E. caryophillus. Dénominations vernaculaires

- Français: clous de girofle, giroflier;

- Anglais: Clove tree.

Fig. 7: Clous de girofle

16.1.1- Caractéristiques

Le giroflier est un arbre petit à moyen, au feuillage persistant et dense, originaire des petites îles volcaniques de l'archipel des Moluques en Indonésie (HURTEL, 2001). Le fruit est une baie appelée « anthofle » allongée de 2,5 à 3 cm de long sur 1,3 à 1,5 cm le large, de couleur rouge foncé à maturité. Le clou de girofle a un aspect caractéristique brun foncé, à saveur chaude, brûlante, légèrement amère et fortement aromatique (LAREDJ, 2004).

La floraison se déroule du mois de septembre au mois de Mars (TEUSCHER et al., 2005).

Propriétés thérapeutiques

Selon LAREDJ (2004), cette plante peut manifester plusieurs activités entre autres: analgésique dentaire; antiseptique; stimulant; stomachique.

16.1.2 - Composition chimique de l'H.E. des clous de girofle

Selon BRUNETON (1999), la composition chimique de l'H.E. du girofle est caractérisée par la présence d'un propénylphénol largement prépondérant, l'eugénol. Majoritairement libre et en partie sous forme d'acétate d'eugényl, sa teneur oscille entre 70 et 85 %. L'eugénol est accompagné de plusieurs dizaines de composés terpéniques:

- des sesquiterpènes: á et â caryophyllènes (de 7 à 10%), á et â humulènes, á amorphène, á murolène, calaménène, calacorène.

- des esters: hexanoates d'éthyle, acétates de 2-heptanyle, de 2-nonalyle, de styralyle, de benzyle, de terpényle et d'éthylphényle;

- des oxydes: oxyde de caryophyllène, époxyde d'humulène.

L'H.E. des clous de girofle, extraite par hydrodistillation, contient principalement deux composés: l'eugénol et l'acétyleugénol (TREINER, 1999).

D'après (TREINER, 1999), l'une des caractéristiques fondamentales de l'H.E. des clous de girofle est sa densité élevé (d= 1,066 > d eau = 1.00), ce qui nous permet de les séparer par simple décantation: même caractéristique partagée avec les huiles de cannelle et de sassafras.

Eugénol

16.2- Eucalyptus 16.2.1- Caractéristiques

Parmi les 4000 espèces de Myratceae, le genre Eucalyptus en regroupe au moins 600 disséminées un peu partout dans le monde (HURTEL, 2001). L'Eucalyptus globulus Labill. (du nom de Labillardière qui le découvrit en 1800 lors d'un voyage en Australie) est une espèce très cultivée. Il a été introduit dans le sud de la France par Ramel, en 1860. Il s'est très bien acclimaté dans l'ensemble des pays méditerranéens.

Ses longues racines font qu'il joue un rôle important dans la fixation des sols (retard à la désertification) et dans le drainage des terrains marécageux (il a été introduit en 1857 en Algérie pour drainer les terrains de régions touchées par la malaria) (TREINER, 2000).

Fig. 8: Feuilles d'eucalyptus.

16.2.3- Constituants de l'huile essentielle

D'après TREINER (2000) et HURTEL (2001), la teneur en H.E. varie entre 0,5 et 3,5%. En 1870, le français CLOËZ donne au principal constituant de l'huile d'Eucalyptus globulus Labill. le nom d'eucalyptol. En 1884, JAHNS l'identifie comme étant le 1,8-cinéole (constituant majoritaire: environ 60 % à 80 %), le pourcentage restant représente plus de vingt-cinq composés de nature terpénique ont été identifiés, principalement de á-pinène, puis de l'aromadendrène, du globulol, viennent ensuite le limonène, le p-cymène, le lédol....

Eucalyptol (1,8-cinéole)

16.2.4- Utilisations

L'H.E. possède des propriétés bactéricides, antiseptiques (efficace contre les puces, elle est utilisée dans les colliers insecticides pour animaux). Mais elle a pour principal débouché l'industrie pharmaceutique en raison de propriétés antiasthmatique, expectorantes et stimulantes de l'épithélium bronchique et mucolytique. On l'utilise aussi comme aromatisant pour masquer le goût de certaines préparations pharmaceutiques (TREINER, 2000).

16.3- Myrte commun

Le myrte commun (Rihane en Kabyle) forme le genre Myrtus de la famille des myrtacées. Il a pour nom latin Myrtus communis (MICROSOFT ENCARTA, 2008). Deux variétés sont utilisées: l'une donnant une H.E. rouge et l'autre une H.E. verte. Les feuilles donnent une huile jaune-orangée au parfum frais et doux (HURTEL, 2001).

16.3.1- Caractéristiques

Le myrte commun est un arbuste persistant de 1 à 3 m de haut, caractéristique des formations végétales de type maquis⁽¹⁾. Il est originaire du bassin méditerranéen. Les fleurs sont blanches et très odorantes, de même que les fruits, de petites baies vertes devenant à maturité noire violacées au parfum prononcé. Il est odorant, aux feuilles vert vif, ovales, lisses, brillantes et petites (2 à 4 cm). Très utilisé jusqu'au XVIII^ème siècle, il est maintenant un peu oublié (HURTEL, 2001).

D'après TEUSCHER (2005), Myrtus communis peut vivre plus de 300 ans, comme le lentisque (Pistacia lentiscus) qui sont des plantes qui poussent à l'état spontané en Algérie. Contrairement aux autres espèces de sa famille (myrtacées), pour la plupart originaires des zones tropicales de l'hémisphère sud, le myrte se rencontre dans les régions tempérées chaudes de l'hémisphère nord (MICROSOFT ENCARTA, 2008).

(1) Zone de formation végétale dense, caractéristique des sols siliceux, composée de petits arbustes adaptés à la sécheresse, souvent épineux et pouvant atteindre 3 à 4 m de haut.

Fig. 9: Myrte commun.

16.3.2- Composition chimique et propriétés

Le myrte contient 0,3 à 0,5 % d'une H.E. aromatique, composée d'un alcool primaire, le myrténol, et d'une substance complexe, le myrtol, renfermant entre autres de l'eucalyptol. Il est astringent, antiseptique, stimulant, le myrte a des emplois voisins de ceux de l'eucalyptus (ENCYCLOPEDIA UNIVERSALIS, 2008).

16.3.3- Utilisations

Selon HURTEL (2001), l'huile en inhalation est utile dans les infections bronchiques et des voies respiratoires supérieures. Elle est aussi préconisée dans les infections urinaires. Traditionnellement, l'infusion des feuilles (30 g par litre d'eau) est utilisée comme cicatrisant antiseptique.

16.4- Sarriette

Cette plante appartient à la Famille des Lmiaceae.

Dénominations vernaculaires

- Français: sarriette des jardins, sarriette commune, sarriette annuelle, savourée, herbe aux pois, herbe aux haricots, herbe de Sain-Julien.

- Anglais: savory, summer savory.

16.4.1- Caractéristiques

C'est une plante annuelle de 30 cm de haut (plus rarement 60 cm), à racine fuselée et fibreuse. Elle ne comprend qu'une seule tige érigée qui se ramifie en de nombreux rameaux étalés, ce qui lui confère une allure touffue rappelant le thym (ex. Thymus vulgaris). Les rameaux rougeâtres sont recouverts d'un fin duvet et se lignifient à la base avec l'âge (TEUSCHER, 2005).

Les feuilles, de couleur vert cendré, ont 4 cm de long sur 0,5 cm de large; elles sont opposées, entières, linéaires, elles dégagent une odeur puissante et agréable et une saveur aromatique, légèrement poivrée (LINDBERG, 1996).

Les pays d'origine sont répartis de l'est des régions méditerranéennes jusqu'à l'ouest, l'Iran et au Caucase, l'ouest de l'Asie, l'Inde, l'Afrique du sud et l'Amérique du Nord.

Fig. 10: Sarriette des jardins.

16.4.2- Composition chimique

Le rendement en H.E. est de l'ordre de 0,3 à 4,2 %; ses principaux constituants sont le carvacrol (20 à 85 %), le ã-terpinène (10 à 40 %) et le p-cymène (5 à 25 %); ils sont accompagnés de â-caryophyllène, de myrcène, d'á-pinène, d'eugénol, d'á-terpinène et de thymol; dans une H.E. provenat de l'ex-Yougoslavie, le thymol domine ( 40 % ). Les dérivés d'acide hydroxycinnamique (principe amer des Labiées) constituent environ 3,4 % avec essentiellement de l'acide rosmarinique (0,4 à 2,6 %) (LAWRENCE, 1992). Selon LINDBERG (1996), les flavonoïdes, les triterpènes et les sérols constituent aussi une partie de cette H.E.

16.4.3- Propriétés

MENPHINI (1993), ont rapporté que les H.E. présentent des propriétés antimicrobiennes. Les extraits de sarriette sont des accepteurs d'O2 et des capteurs de radicaux libres, à cause de leur richesse en acide rosmarinique et en flavonoïdes diphénoliques. Ce sont de bons antioxydants et peuvent considérablement allonger la durée de conservation des produits carnés (LINDBERG, 1996).

CHAPITRE II

Activités Biologiques des H.E.

Introduction

Ces derniers temps, plusieurs questions se sont soulevées concernant la sécurité des produits chimiques conservateurs utilisés en industrie alimentaire. En effet, la peroxydation des lipides produite au cours des processus de fabrication et de stockage des aliments sous l'effet des radicaux libres oxygénés (RLO) conduit à des modifications de goût, d'odeur et de couleur et parfois constituent un risque pour la santé du consommateur et, par conséquent à la perte de la qualité et de la sécurité des aliments (MAU et al., 2004). Les antioxydants de synthèse sont généralement utilisés en industrie alimentaire pour retarder l'oxydation des lipides se sont avérés responsables d'effets indésirables. En effet, l'hydroxyanisole butylé (BHA) et l'hydroxytoluène butylé (BHT) sont suspectés avoir des effets négatifs sur la santé du consommateur (NAMIKI, 1990). D'un autre côté, l'usage extensif des agents antibactériens chimiques dans la médication humaine ainsi que dans les élevages animaux conduit à la sélection de souches bactériennes résistantes.

Ainsi, les H.E. commencent à avoir beaucoup d'intérêt comme source potentielle de molécules naturelles bioactives (BOUHDID et al., 2006).

Les H.E. possèdent de nombreuses activités biologiques. Selon les travaux de OCHOA (2005); FREEMAN et CAREL (2006), ces activités sont liées essentiellement à la composition chimique, aux groupes fonctionnels des composés majoritaires de ces extraits et à leurs effets synergiques.

Empiriquement reconnue depuis des siècles, la confirmation scientifique de l'activité antimicrobienne des H.E. est récente. Elle ne date que du début du siècle dernier avec les travaux du Dr Gattefossé, le père de l'aromathérapie en France (PIBIRI, 2005).

Beaucoup d'études ont été réalisées au sujet de l'activité antimicrobienne des extraits de plantes et de leurs H.E. (BOUSBIA, 2004) qu'elles soient citées dans des ouvrages, dans des journaux spécialisés de microbiologie ou présentées lors de congrès d'aromathérapie scientifique. Cette activité a été utilisée dernièrement pour la conservation du patrimoine bibliographique des musées évitant ainsi l'altération des ouvrages par des petits animaux nuisibles, et elle est naissante pour traiter la qualité de l'air dans les bâtiments (PIBIRI, 2005).

On attribue aux extraits de plantes aromatiques et notamment aux H.E. un certain nombre d'activités biologiques potentielles susceptibles de trouver des applications en agroalimentaire (ALITONOU et al., 2005).

1- Activité antibactérienne

Les activités antimicrobiennes des plantes aromatiques et médicinales sont connues depuis l'antiquité. Toutefois, il aura fallu attendre le début du XXe siècle pour que les scientifiques commencent à s'y intéresser. Ces propriétés sont dues à la fraction d'H.E. contenue dans les plantes (CAILLET et al., 2007 ; BOUAOUN, 2007).

1.1- Bactéricide et bactériostase

À la manière des agents chimiques, on distingue deux sortes d'effets des H.E. sur les microorganismes: une activité létale (bactéricide et fongicide) (CARSON et RILEY, 1995) et une inhibition de la croissance (bactériostatique) (FREEMAN et CAREL, 2006).

Au cours d'un travail au laboratoire, DORMAN et DEANS (2000) ont démontré que l'activité bactéricide des H.E. vis-à-vis des cellules bactériennes pourrait être expliquée par une dénaturation des protéines provoquée par le rôle solvant et déshydratant des huiles.

Une étude réalisée par COSENTINO et ses collaborateurs (1999) pour la détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et des Concentrations Minimales Bactéricides (CMB) pour 4 variétés de Thym (Thymus vulgaris) portant sur 14 souches bactériennes (dont Staphylococcus aureus) ont montré que dans la majorité des cas, les valeurs des CMI sont identiques aux CMB. Les mêmes auteurs ont conclu que les H.E. testées dans cette étude sont bactéricides.

D'autre part, certaines études ont été réalisées par BILLERBECK (2000) dans le but d'illustrer les dommages provoqués par certaines H.E. sur des cibles bactériennes à travers des images de haute résolution en utilisant la microscopie électronique.

1.2- Huiles essentielles et bactéries résistantes aux antibiotiques

Face au problème soulevé depuis plusieurs années par la résistance des bactéries aux antibiotiques, la seule alternative fiable à l'usage des antibiotiques semble être celle des H.E. Connue de façon empirique depuis des siècles, leur efficacité anti-infectieuse a été scientifiquement démontrée "in vitro" et "in vivo" (CAREL, 2006).

De nombreux chercheurs de l'université de Manchester (Royaume-Uni) ont montré que ces produits sont actifs contre des germes pathogènes résistants aux antibiotiques tels que S. aureus résistant à la méthicilline (MRSA), Streptococcus pneumoniae résistant à la pénicilline, Enterococcus faecium résistant à la vancomycine, Candida albicans résistant à l'azolé et Herpes simplex résistant à l'acyclovir. Ceci est dû au mécanisme original des H.E. (AVERTIT, 2004; BOUAOUN et al., 2007). Selon INOUYE et ABE (2007), l'efficacité des antibiotiques dépend de la dose et du temps de contact. Des expérimentations sur des animaux de laboratoire a permet de savoir que l'efficacité des antibiotiques reste toujours limitée. Les H.E., contrairement aux antibiotiques, sont constituées de si nombreuses molécules que les bactéries ne peuvent y résister en mutant (ENRICO et al., 2004).

1.3- Mécanismes d'action des huiles essentielles sur les bactéries

Les mécanismes d'action des H.E. et leur sélectivité envers certaines bactéries restent jusqu'à présent mal élucidés (HAMMER et al., 1999; DORMAN et al., 2000; BAGAMBOULA et al., 2004). Selon ces auteurs, cette sélectivité est le résultat de la composition variée des fractions actives des huiles, qui présentent souvent des actions synergiques. Il semble que le mécanisme d'action de ces huiles est lié essentiellement à la structure de la paroi et à la perméabilité membranaire des bactéries à Gram+ et Gram-.

RAYOUR (2003) a examiné le mécanisme d'action des H.E. des Clous de girofle et d'origan (Origanum vulgare) simultanément avec ceux de deux de leurs composants, le thymol et l'eugénol, sur des bactéries: E. coli et Bacillus subtilis et qui ont été utilisées

respectivement comme modèles de bactérie Gram+ et Gram-. Les deux H.E. tout comme leurs deux composants ont été capables d'induire une lyse cellulaire. Cette action a été démontrée par la libération de substances absorbantes à 260 nm. Cette libération de substances associée à la rapide mortalité bactérienne pourrait être la conséquence de lésions sur les enveloppes induites par les agents antibactériens. L'utilisation d'un microscope électronique a permis de montrer que les H.E. attaquaient en même temps les membranes et les parois cellulaires.

Les travaux de BURT (2004) ont montré qu'une H.E. active exercera son pouvoir antimicrobien par son interférence avec la bicouche lipidique de la cellule cible grâce à sa propriété hydrophobe, ce qui entraîne une perturbation de la perméabilité et perte des constituants de la cellule. En plus, cette réaction varie en fonction de la nature de la bicouche lipidique, ce qui explique la résistance des bactéries Gram- (MAHMOUD et al., 2004). En outre, DABBAH et ses collaborateurs (1970) ont mis en évidence la grande sensibilité des bactéries Gram+ par rapport aux Gram- et aux champignons. Dans la même démarche d'étude, GORDON et ses collaborateurs (1973) et MAHMOUD et ses collaborateurs (2004) ont suggéré que l'effet antimicrobien qu'exercent les H.E. pourrait être expliqué par la destruction de certains systèmes enzymatiques incluant ceux qui participent dans la production d'énergie cellulaire et la production des composés structuraux. MAHMOUD et ses collaborateurs (2004), GUESMI et BOUDABOUS (2006) quant à eux, ont avancé l'hypothèse d'inactivation et destruction du matériel génétique et, enfin CAILLET et ses collaborateurs (2007) ont signalé que les H.E. empêchent la multiplication des bactéries, leur sporulation et la synthèse de leurs toxines.

Dans une autre étude qui a été réalisée par FREEMAN et CAREL (2006), l'H.E. d'arbre à thé (Leptospermum citratum) a provoqué des fuites d'ions potassium (K+) au niveau des membranes cellulaires d'E. coli et S. aureus. Cette fuite de K+ est la toute première preuve de l'existence de lésions irréversibles au niveau de la membrane de la bactérie. Le thymol, le carvacrol, des composants actifs d'H.E., rendent perméable la membrane des bactéries, un effet précurseur de leur mort. Les H.E. ont donc bien des propriétés bactéricides.

D'après CAILLET et ses collaborateurs (2007), l'action antimicrobienne des H.E. se déroule en trois phases:

- Attaque de la paroi bactérienne par l'H.E., provoquant une augmentation de la perméabilité puis la perte des constituants cellulaire;

- acidification de l'intérieur de la cellule, bloquant la production de l'énergie cellulaire et la synthèse des composants de structure;

- destruction du matériel génétique, conduisant à la mort de la bactérie.

1.4- Résistance des bactéries Gram- à certaines huiles essentielles

Chez les bactéries à Gram+, le peptidoglycane est très épais et associé à des protéines pariétales exposées et à des structures polyosidiques (acides lipoteichoïques, acides

teichoïques...). Par contre chez les bactéries à Gram-, le peptidoglycane est très fin et associé à une enveloppe externe complexe définissant un espace périplasmique. Cette membrane externe est une bicouche lipidique asymétrique hydrophobe constituée de phospholipides, de protéines (porines...) et lipopolysaccharides (LPS). L'espace périplasmique est rempli d'enzymes qui dégradent les substances complexes pour qu'ils puissent traverser la membrane cytoplasmique, et inactivent les produits chimiques toxiques (antibiotiques, métaux lourds...) (BERCHE, 2003).

La résistance des bactéries à Gram- aux glycopeptides et aux macrolides est due à l'incapacité de ces molécules de franchir la membrane externe (BERCHE, 2003).

Fig. 11: Structure de la paroi bactérienne Gram+ (d'après LAVIGNE, 2007).

Fig. 12: Structure de la paroi bactérienne Gram- (d'après LAVIGNE, 2007).

2- Activité antifongique

FREEMAN et CAREL (2006), ont signalé que les groupes moléculaires avec les plus puissantes actions antibactériennes sont également des antifongiques efficaces, mais ils doivent être utilisés sur de plus longues périodes. Expérimentalement, les H.E. des plantes aromatiques et médicinales ont fait preuve de leur efficacité antifongique parfois même supérieure à celle des agents antifongiques commerciaux.

Une étude a porté sur les effets antifongiques de l' H.E. de thym (RASOOLI et al., 2006), et plus particulièrement sur les conséquences de cette huile sur l'ultrastructure du champignon Aspergillus niger. Elle a tout d'abord permis de déterminer grâce à la microscopie électronique, que lorsque A. niger était exposé à l'H.E., celle-ci provoquait des dommages irréversibles sur la membrane cellulaire ainsi que sur les organites du champignon (BARRAL et al., 2007). Alors qu'elles inhibent la germination des spores, l'élongation du mycélium, la sporulation et la production de toxines chez les moisissures (CAILLET et LACROIX, 2007).

L'action fongicide des H.E. des clous de girofle et d'origan a été testée sur un modèle de levure Saccharomyces cerevisiae. La lyse des cellules de levure a été montrée par la libération de substances absorbant à 260 nm. Des analyses au microscope électronique ont montré que la surface des cellules traitées par les H.E. d'origan et de clous de girofle était significativement endommagée (CHAMI, 2005).

L'huile de la Menthe pouliot (Mentha pulegium) dont le composé majoritaire est la R (+) pulégone (82%) est dotée d'un fort pouvoir antifongique contre Pénicillium et Mucor (BELGHAZI et al., 2002).

Une étude a évalué l'activité antifongique de l'huile des clous de girofle sur toute une variété de champignons pathogènes, incluant ceux responsables d'infections urogénitales (AHMAD et al., 2005). Selon CHAMI (2006), l'huile des clous de girofle a démontré une puissante activité antifongique contre des champignons pathogènes opportunistes tels que Candida albicans, Cryptococcus neoformans et Aspergillus fumigatus.

2.1- Mode d'action des huiles essentielles sur les levures

GIORDANI et KALOUSTIAN (2006) ont souligné que les composés terpéniques des H.E. et plus précisément leurs groupements fonctionnels tels que les phénols et les aldéhydes réagissent avec les enzymes membranaires et dégradent la membrane plasmique entraînant une fuite du contenu cytoplasmique et donc la mort de la levure (COX, 2000).

2.2- Les principales huiles ayant un pouvoir antifongique

D'après GIORDANI et KALOUSTIAN (2006), les principales espèces botaniques productrices d'H.E. dotées d'un pouvoir inhibiteur de la croissance des levures sont les suivantes:

- Melaleuca alternifolia (arbre à thé) ;

- diverses espèces de Cinnamomum (cannelier);

- Sassafras albidum (sassafras), Laurus nobilis (laurier-sauce), Aniba rosaeodora; - Artemisia absinthium (armoise amère ou absinthe);

- nombreuses espèces de Thymus (thym);

- diverses espèces d'Origanum (origan);

- diverses espèces de Pinus (pin);

- diverses espèces de Mentha (menthe);

- Agastache rugosa (Agastache coréenne);

- Juniperus communis (genévrier);

- diverses espèces de Lavandula (lavande);

- Citrus bergamia (bergamotier);

- Salvia fructicosa (sauge).

Les résultats expérimentaux de ces deux derniers auteurs ont montré que les huiles présentant un fort pouvoir antifongique, telles que celles de thym et de cannelle, pourraient constituer une solution alternative intéressante dans les thérapies antimycosiques.

Le carvacrol et le thymol, deux composés rencontrés dans la majorité des espèces botaniques possèdent une activité antifongique contre les mycètes phytopathogéne (SCHWAMMLE et al., 2001).

3- Activité antivirale

De nombreuses familles de molécules chimiques rencontrées dans les extraits végétaux ont montré "in vivo" une activité antivirale et, parmi elles, les monoterpénols et les monoterpénals (FREEMAN et CAREL, 2006).

Selon les travaux d'INOUYE et ABE, (2007), il existe des H.E. de plantes exotiques très puissantes qui ont un fort pouvoir antiviral et qui sont connues pour leur efficacité.

Les H.E. sont sélectivement absorbées et perturbent les fonctions des membranes biologiques de la cellule, sur la mitochondrie et autres organites vitales pour tous les organismes hormis les virus (les H.E. ne sont actives que sur les virus à enveloppe comme celui de la grippe et du VIH (virus de l'immunodéficience humaine).

4- Activité antioxydante

L'utilisation des molécules antioxydantes de synthèse étant actuellement remise en cause en raison des risques toxicologiques potentiels. Ainsi, de nouvelles sources végétales d'antioxydants naturels (carvacrol, eugénol, tocophérol, thymol...) sont recherchées par les industriels (BELHADJ et al., 2006). DJENANE et ses collaborateurs (2002), ont rapporté que les viandes traitées avec des antioxydants naturels d'origine végétale, emballées sous atmosphère modifiée (en présence de O2, CO2, N2) et postérieurement exposées dans des vitrines frigorifiques illuminées par des tubes fluorescents standards ont montré une stabilité chimique et microbiologique durant une longue période d'exposition par rapport aux viandes non traitées. Les travaux de HELME et ses collaborateurs (2004) ont confirmé la nature antioxydante des H.E. extraites d'épices et d'herbes: thym, carvi, cumin, clou de girofle, romarin, sauge. Selon FARAGF et ses collaborateurs (1989), le pouvoir antioxydant, déterminé par oxydation en émulsion aqueuse du p-carotène par l'acide linoléique, de ces extraits serait par ordre décroissant: carvi > sauge > cumin > romarin > thym > clou de girofle. Pour ces extraits naturels, certains travaux (FARAGF et al., 1989; CHEVOLLEAU, 1990) font état de pouvoir antioxydant supérieur à celui du BHT (butylhydroxytoluène ou E 321). D'après GHEDIRA (2006), la thymoquinone (composé majoritaire dans l'H.E. de Nigella sativa) inhibe la lipoperoxydation lipidique non enzymatique dans les liposomes. La thymoquinone, le carvacrol, le t-anéthole et le 4-terpinéol (composés de cette même huile) exercent un important effet piégeur des radicaux libres.

Une étude de SCHWAMMLE (2001) a exploré que le carvacrol est un des composants principaux des H.E. de certaines Lamiaceae, comme l'origan, thym dont la teneur peut atteindre jusqu'à 86%. L'activité antioxydante de ces herbes est due au carvacrol, thymol et autres phénols.

5- Combinaison entre les huiles essentielles

Certaines études ont montré que l'activité biologique des H.E. est supérieure à celle de ses composés majoritaires testés séparément. Les composés purs, le thymol et le carvacrol ont un net effet synergique, ce qui expliquerait les différentes activités des chémotypes de Thyms. L'aldéhyde cinnamique est généralement indifférent aux deux phénols (LAHLOU, 2004).

Les effets antimicrobiens des associations d'H.E., comme pour les associations d'antibiotiques, sont définis selon quatre interactions possibles:

- Indifférence: l'activité d'une H.E. n'est pas affectée par l'autre: (A + B) = effet A ou effet B.

- Addition: l'effet de l'association est égal à la somme des effets de chaque H.E. étudiée isolément, à la même concentration que dans l'association: (A + B) = effet A + effet B.

- Synergie: l'effet est significativement supérieur à la somme de chaque H.E. étudiée isolément, à la même concentration: (A + B) > effet A + effet B.

- Antagonisme: l'association diminue l'activité de l'une ou l'autre des H.E. Elle est inférieure à la somme des effets de chaque H.E. prise séparément: (A + B) < effet A ou effet B.

Cependant, une étude réalisée par SKANDAMI et ses collaborateurs (2001) ne corrobore pas les effets de synergie mentionnés. Une combinaison de concentrations comparables en thymol et en carvacrol reproduit bien l'inhibition de l'H.E. mais les autres composés minoritaires ont pour effet de diminuer l'effet des principaux composés actifs phénolés.

Dans une étude réalisée par PIBIRI (2005), il a été observé que des associations d'H.E. de cannelle et de thym sont synergiques vis-à-vis de S. aureus. En revanche, elles sont indifférentes sur le genre Bacillus; par contre sur P.aeruginosa et E. coli (Gram-) de telles associations ne sont pas plus efficaces et sont souvent indifférentes. En revanche la cannelle testée individuellement est plus efficace que celle de thym, contrairement aux cas de présence de bactéries à Gram+.

6- Activité liée à la composition chimique

De récentes études (CAILLET et LACROIX, 2007) montrent qu'une H.E. contient souvent de 50 à 100 molécules différentes et peut à l'extrême en comprendre jusqu'à 500. Sa composition biochimique n'est par ailleurs jamais rigoureusement identique. Il est impossible de reproduire en laboratoire cette complexité présente à l'état naturel. C'est ce qui explique notamment la grande efficacité des H.E. dans le cadre de la lutte contre les bactéries, les champignons ou les virus.

Selon BOUAOUN et ses collaborateurs (2007), la plupart des composés chimiques des H.E. sont dotés de propriétés antimicrobiennes, mais ce sont les composés volatils majeurs qui présentent les propriétés antimicrobiennes les plus importantes, et en particulier les phénols, les alcools et les aldéhydes (voir tableau II): carvacrol (origan, sarriette), eugénol (feuille de cannelle de Ceylan, clou de girofle), linalool (coriandre), cynnamaldéhyde (cannelle de Chine), thymol (thym).

L'activité des H.E. est souvent réduite à l'activité de ses composés majoritaires, ou ceux susceptibles d'être actifs. Évalués séparément sous la forme de composés synthétiques, ils confirment ou infirment l'activité de l'H.E. de composition semblable. Il est cependant probable que les composés minoritaires agissent de manière synergique. De cette manière, la valeur d'une H.E. tienne à son "totum", c'est à dire dans l'intégralité de ses composants et non seulement à ses composés majoritaires (LAHLOU, 2004).

Les phénols sont responsables des altérations irréversibles au niveau de la membrane bactérienne. Le thymol et l'eugénol sont responsables de l'activité fongicide (BENNIS et al., 2004) et bactéricide des H.E. qui en contiennent (COX et al., 2000). La molécule de thymol a un effet inhibiteur et létal sur diverses souches, dont E. coli et S. aureus, sur lesquelles elle provoque des fuites d'ions potassium (K+). En revanche elle n'est pas active sur P. aeruginosa (WALSH et al., 2003). Plus les teneurs en phénols sont élevées, plus les H.E. sont efficaces (COSENTINO et al., 1999).

Tableau II: Bioactivité de quelques principaux terpènes rencontrés dans les H.E. (HERNANDEZ et OCHOA, 2005).

Composés aromatiques	Formules développées					Caractères physicochimiques	Teneur de quelques plantes	Propriétés
	Exemples
						Densité: 0,98g/ml	-Thym (T. vulgaris)
						PM: 150,2	33%
							-Origan (origanum vulgare) 76%	-Stimulantes;
								-Toniques;
								-Antiseptiques;
								-Bactéricides;
	carvacrol						-Girofle	-Fongicides;
							(S. aromaticum)	-Antivirale;
							82%	-Antiparasitaires;
Phénols							-Bay St Thomas	-Irritantes
							(P. racemosa) 60%
							-Poivre (P. dioica)
						Densité: 1.07g/ml PM: 164.2	54%
	Eugénol
						Densité: 0.88g/ml	-Palmarosa
						PM: 154.3	(C. martinii) 75-
							95% (C. helichrysum	-Anti-inflammatoire;
							spp.) 80-90%	-Antiseptiques; -Bactéricides;
Alcools	Géraniol						-Citronelle	-Fongicides; -Antivirale;
Terpéniques							(C. winterianus) 12- 18%	-Neurotoniques
						Densité: 0.86 g/ml	-Citronelle
						PM: 156,3	(C. winterianus)
							11-15%
	Citroneiol
Aldéhydes Terpéniques		Citronellal				Densité: 0.89 g/ml PM: 154,30	-Citronelle (C. winterianus) 35- 45% -Eucalyptus citronne (E. Citriodora) 90 %	-Antifongiques; -Toxicité liée à la présence du groupe aldéhyde; -Insecticide.
Cétones			Carvone			Densité: 0,96 g/ml PM: 150,2	-Carvi (Carum carvi), 50%	-Calmantes; -Antivirales; -Antifongiques; -Neurotoxiques; -Antiépileptique.
Hydrocarbures aliphatiques, sesquiterpènes	Limonène					Densité: 0,96 g/ml PM: 150,2	-Carvi (Carum carvi), 45%	-Fongistatique; -Bactériostatique; -Insecticides; -Nematicide; -Herbicide.

7- Les principales techniques de détermination de l'activité

antimicrobienne des H.E.

La technique de détermination du pouvoir antimicrobien des H.E. a une grande influence sur les résultats. Les difficultés pratiques viennent de l'insolubilité des constituants des H.E. dans l'eau, de leur volatilité, de la nécessité de les tester à de faibles concentrations et, des problèmes de standardisation des méthodes (BOUSBIA, 2004).

6.1- Aromatogramme

L'aromatogramme est basée sur une technique utilisée en bactériologie médicale, appelée antibiogramme ou méthode par diffusion en milieu gélosé ou encore méthode des disques. Cette méthode a l'avantage d'être d'une grande souplesse dans le choix des H.E. testées, de s'appliquer à un très grand nombre d'espèces bactériennes, et d'avoir été largement évaluée

par 50 ans d'utilisation mondiale (FAUCHERE et AVRIL, 2002). Il s'agit d'une méthode en milieu gélosé à l'agar1 réalisée dans une boîte de Pétri.

Le contact se fait par l'intermédiaire d'un disque de papier sur lequel on dispose une quantité donnée d' H.E. (Figure 13).

Fig. 13: Illustration de la méthode d'aromatogramme (ZAIKI, 1988).

6.2- Technique de microatmosphère

Le protocole des microatmosphères est techniquement proche de celui des aromatogrammes. Cette méthode en boîte de Pétri constitue une première approche pour l'étude de l'activité antimicrobienne des vapeurs de produits volatils (BILLERBECK, 2003).

Selon BOUSBIA (2004), cette méthode consiste à déposer un disque de papier filtre imprégné d'H.E. au centre du couvercle d'une boîte de Pétri (figure 14), sans que l'H.E. entre en contact avec la gélose ensemencée par les micro-organismes. La boîte est hermétiquement fermée. Il se produit une évaporation des substances volatiles dans l'enceinte de la boîte et les cellules sensibles de l'inoculum sont inhibées. La lecture du test porte donc sur la croissance ou non de l'inoculum se traduisant par un halot qui sera mesuré par un pied à coulisse.

Cette méthode ne quantifie pas l'activité antimicrobienne réelle des H.E. elle montre seulement la sensibilité du microorganisme présent aux constituants volatils à la température d'incubation (BOUSBIA, 2004).

Fig. 14: Illustration de la méthode de microatmosphère (BOUSBIA, 2004).

6.3- Technique par contact direct

La technique par contact direct consiste à mettre en présence l'H.E. et les micro-organismes, puis à observer la croissance de ces derniers. Le contact peut avoir lieu en milieu gélosé ou liquide (BOUSBIA, 2004).

Fig. 15: Schéma représentant la technique de contact direct (MEZAOUR, 2006).

6.4- Méthode de diffusion en puits ou en cylindre

C'est une méthode qui a été proposée par Cooper et Woodman en 1946, et reprise par la suite par Schroder et Messing en 1949, elle assure une diffusion radiale de l'H.E. à partir d'un puits en donnant une zone d'inhibition claire et facilement mesurable. La méthode consistait à découper un trou circulaire vertical dans la gélose et à y verser une solution d'H.E. de concentration connue. L'H.E. diffuse radialement créait une zone d'inhibition circulaire à la surface de la gélose préalablement ensemencée avec la suspension bactérienne (DORMAN et DEANS, 2000).

6.5- Méthode de dilution

Les H.E. à tester peuvent également être directement mélangées en concentration connue au milieu de culture, qu'il soit solide ou liquide sans oublier que les techniques de dilution

exigent une dispersion homogène. Le milieu est ensuite inoculé à un taux déterminé de microorganismes et, après incubation, on note la présence ou l'absence de culture; la lecture peut être visuelle ou spectrophotométrique, car le degré d'inhibition est en rapport avec la turbidité du milieu (BOUSBIA, 2004).

CHAPITRE III

Application des H.E.

dans le domaine agroalimentaire

Introduction

Parmi les micro-organismes inertes, il y a ceux qui participent à l'élaboration d'aliments fermentés (yaourt, saucisson, fromage, etc.) et ceux qui, s'ils peuvent se multiplier dans l'aliment, l'altèrent c'est-à-dire lui confèrent des goûts, des odeurs ou des aspects inacceptables. Quelques espèces pathogènes sont responsables des troubles divers, allant de problèmes digestifs bénins à des maladies graves provoquant jusqu'à 30 % de décès ou des séquelles invalidantes (AFSSA, 2006).

La tendance actuelle des consommateurs à rechercher une alimentation plus naturelle, a entraîné un regain d'intérêt des scientifiques pour ces H.E. Cependant, c'est seulement récemment que beaucoup d'attention a été donnée à leur application potentielle comme conservateurs dans le domaine agroalimentaire (PALMER, 1998).

Les H.E. et leurs composants, actuellement employés comme arômes alimentaires, pourraient donc servir d'agents de conservation alimentaire, d'autant plus qu'ils sont pour la plupart classés "généralement reconnus comme sains: Generally Recognized As Safe (GRAS) " ou approuvés comme additifs alimentaires par la Food and Drug Administration Américaine (FDA). Ils n'ont, par conséquent, pas besoin d'autorisation d'emploi dans les aliments, mais des études préalables sont nécessaires pour mieux cerner leur activité antimicrobienne (CAILLET et LACROIX, 2007).

L'évaluation des propriétés antimicrobiennes des H.E. demeure très importante pour les exploiter dans l'industrie comme étant des conservateurs naturels (GUESMI et BOUDABOUS, 2006).

1- Systèmes de sécurité sanitaire des aliments en Algérie

La disponibilité d'aliments sains et nutritifs est l'un des droits fondamentaux de la personne et un facteur essentiel pour un état de santé adéquat. Le problème de la consommation d'aliments contaminés et de ses effets préjudiciables à la santé humaine, n'a pas été étudié de façon suffisamment approfondie en Algérie. Le gouvernement devrait toutefois prendre les mesures nécessaires pour garantir à sa population une alimentation saine et en soutenir ainsi la santé et le développement économique.

À l'échelon mondial, la sécurité sanitaire des aliments est une question de santé publique de plus en plus importante, centrée sur la participation des consommateurs et de leurs associations aux processus décisionnels. Les maladies d'origine alimentaire affectent lourdement la santé des gens et leur bien-être et qu'elles ont des conséquences économiques non seulement pour les individus, mais aussi pour les communautés et les pays.

Les données de la surveillance des maladies devraient permettre d'estimer le pourcentage des cas ayant une origine alimentaire et plus spécifiquement, le nombre de ceux qui peuvent être attribués à des aliments spécifiques. Cette information est nécessaire pour la gestion des risques pour la sécurité sanitaire des aliments, étant donné qu'il existe également d'autres voies de transmission pour la plupart des pathogènes que l'on trouve dans les aliments, par exemple à travers l'eau, le contact avec les animaux ou l'environnement. Les gestionnaires des

risques peuvent également cibler les contrôles avec davantage de précision lorsque le lien spécifique entre le pathogène et l'aliment peut être établi.

En Algérie, les toxi-infections alimentaires accompagnées de symptômes tels que la diarrhée et parfois la fièvre, sont monnaie courante et généralement considérées comme sans gravité et spontanément résolutives. Les médicaments, lorsqu'ils sont utilisés, sont achetés au comptoir et les cas de maladie ne sont pas déclarés.

Certaines coutumes régionales ou locales, comme la consommation des viandes hachées (hamburgers, merguez, boulettes, etc.), et certaines techniques de préparation spécifiques, telles que les conditions de hachage et de conservation multiplient les risques de contamination microbiologique et donc la diffusion des maladies d'origine alimentaire.

De nombreux facteurs contribuent à la forte incidence des maladies transmises par les aliments en Algérie. Des systèmes de bonnes pratiques de fabrication (BPF) et d'assurance qualité comme l'Analyse des Dangers-Points Critiques pour leur Maîtrise (ADPCM) , ont été introduits dans le secteur de la production alimentaire et de la restauration, mais leur mise en application est généralement limitée voire même inexistante.

La vente de viandes fraîches exposées en carcasses entières et parfois coupées en quartiers sur la voie publique dans différentes villes d'Algérie à des températures abusives et parfois mêmes des viandes issues d'un abattage clandestin constitue une importante source de nourriture pour une grande partie de la population algérienne et les vendeurs n'ont souvent aucune formation spécifique aux risques qui peuvent découler de ces pratiques.

L'impact des systèmes de sécurité sanitaire des aliments sur la santé humaine en Algérie est difficile à déterminer. Il n'existe pas d'études comparatives; aucune vue d'ensemble des agents pathogènes, ni de l'incidence des maladies d'origine alimentaire n'est disponible; et en général les tendances de l'incidence de ces maladies ne sont pas encore connues du fait du démarrage relativement récent de la collecte de données. L'Algérie doit poursuivre ses efforts pour que la sécurité sanitaire des aliments soit solidement inscrite dans ses programmes nationaux de santé publique. La mise en place de systèmes intégrés de contrôle des aliments et de surveillance des maladies d'origine alimentaire, requiert une collaboration et une coordination efficaces avec l'ensemble des parties prenantes dans les secteurs de la santé, de l'agriculture et du commerce. Le renfort des capacités scientifiques et techniques pour prévenir, maîtriser et gérer les risques reste indispensable. La charge des maladies d'origine alimentaire est encore très lourde dans la région et des efforts doivent être déployés afin de réduire l'impact de ces affections sur la santé humaine.

Les Algériens consomment de plus en plus la viande et sous différentes formes. Sa qualité est d'une importance vitale sur un marché, mais les conditions hygiéniques de sa préparation et manipulation ainsi que celles de sa conservation sont peu respectées.

L'arrivée de la saison estivale est généralement à l'origine de plusieurs cas d'intoxications alimentaires dues essentiellement à la consommation de produits avariés, devenus impropres

pour le non-respect de la chaîne de froid ou défaut d'hygiène notamment quand il s'agit de restauration publique.

Selon le bilan établi par la direction de la Santé (DSP) et la direction du commerce, la capitale de l'Est (Constantine) a enregistré durant cette année 4 115 interventions assorties de 43 fermetures de différents commerces. La nature des contraventions a touché beaucoup plus les viandes avec près de 9 tonnes saisies.

2- Quelques évènements récents sur les intoxications alimentaires en Algérie

Au cours du premier semestre 2007, 1400 fermetures des établissements alimentaires pour non-respect des conditions d'hygiène sur des produits alimentaires et mettant en danger la santé des consommateurs ont été enregistrées (Ministère du Commerce: Alger). L'Algérie enregistre des cas d'intoxications alimentaires de plus en plus fréquents et coûteux. Près de 6000 cas ont été enregistrés par exemple en 2008 à l'échelle nationale et le risque est plus que jamais présent avec l'arrivée de la saison estivale. Il est utile de signaler que près de 40% des cas d'intoxication sont dus à l'ingestion de viandes et dérivés impropres à la consommation. Cette pathologie s'est développée à grands pas en raison de la prolifération de la restauration collective, de la libre circulation des denrées alimentaires et aussi du développement de l'industrie agroalimentaire celle-ci s'est aggravée à cause de l'absence et du non-suivi d'impératifs d'hygiène, rupture de la chaîne de froid et de sécurité alimentaire.

3- Les applications alimentaires des H.E.

Les études qui ont été réalisées jusqu'à maintenant, montrent que les H.E. peuvent être appliquées à tous les aliments. Ainsi, les H.E. d'origan, de thym, de cannelle ou de coriandre sont efficaces pour les viandes, les volailles, les charcuteries et les légumes; l' H.E. de menthe pour les produits frais (salades, yaourts...); les H.E. à base de cavarcrol ou de citral pour les poissons; les H.E. de thym, de noix de muscade ou de gingembre pour les céréales (plus particulièrement celles riches en carvacrol pour le riz); et les H.E. à base de carvacrol ou de cinnamaldéhyde pour les fruits (CAILLET et LACROIX, 2007).

Les H.E. sont aussi utilisées pour apporter de la saveur et un arôme raffiné au café, au thé, aux vins et aux liqueurs distillées (MICROSOFT ENCARTA , 2008).

Les études de CAILLET et LACROIX (2007) ont montré que l'incorporation d' H.E. dans la viande hachée du boeuf a contribué au maintien de la qualité microbiologique et à la réduction de l'oxydation des gras au-delà de sa durée normale d'entreposage. Ils ont aussi démontré que l'utilisation des H.E. pouvait augmenter la sensibilité des bactéries à différents procédés de conservation des aliments (chauffage, pasteurisation, atmosphère modifiée). Selon la bactérie et le procédé utilisé, la sensibilisation augmente de 2 à 10 fois. Par exemple, l'H.E. mélangée à des carottes hachées, emballées sous air ou sous atmosphère modifiée (AM ou MAP: Modified Atmospheres Packaging en anglais) permet de multiplier par trois la sensibilité de Listeria sp., de même que pour de la viande hachée emballée sous les mêmes

conditions, une augmentation très significative de la sensibilité d'E. coli (2.5 fois) et de Salmonelle (4.5 fois) est constatée en présence d' H.E. Aussi, l'H.E. combinée à un chauffage doux (55 °C pendant 1 minute) a permis d'inhiber totalement Salmonelle, alors qu'en absence d'huile, un chauffage de plus d'une heure était nécessaire pour arriver au même résultat. Cependant, le seuil d'efficacité des huiles les plus efficaces étant très bas, souvent inférieur à 0.1%, leur ajout en très faibles quantités n'altère pas les qualités organoleptiques de l'aliment.

D'après BOUSBIA (2005) des investigations ont été effectuées pour évaluer l'efficacité de quatre H.E. de plantes: Laurier, clou de girofle, cannelle et thym en tant que conservateurs normaux. L'effet d'H.E. aux concentrations de 0,1 de 0,5 et de 1 % a été étudié en fromage à pâte molle à faible teneur en matière grasse et à matière grasse naturelle contre Listeria monocytogenes et Salmonella enteritidis à 4°C et à 10°C respectivement, sur une période de 14 jours. Ils ont conclu que les H.E. des plantes choisies agissent comme inhibiteurs potentiels contre L. monocytogenes et S. enteritidis dans ce produit alimentaire (PALMER et al., 2001).

Les traitements du pâté tout préparé de foie de porc avec le romarin retardent la croissance de Listeria monocytogenes (BOUSBIA, 2005). Aeromonas hydrophila et Listeria monocytogenes ont été inhibées sur la viande cuite (poitrine de poulet) par des extraits d'eugénol et de piment.

4- Facteurs influencent les propriétés antimicrobiennes des H.E. dans

les aliments

D'après CAILLET et LACROIX (2007), certains facteurs comme la température, les conditions de stockage, le pH ou la composition de l'aliment, peuvent avoir une influence sur l'action des H.E. Il est établi que l'efficacité de l'huile augmente avec la diminution du pH de l'aliment, de la température de stockage ou encore de la quantité d'oxygène dans l'emballage. Cela est d'autant plus intéressant que les quantités d'huiles nécessaires pour le contrôle de la croissance bactérienne dans les aliments conservés à basse température pourraient être réduites. Il est également prouvé qu'une même huile sera plus efficace dans un aliment pauvre en gras et/ou en protéines. Les fortes teneurs en eau et en sels d'un aliment vont aussi favoriser l'action de l'H.E., alors qu'une structure gélatineuse va au contraire la limiter.

L'incorporation des H.E. directement dans les aliments ou l'application par vaporisation en surface de l'aliment (pièce de viande, charcuterie, poulet, fruits et légumes entiers...) contribue à contrôler la flore microbienne et à préserver l'aliment des phénomènes d'oxydation (CAILLET et LACROIX, 2007).

5- Bactéries responsables de toxi-infections alimentaires 5.1- Staphylococcus aureus

Nom commun: Staphylocoque doré (staph.= grappe de raisin, aureus= doré). 5.1.1- Caractères bactériologiques

Le genre Staphylococcus appartient à la famille des Micrococcaceae et se compose de 34 espèces et 13 sous-espèces. Staphylococcus aureus en est l'espèce la plus fréquente et la plus connue (LARPENT, 1997).

C'est un coque à Gram+ de 0,5 à 1 um de diamètre, non sporulé, immobile, aéro-anaerobie facultatif, catalase+, fermentant le glucose, T° optimale: 37, pH optimum: 6-7, a_w optimale > 0,99. C'est une bactérie ubiquitaire, présente dans tous les milieux naturels (air, poussière, sol, eau, égouts, vêtements) mais également chez les animaux et chez les hommes. Contrairement à la bactérie S. aureus, ces entérotoxines sont très résistantes à la chaleur (30 mn/120°C), aux variations de pH (entre 4 - 11) et aux enzymes protéolytiques (papaïnes, trypsine). Ces caractéristiques permettent aux toxines ingérées d'atteindre le tube digestif sans modification de leur toxicité. Chez l'homme, les symptômes se traduisent soit par des syndromes gastrointestinaux de types crampes abdominales, vomissements, nausées, diarrhées. Dans le cadre des intoxications alimentaires staphylococciques, les symptômes apparaissent très rapidement après l'ingestion de l'aliment contaminé (2 - 6 h) et les douleurs peuvent être très violentes, mais les personnes récupèrent en 24 heures. Les aliments dits à risque, c'est-à-dire souvent impliqués dans ces cas d'infections à entérotoxine de staphylocoque, sont les produits laitiers, les salades, les préparations à base de viande, volailles et poissons, les oeufs et ovoproduits (DELARRAS, 2007).

5.1.2- Habitat et pouvoir pathogène

C'est le plus régulièrement pathogène, d'origine humaine, animale (volaille, bovin, ovin, caprin...), environnementale ou non spécifique (DELARRAS, 2007). C'est une bactérie présente chez les humains, lesquels sont à 95% responsables des contaminations alimentaires. 50% des humains sont porteurs de ce germe (cavité nasale), ceci même chez un individu en santé. On peut le retrouver en particulier dans les préparations alimentaires à cause d'un manque d'hygiène du personnel (porteur sain ou blessures). Il se retrouve facilement dans les aliments (LARPENT, 1997).

La présence de S. aureus dans les aliments constitue un risque pour la santé humaine parce que certaines souches sont capables de produire des entérotoxines (protéines globulaires de poids moléculaire 25000-28000 Dalton) dont l'ingestion provoque une intoxication (AFSSA, 2003). Cette bactérie peut provoquer la staphylococcitose rarement mortelle chez l'homme (DELARRAS, 2007).

Les intoxications à S.aureus (la plus fréquente) sont plus répandues que celles des Clostridium botulinum. L'entérotoxine est produite dans chacune des phases de croissance de la bactérie. Elle présente une grande thermorésistence malgré que S. aureus est détruite par un traitement de pasteurisation. Même les traitements Ultra Hight Temperature (U.H.T.) (143°C/10½) n'activent pas les toxines. Généralement, les symptômes indicateurs d'une intoxication par S. aureus sont les suivantes: Période d'incubation de quelques heures; les

entérotoxines agissent au niveau des nerfs du tube digestif qui stimulent le centre des vomissements; douleurs abdominales; diarrhées; crampes. On parle souvent de gastroentérites dues aux Staphylococcies. Dans certains cas graves, l'individu infecté peut manifester du sang dans les selles. Souvent, la maladie dure au maximum 2 jours et la récupération est complète sans cas graves de mortalité (AFSSA, 2006).

5.2- Bacillus cereus

5.2.1- Caractères bactériologiques

Les Bacillus sont des bacilles Gram+, à spore terminale, subterminale ou centrale. Ils sont aéro-anaérobies facultatifs ou parfois aérobies stricts (LARPENT, 1997).

Les souches de Bacillus cereus sont constituées de bacilles, aux extrémités arrondies, généralement mobiles grâce à une ciliature péritriche, d'une longueur supérieure à 3 um et d'un diamètre moyen de 1,4 um, souvent groupés en chaînes (EUZEBY, 2008).

Appartient à la famille de Bacillaceae, bacilles formant des spores ovoïdes thermorésistantes (résistant à 100 °C et donc à la pasteurisation), de 1 à 1.2 um de large sur 3 à 7 um de long, catalase+. C'est une bactérie anaérobie facultative. B. cereus est un fort producteur d'enzymes, il possède une phospholipase très active. Il peut réduire le nitrate en nitrite. Il peut métaboliser l'arabinose et le mannitol (PEIFFER, 2000).

Aucune croissance n'est obtenue à pH 4,5 et pour des températures de 50 °C ou de 60 °C. Les colonies ont un diamètre compris entre 2 et 7 mm, elles sont soit circulaires soit de forme irrégulière avec des bords ondulés, crénelés ou filamenteux, leur aspect est crémeux et lisse ou mat ou granuleux (EUZEBY, 2008).

5.2.2- Habitat et pouvoir pathogène

B. cereus est un germe ubiquiste. Bactérie vivant dans les sols et dans les eaux, peut survivre dans l'environnement sous forme de spores. Elle peut contaminer surtout des aliments d'origine végétale (riz, épices) et de nombreux plats cuisinés. B. cereus se comporte comme un pathogène opportuniste et cette espèce est également responsable de toxi-infections alimentaires (PEIFFER, 2000). La présence de spores de B. cereus pose de sérieux problèmes dans les industries agroalimentaires (notamment les industries laitières). B. cereus est également un contaminant des drogues (héroïne) et de médicaments tels que les topiques qui peuvent alors contaminer des plaies (EUZEBY, 2008).

5.3- Pseudomonas aeruginosa

5.3.1- Caractères bactériologiques

Bâtonnets droits ou incurvés à Gram-, mobiles, les flagelles sont polaires, aérobies stricts.

En général catalase +, oxydase +, métabolisme respiratoire, mais jamais fermentaire, ne fixe pas _N2. La plupart des milieux peptonés conviennent pour la culture des Pseudomonas sp. Certaines espèces sont capables d'accumuler l'acide poly-â-hydroxybutyrique (PHB) comme matériel de réserve en fin de phase exponentielle de croissance. La température optimale de croissance se situe entre 4 °C et 42 °C (LARPENT, 1997).

Les souches de cette espèce sont constituées de bacilles de 0,5 à 0,8 um de diamètre sur 1,5 à 3,0 um de longueur, se présentant de manière isolée ou groupée par deux ou en courtes chaînes, mobiles grâce à une ciliature monotriche (quelques rares cellules portent cependant plusieurs flagelles polaires). P. aeruginosa ou bacille pyocyanique exprime un pigment vert nommé pyocyanine (EUZEBY, 2008).

5.3.2- Habitat et pouvoir pathogène

Selon PALLERONI (1984), P. aeruginosa est une espèce bactérienne ubiquitaire. Elle vit à l'état saprophyte dans l'eau et les sols humides (elle résiste mal à la dessiccation) ou à la surface des végétaux. Elle vit également à l'état commensal dans l'intestin de l'homme et des animaux (MERENS, 2008). Elle est caractéristique des milieux hospitaliers et colonise souvent le tube digestif humain.

P. aeruginosa constitue une cause majeure d'infections nosocomiales diverses chez des personnes fragilisées ou immunodéprimées comme les grands brûlés, les personnes âgées ou les nouveau-nés ainsi que les cancéreux (DELARRAS, 2007).

Le pathogène opportuniste qu'est P. aeruginosa peut engendrer des infections urinaires, oculaires ou pulmonaires et infecter des plaies profondes en entraînant un choc septique. En fait, P. aeruginosa représente l'une des trois plus grandes causes d'infections opportunistes chez l'homme (AVRIL, 2000).

5.4- Salmonella paratyphi A.

5.4.1- Caractères bactériologiques

Le genre Salmonella, qui appartient à la famille des Enterobacteriaceae, doit son nom au Dr. Vétérinaire Salmon, bactériologiste américain du IXX^e siècle (EUZEBY, 2008). Ce genre est caractérisé par des bacilles à coloration Gram -, non sporulants, la plupart du temps doués d'une mobilité propre grâce à des flagelles péritriches (à l'exception de Salmonella gallinarum). Elles sont catalase +, glucose +, oxydase -, H2S + et lactose +/-, mobiles et présentent une ciliature péritriche. La taille des bâtonnets varie entre 2 et 5 um de longueur sur 0,7 à 1,5 um de largeur (DELARRAS, 2007). Ils sont aéro-anaérobies, réduisant les nitrates en nitrites, peuvent utiliser le citrate comme seule source de carbone, fermentent le glucose, mais pas le lactose ni le sucrose. Salmonella est une bactérie mésophile: son optimum de croissance est proche de la T° corporelle des animaux à sang chaud (35-43 °C). La limite de croissance inférieure se situe aux environs de 5° C. Les salmonelles sont réputées être peu thermorésistantes puisqu'elles sont tuées rapidement lorsque la T° dépasse 70 °C (JOLY et REYNAUD, 2002).

5.4.2- Habitat et pouvoir pathogène

Les Salmonelles sont des bactéries de l'intestin. Chez de nombreux sujets, elles peuvent être présentes sans entraîner de symptômes (porteurs sains). Quelques sérovars sont spécifiquement humains: Typhi et Paratyphi. D'autres ne se rencontrent que chez l'animal

(AVRIL, 2005). Chez l'homme, elles colonisent la muqueuse intestinale et l'iléum. Le principal réservoir des salmonelles est le tractus gastro-intestinal des hommes et des animaux, en particulier les porcs et les volailles. Elles sont excrétées dans les déjections animales et se retrouvent ainsi libérées dans l'environnement. Les aliments représentent le principal vecteur des salmonelles à l'homme en particulier les viandes crues et les oeufs. Les symptômes apparaissent environ 24 - 48 h après digestion de l'aliment contaminé et se traduisent par des nausées, des vomissements, des maux de tête et des diarrhées (DELARRAS, 2007).

Les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes, maladies très sévères qui s'accompagnent dans 90% des cas d'une hospitalisation des patients, dues à des sérovars strictement humains: Salmonella typhi, S. paratyphi A. et, à un degré moindre, S. paratyphi B. La transmission est essentiellement interhumaine et se fait par l'eau et les aliments souillés. Les salmonelles hébergent fréquemment des plasmides porteurs de facteurs de résistance aux antibiotiques (JOLY et REYNAUD, 20021).

5.5- Escherichia coli5.5.1- Caractères bactériologiques

Escherichia coli est l'espèce type du genre Escherichia des entérobactéries. Appelée communément "colibacille" c.-à-d. "bacille à côlon", cette espèce qui a fait l'objet d'un très grand nombre d'études constitue le modèle des bacilles à Gram- aérobies. La plupart des E. coli se multiplient rapidement (18 à 24 h) sur les milieux habituels. Les colonies ont en moyenne 2 mm de diamètre, elles sont rondes, plastes et à bords réguliers (JOLY et REYNAUD, 2002).

5.5.2- Habitat et pouvoir pathogène

C'est l'une des espèces bactériennes les plus souvent rencontrées en pathologie humaine (BERCHE, 2003).

Cette bactérie est connue depuis longtemps comme commensale du tube digestif (présente à raison de 10⁷ à 10⁹ corps bactériens/g de selle des anaérobies) et pathogène pour l'appareil urinaire et qui se transmet par voie orofécale. Certaines souches d'E. coli sont capables de causer des dommages au niveau de la muqueuse digestive se traduisant par un syndrome infectieux (AVRIL, 2000).

Les aliments incriminés sont: l'eau (dans certains pays), les viandes et le lait cru. La durée d'incubation est de 3 à 9 jours pour provoquer des gastro-entérites peu graves, diarrhées abondantes et liquides (turista) (JOLY et REYNAUD, 2002).

L'espèce E. coli regroupe plusieurs sérotypes dont certains sont pathogènes pour l'homme et, qui sont répartis en six groupes: E.coli entérotoxigène (ETEC); E.coli entéro-invasif (EIEC); E. coli entéropathogène (EPEC); E. coli entéroagrégant (EaggEC); E. coli entéroadhérant diffus (DAEC); E. coli entérohémorragique (EHEC). Les sérotypes E. coli O157:H7, O111, O26, O103 sont caractérisés par leur potentiel à provoquer le syndrome hémolytique urémique chez les personnes par leur production de vérotoxines. Depuis la première toxi-infection alimentaire aux États-Unis en 1982, impliquant E.coli O157:H7, ce sérotype a été isolé dans d'autres évènements toxi-infectieux humains dans de nombreux pays

(Japon, Canada, Royaume-Uni, etc.). Les symptômes observés chez l'homme sont généralement des diarrhées précédées de violentes douleurs abdominales et suivies généralement de diarrhées sanglantes. Les aliments impliqués sont les viandes hachées crues ou peu cuites, les eaux de distribution et certains jus de fruits, les produits laitiers non pasteurisés et les végétaux crus. Les principaux réservoirs de ces sérotypes sont les tractus intestinaux des bovins et des ovins qui contaminent les sols et les eaux via leurs déjections. (DELARRAS, 2007).

5.6- Shigella flexneri5.6.1- Caractères bactériologiques

Selon BERCHE (2003), les shigelles sont découvertes il y a plus de 100 ans (1886) par Shiga (Japon). Ce sont des entérobactéries à tropisme exclusivement digestif, très proches d'E. coli. Le genre Shigella appartient à la famille des Enterobacteriaceae. Quatre (04) espèces sont recensées: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii et S. sonnei. Les Shigella sont des entérobactéries à Gram-, immobiles, qui provoquent des dysenteries bacillaires. Les plus rencontrées sont Shigella flexneri responsable des formes endémiques et S. sonnei (AVRIL, 2000).

5.6.2- Habitat et pouvoir pathogène

Ce sont des bactéries strictement humaines à transmission féco-orale (BRANGER, 2007). Agents d'une maladie diarrhéique aigue à transmission direct (mains sales, porteurs sains...) ou indirect (aliment ou eau de boisson contaminés par les matières fécales) (DELARRAS, 2007).

La Shigellose ou dysenterie bacillaire endémique en région tropicale. L'incubation est très courte: 24-48h après exposition et ingestion, elle cause une intense inflammation tissulaire et détruit la muqueuse avec ulcérations et hémorragies (BERCHE, 2003).

Les espèces les plus importantes sont Shigella flexneri, responsable des formes endémiques, et S. dysenteriae sérotype 1, responsable des épidémies brutales et graves dans les pays en voie de développement ; Shigella sonnei, moins virulente, est prévalente dans les pays développés (DELARRAS, 2007).

ETUDE

EXPERIMENTALE

Matériel

&

Méthodes

Ce travail de recherche (rentrant dans le cadre d'un projet de collaboration entre l'Espagne et l'Algérie dont le chef du projet est Mr. Djenane Djamel de l'Université de Tizi Ouzou) a été réalisé pendant une période de sept (07) mois. Il est subdivisé en trois (03) parties principales : extraction des H.E. par hydrodistillation (à l'échelle de laboratoire et à l'échelle semi-industrielle); évaluation de leur activité antibactérienne in vitro (aromatogramme, CMI...) et enfin application pratique sur des viandes hachées inoculées avec des bactéries pathogènes.

Ce travail a été mené grâce à la contribution des laboratoires suivants:

- Laboratoire commun N° 2 de la Faculté des Sciences Biologiques et des Sciences Agronomiques - Université Mouloud Mammeri, Tizi Ouzou;

- Laboratoire de Physiologie Végétale du Département de Physiologie Animale et Végétale. Faculté des Sciences Biologiques et des Sciences Agronomiques - Université Mouloud Mammeri, Tizi Ouzou ;

- Groupe Pharmaceutique SAIDAL Filiale BIOTIC Usine EL Harrach, ALGER; -

- Laboratoire Vétérinaire Régional de Drâa Ben Khedda-Service Microbiologie

Alimentaire, Tizi Ouzou.
1- Matériels et Méthodes

1.1- Matériel végétal

Un certain nombre de critères ont été pris en compte pour sélectionner les plantes utilisées dans cette étude:

- des ressources naturelles à exploiter;

- utilisation des plantes en médecine traditionnelle;

- les apports de la littérature et des publications scientifiques.

Les critères que nous venons d'évoquer ayant permis d'établir une liste préliminaire de plantes potentiellement intéressantes pour une éventuelle étude sur l'activité antibactérienne. En plus de notre travaille qui a porté sur le Myrte, Eucalyptus, Sarriette et Clous de girofle, un autre binôme d'Ingénieur a travaillé sur d'autres espèces végétales (Thymus vulgaris, Thymus satureiodes, Mentha peripita et Mentha spicata), deux (02) autres étudiants en Magisters travaillent actuellement sur d'autres espèces sélectionnées (lavande, lentisque, citron...).

Des parties aériennes (feuilles fraîches) de myrte et d'eucalyptus ont été collectées dans les régions de Bouzeguène et de Fréha (800 et 383 m d'altitude respectivement du niveau de la mer méditerranée, Wilaya de Tizi Ouzou) pendant la période de Juin-Juillet 2008. Après récolte, ces deux espèces végétales ont été transportées vers les laboratoires de Département de Biologie, Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou. Elles ont été authentifiées par des enseignants du même Département. Les feuilles fraîches appartenant à ces deux espèces ont été intensément nettoyées avec de l'eau distillée à 20 °C, égouttées à l'aide d'un tamis puis séchées à l'air libre et conservées pendant toute la nuit à une température ambiante de (? 30 °C). La troisième plante utilisée dans ce travail a été directement approvisionnée chez un

herboriste de la ville de Tizi Ouzou. Il s'agit d'une épice dénommée clous de girofle originaire des îles volcaniques de l'archipel des Moluques en Indonésie (importée de Madagascar).

Tableau III : Présentation des plantes employées pour l'extraction des H.E.

NOM BOTANIQUE	NOM COMMUN	FAMILLE
Eugenia caryophyllus Myrtus communis Eucalyptus sp. Satureja hortensis	Girofle clous Myrte commun Eucalyptus Sarriette des jardins	Myrtacées Myrtacées Myrtacées Labiées

1.2- Milieux de culture

Suivant les méthodes employées et selon les souches, nous avons principalement utilisé comme milieux de culture:

- La Gélose Nutritive (Himedia Laboratories Pvt. Ltd. Mumbai India), gélose Mueller Hinton Agar (Himedia Laboratories Pvt. Ltd. Mumbai India), gélose Hektoen (Himedia Laboratories Pvt. Ltd Mumbai India), gélose lactosée au bromocrésol pourpre (BCP) (Biomérieux^® SA- France), gélose Chapman (Biomérieux^® SA- France) et Salmonella- Shigella Agar (Himedia Laboratories Pvt. Ltd. Mumbai India) et Milieu Brain Heart Infusion (BHIB) (Biomérieux^® SA- France).

La composition chimique de chaque milieu est décrite dans l'annexe 1.

2- Extraction des huiles essentielles 2.1- Clous de girofle

L'extraction de l'H.E. de cette plante a été réalisée par un hydrodistillateur (cf. figure 16) que nous avons monté avec l'aide précieuse de Mr ASLA Tarik (Maître assistant chargé de cours à l'Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou) au laboratoire de Physiologie Végétale (Département de Biologie et Physiologie Végétale de l'Université de Tizi Ouzou).

L'hydrodistillation consiste à mettre la plante dans l'eau et à faire bouillir le mélange. Sep cent millilitres (700 mL) d'eau distillée sont versés dans un ballon en verre d'un (01) litre puis l'eau est laissée bouillir sur un chauffe ballon. Trente grammes (30 g) de graines sèches de clous de girofle ont été pesés avec une balance de précision, puis broyés finement avec le pilon et le mortier. Le broyat obtenu est directement versé à l'aide d'un entonnoir dans les 700 mL d'eau bouillante. Le mortier et le pilon ont été soigneusement rincés avec de l'eau distillée pour bien récupérer le reste de broyat, ensuite cette eau de rinçage est directement versée dans le ballon. Quelques billes de verre ou quelques grains de pierre ponce ont été rajoutés dans le ballon dans le but de réguler la température du système. Un courant d'eau de

robinet traverse le tube réfrigérant de l'appareil. La vapeur d'eau entraîne avec elle l'huile, passe dans le tube réfrigérant où l'ensemble se condense. À la sortie du réfrigérant, le liquide de condensation est récupéré dans un flacon en verre. Le distillat obtenu est formé d'eau dans laquelle sont dissoutes très peu d'espèces odorantes; et de l'H.E. qui est constituée d'espèces odorantes. L'opération de distillation dure environ 3 heures. Les deux phases doivent faire l'objet d'une séparation.

Fig. 16: Montage de l'hydrodistillateur réalisé au département de Biologie et Physiologie
Végétale à l'UMMTO.

La séparation des deux phases a été réalisée par deux méthodes différentes:

A. Séparation directe

Cette méthode et très simple, elle consiste à laisser décanter le distillat pendant 24 h ce qui provoque le dépôt de l'H.E. de girofle sous l'effet de différence des densités. L'H.E. ainsi séparée de la phase aqueuse est récupérée par aspiration à l'aide d'une seringue stérile.

B. Séparation indirecte (extraction par solvant)

- Relargage

Il consiste à stimuler la séparation de l'huile de l'eau. Vingt grammes (20 g) de chlorure de sodium (NaCl) anhydre ont été pesés à l'aide d'une balance de précision, puis mélangés avec le distillat obtenu par hydrodistillation. Le mélange est placé dans un erlenmeyer. Un agitateur électrique a été utilisé pour bien homogénéiser ce mélange (cf. figure 17). Le contenu est ensuite mis dans une ampoule à décanter. Afin d'améliorer le rendement de l'extraction, une

seconde extraction a été réalisée, cette fois-ci par un solvant (éther). Le distillat a été transvasé dans une ampoule à décanter et y ajouter 20 mL d'éther diéthylique. L'ampoule à décanter a été hermétiquement fermée puis, le contenu est agité pendant 3 mn en dégazant de temps en temps (cf. figure 18 a et b). L'ampoule est ensuite déposée sur un support pendant quelques minutes pour laisser décanter le contenu. Après décantation, deux phases apparaissent dans l'ampoule (cf. figure 18 c). Celles-ci sont recueillies séparément dans des flacons différents (cf. figure 18 d). Le séchage de la phase organique a été effectué à l'aide d'un évaporateur rotatoire. Cette opération aboutit à l'élimination de l'éther de l'H.E.

Fig. 17: Distillat : [eau salée (NaCl)] + H.E. du giroflier.

Fig. 18 : Étapes de séparation des phases du distillat. (a) et (b) : agitation et dégazage du contenu de l'ampoule ;

(c) : séparation des deux phases [x = la phase organique (H .E. + éther) ; y = la phase aqueuse (eau distillée + traces d'huile)];

(d) : récupération de la phase organique (H.E.) dans un flacon et élimination de la phase aqueuse (H2O).

2.2- Myrte et Eucalyptus

En raison du faible rendement en H.E. de myrte et d'eucalyptus lorsque l'hydrodistillation a été pratiquée par l'appareil que nous avons, nous même monté au Laboratoire de Biochimie et Microbiologie (Université Mouloud Mammeri Tizi Ouzou) - le même utilisé pour extraire l'H.E. des C.G., l'extraction des H.E. de ces deux plantes a été enfin réalisée par un hydrodistillateur semi-pilote [référence N° 229 (2000) P.P. 18. 23 (E.H.BEN Youcef et COLC) Rivista : Italiana. EPPOSN° 30 (2001) PP 15-19 (E.H.B.E)] (cf. figure 19) au niveau du complexe pharmaceutique SAIDAL Filiale BIOTIC (Usine El Harrach, Alger) à partir des feuilles fraîches ( 20 Kg / plante). Les 40 Kg du matériel végétal ont été conditionnés dans des sacs en plastique de contenances différentes qui ont été bien nettoyés avec de l'eau distillée avant remplissage puis séchés à l'air libre. Les sacs qui contiennent les matériaux végétaux étaient transportés de Tizi Ouzou vers El Harrache (Alger) dans les conditions suivantes: voiture particulière climatisée; T° de transport ? 22°C. Les extractions des H.E. ont été réalisées approximativement une (01) semaine après réception des espèces végétales par SAIDAL. Pendant la période séparant la réception-extraction, les végétaux ont été conservés dans leurs emballages originaux dans des conditions idéales de T°, d'humidité relative et d'aération.

Fig. 19: Montage de l'hydrodistillateur semi-pilote du Groupe SAIDAL.

Concernant la 4^ème espèce végétale, nous avons directement opté par l'utilisation d'une H.E. 100% pure et naturelle de la Sarriette en flacon de 5 mL (Florame- St Rémy de Provence- France) qui nous a été aimablement fournie par Dr Djenane Djamel. Cette H.E. a été obtenue en France à partir d'un matériel végétal biologique (certifié par Ecocert SAS F32600) originaire de l'Afrique du Nord.

2.3- Calcul du rendement en huile essentielle

Le rendement en H.E. est le rapport entre le poids de l'huile extraite et le poids du matériel végétal utilisé (AKROUTE, 2001). Le rendement est exprimé en pourcentage (%) est calculé par la formule suivante:

R = (Ph / P_v) ?100
ou
R = [?Ph / ?P_v] x 100

R: rendement de l'huile en %; Ph: poids de l'huile en g;

P_v: poids du matériel végétal en g.

2.4- Conservation des huiles essentielles

Les H.E. extraites ou bien approvisionnées de l'extérieur sont placées dans des tubes à essai et conservées à des T° de réfrigération ( 4 °C), à l'abri de la lumière et de l'oxygène au niveau de Laboratoire Vétérinaire de Draa Ben Khedda (Tizi Ouzou).

3- Tests d'activité antimicrobienne des H.E.

3.1- Critères de sélection des souches

Le choix des souches est basé sur plusieurs paramètres:

- Les souches sont d'origine hospitalière, responsables de Toxi-infections Alimentaires (TIA) (S. aureus, S. paratyphi A.);

- pour leurs fréquences élevées à contaminer les denrées alimentaires et particulièrement la viande et produits carnés;

- les souches sont choisies pour leur résistance naturelle à divers types d'agents antimicrobiens. (S. aureus est souvent retenu comme bactérie-test dans les normes d'évaluation de l'activité des antiseptiques et désinfectants (AFSSA, 2003).

3.2- Souches bactériennes

Six souches bactériennes ont été utilisées dans notre travail. Des bactéries Gram-positif (G+): S. aureus et B. cereus, et des bactéries Gram-négatif (G-): S. paratyphi A., S. flexneri, E. coli et P. aeruginosa. Cinq (05) de ces souches bactériennes ont été isolées cliniquement à l'Hôpital Universitaire de Tizi Ouzou tandis que la souche P. aeruginosa a été isolée directement à partir de la viande et produit carnés au niveau du Laboratoire Vétérinaire Régional de Draa Ben Khedda (Tizi Ouzou).

Les souches qui ont été testées, nous ont été en partie, aimablement fournies par Dr HOUALI Karim, Maître de conférences (Département de Biochimie Microbiologie, Faculté des Sciences Biologiques et des Sciences Agronomiques, Université Mouloud Mammeri Tizi Ouzou). Les souches ont été reçues dans des tubes à gélose inclinée, conservés à une T° de réfrigération (2#177;1 °C). La souche de P. aeruginosa nous a été également, aimablement fournie par ^Melle MALKI Ouiza du Laboratoire Vétérinaire Régional de Drâa Ben Khedda (Tizi Ouzou).

3.3- Confirmation des souches

Pour chacune des souches un pré-enrichissement a été effectué sur le milieu d'isolement sélectif (cf. figure 20) puis une coloration de Gram a été réalisée selon le modèle suivant :

- Préparer un frotti ;

- recouvrir le frotti avec de violet de Gentiane ; laisser agir 1mn ; rincer à l'eau distillée ;

- verser du Lugol et le laisser agir pendant 1 mn ;

- décolorer à l'alcool à 95°, entre 15 et 30 secondes ; rincer à l'eau distillée ;

- fixation avec de la fuchsine pendant 10 à 30 secondes ; rincer à l'eau distillée ; - sécher au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen ;

- observation au microscope optique à l'objectif x 100 à immersion, les Gram+ se colorent en violet tandis que les Gram- apparaissent colorés en rose.

Tableau IV : Coloration de Gram et morphologie des souches bactériennes utilisées.

Souches	Milieu de culture	Gram	Morphologie microscopique
S. aureus	Gélose Chapman	+	Coccobacilles en grappes de raisin
B. cereus	Gélose lactosée au bromocrésol pourpre (BCP)	+	Bacilles
S. paratyphi A	Gélose Hektoen	_	Coccobacilles
S. flexneri	Shigelles Salmonelles (SS)	_	Coccobacilles
E. coli	Gélose Hektoen	_	Bacilles

Fig. 20: Aspect des souches bactériennes repiquées sur milieux spécifiques. - Confirmation des souches de S. aureus

Test catalase

Ensemencer des boîtes de gélose Chapman par l'inoculum. Incuber entre 33 et 37 °C pendant 24 à 48 h. Les colonies jaunes entourées d'une zone jaune, sont des Staphylocoques.

Colonies jaunes + H2O2 Effervescence (Catalase +)

H2O2 CATALASE H2O + 1/2 O2

L'effervescence se traduit par un dégagement gazeux, ce qui signifie que cette souche est à catalase +.

Le deuxième test qui confirme la souche de S. aureus fait appel au test coagulase libre. Test coagulase libre (ou épreuve de la coagulase)

Parmi les cocci à Gram+ et catalase+, les souches de S. aureus provoquent la coagulation du plasma oxalaté de lapin en 24 h, les autres espèces et sous-espèces de staphylocoques d'origine humaine ne possèdent pas la coagulase libre sauf S. schleiferi subsp. coagulans (DELARRAS, 2007).

Mélanger dans un tube à hémolyse stérile 0,1 mL de plasma de lapin et 0,3 mL de la culture en bouillon de la souche. Incuber le mélange incliné à l'étuve 37 °C. Les lectures se font après 6 h, 8 h et 24 h d'incubation.

Il a été remarqué qu'après 6 h d'incubation, le plasma a été entièrement coagulé avec prise de masse. Selon les résultats obtenus (coloration de Gram, tests de catalase et coagulase), la souche de Staphylococcus était bel et bien S. aureus.

La confirmation du reste des souches bactériennes n'a pas été effectuée car on ne dispose pas de réactifs nécessaires pour réaliser la galerie biochimique.

3.4- Préparation des précultures

Ces souches ont été identifiées aux laboratoires et, utilisées comme souches de références pour des études préliminaires de sensibilité vis-à-vis des différentes H.E. Les différentes souches bactériennes ont été repiquées dans des tubes de gélose de conservation (en piqûre centrale) puis incubées à 37#177;1 °C. Après 24 h d'incubation, ces tubes sont conservés à la T° de réfrigération (2#177;1 °C). Dans le but de garder toujours la disponibilité en souches, chaque 15 jours, des opérations de repiquage sont réalisées.

Avant la réalisation des tests antibactériens, deux repiquages consécutifs sont effectués pour chaque souche (cf. figure 21): en premier lieu, elles ont été inoculées dans de BHIB liquide et incubées pendant 24 h à 37#177;1 °C. Le deuxième repiquage est effectué sur milieu solide (gélose nutritive) la veille de la réalisation du test antibactérien. L'ensemble a été incubé à 37#177;1 °C pendant 18 h pour avoir des cellules bactériennes à leur phase exponentielle de croissance. À partir de cette culture bactérienne fraîche, on prélève quelques colonies que l'on mélange avec de l'eau physiologique stérile. Pour la standardisation de la charge de l'inoculum de départ, la méthode de comparaison de la densité bactérienne à celle d'un tube de référence (0,5) Mc Farland dont la charge est supposée être 10⁵ ufc/mL a été employée.

Fig. 21: Préparation de l'inoculum.

3.5- Tests antimicrobiens 'in vitro'

Trois méthodes ont été retenues pour tester l'effet antimicrobien des H.E.: - Méthode de diffusion sur disques (aromatogrammes) ;

- méthode de diffusion en puits ;

- méthode de microatmosphère.

Il est à noter que ces tests sont réalisés en duplicata.

3.5.1- Méthode de diffusion sur disques (aromatogrammes)

Cet examen se fait de la même manière qu'un antibiogramme où les antibiotiques sont remplacés par des essences aromatiques, préalablement sélectionnées et reconnues.

L'aromatogramme ou méthode par diffusion en milieu gélosé ou encore méthode de disques est une technique qualitative permettant de déterminer la sensibilité des microorganismes vis-à-vis d'une substance réputée antimicrobienne. Cette méthode repose sur le pouvoir migratoire des H.E. à l'intérieur d'une boîte de Pétri, dans un milieu nutritif solide (Mueller Hinton).

Le protocole de base des aromatogrammes qu'on a adopté est celui qui a été proposé par le laboratoire de microbiologie de l'École Polytechnique Fédérale de LAUSANNE (Faculté Environnement Naturel, Architectural et Construit Institut des infrastructures, des ressources et de l'environnement, Section D'architecture, Suisse) auquel quelques modifications ont été apportées.

L'ensemencement de l'inoculum de 1 mL est réalisé en surface du milieu Mueller Hinton préalablement coulé dans des boîtes de Pétri. Après 1/4 d'h, le surplus est éliminé dans la hotte à flux laminaire jusqu'à ce que la gélose soit sèche. Des disques stériles (6 mm de ?; papier Wattman N°1) imprégnés d'une quantité d'H.E. à l'état pur (5 ul) sont déposés au centre des boîtes. Celles-ci sont ensuite fermées et laissées diffuser pendant 20 mn puis incubées à 37 °C pendant 24 h. Après incubation, l'absence de croissance bactérienne exprimant une activité antimicrobienne se traduit par un halo translucide autour du disque, de même couleur que la gélose stérile et dont le diamètre est mesuré à l'aide d'un pied à coulisse (exprimé en mm). Il est important de noter que la quantité d'H.E. déposée sur le disque varie selon les auteurs, excluant toute comparaison des valeurs des diamètres mesurés (PIBIRI, 2006).

La sensibilité des différentes souches vis-à-vis des H.E. étudiées est classée selon le diamètre d'inhibition selon les critères suivants: non sensible (-) pour ?<8 mm; sensible (+) pour j compris 9-14 mm; très sensible (++) pour ?15-19 mm et extrêmement sensible (+++) pour ?>20 mm (PONCE et al., 2003). Des témoins négatifs utilisant uniquement des disques placés sur gélose inoculée sans l'H.E.

Des disques d'antibiotiques Kanamycine, Pénicilline et Ticarcilline de références médicales (GROUPE Glaxo Smith Kline Algérie) ont été utilisés pour le contrôle de l'activité des souches tests. Ce produit nous a servi de standard de référence (témoins positifs) pour l'évaluation de la sensibilité des microorganismes testés dans ce travail et de s'assurer de l'état et de la conservation. Chaque essai expérimental a été réalisé en duplicata.

3.5.2- Microatmosphère (ou méthode en phase vapeur)

La technique consiste à déposer des disques stériles (6mm de ?; papier Wattman N°1) imbibés d'une quantité déterminée (5 ul) d'H.E. au milieu des couvercles des boîtes de Pétri et non en contact direct avec la gélose ensemencée. Les boîtes sont fermées avec leurs

couvercles en bas puis, incubées à 37 °C pendant 24 h. Après incubation, l'absence de la croissance bactérienne se traduit par une zone translucide sur la gélose de contour plus ou moins nette, à tendance circulaire lorsque le disque est bien centré. Les résultats se lisent avec un pied à coulisse et s'expriment par un diamètre en mm (cf. figure 14)

Les boîtes contrôles sont des boîtes de Pétri ensemencées selon les conditions expérimentales.

3.5.3- Technique de diffusion en puits

L'activité antibactérienne des différentes huiles diluées à 50 % a été étudiée pour chaque souche bactérienne. À partir d'une culture de 18 à 20 h (10⁵-10⁶ UFC/mL). L'ensemencement de l'inoculum de 1 mL est réalisé en surface du milieu Mueller Hinton préalablement coulé dans des boîtes de Pétri. Après 15 mn, des puits ont été découpés à l'aide de pipettes Pasteur (l'extrémité épaisse de 6 mm de ?). Le fond des puits est obturé par une goutte de gélose Mueller Hinton pour limiter la diffusion des huiles sous la gélose. Ensuite, 50 ul de l'huile diluée est distribuée dans chaque puits. Après diffusion (? 20 mn), les cultures sont incubées dans des étuves à la température de 37 °C pendant 24 h, et les auréoles d'inhibition sont mesurées par un pied à coulisse. Le diamètre du puits (8 mm) est inclus dans les tableaux des résultats.

3.5.4- Nature de l'activité antibactérienne (bactériostatique ou bactéricide)

des huiles essentielles

La nature de l'activité de chacune des H.E. testées a été déterminée par la méthode de PIBIRI (2006). À partir des aromatogrammes de 48 h, les zones translucides entourant les disques ont été repiquées à l'aide d'une anse stérile dans des tubes à essai contenant le milieu B.H.I.B. Les tubes sont ensuite incubés à 37#177;1 °C pendant 24 h (cf. figure 22).

Un deuxième repiquage à l'aide d'une anse stérile est effectué sur milieu Gélose Nutritive (en stries) à partir des tubes à B.H.I.B. après 24 h d'incubation.

Au bout de 24 h d'incubation à 37#177;1 °C, l'absence ou présence de colonies est observée. L'absence de développement bactérien indique un effet bactéricide de l'H.E. en question, tandis que la présence de colonies bactériennes nous renseigne sur un effet bactériostatique.

Fig. 22: Détermination de la nature de l'activité antimicrobienne des H.E.

3.5.5- Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) par méthode de dilutions en milieu solide

Même si les H.E. sont considérées comme des additifs salubres (LAMBERT et al., 2001), leur utilisation est souvent limitée par les critères organoleptiques de l'aliment. Pour cette raison, il sera nécessaire de déterminer la CMI (c'est à dire la plus faible concentration en huile capable d'inhiber toute croissance bactérienne sans affecter la qualité sensorielle de l'aliment), car selon l'effet recherché et les bactéries ciblées, la concentration ne sera pas la même (CAILLET et LACROIX, 2007).

Le protocole de base utilisé dans notre expérimentation est celui rapporté par BILLERBECK (2003). Les modifications suivantes ont été apportées selon les conditions expérimentales:

- L'intervalle des concentrations en H.E. choisi comporte 10 dilutions citées ci-dessus; - la gélose Trypcase-soja est remplacé par la gélose Mueller Hinton;

- l'inoculation en surface de la gélose Mueller Hinton est réalisée par 2 ul au lieu de 1ul pour bien visualiser le développement microbien;

- pour ce qui est de la nature de l'activité antibactérienne, la méthode citée précédemment a été choisie.

La CMI est déterminée pour les huiles présentant une activité antibactérienne intense sur les souches bactériennes les plus sensibles. Le tableau suivant regroupe les bactéries sélectionnées pour le calcul des CMI pour chaque H.E. Uniquement les souches présentant une sensibilité accrue sont retenues pour le calcul de la CMI (+++).

Tableau V : Répertoire des résultats obtenus par la méthode des aromatogrammes.

Souche H.E.	S. aureus	E. coli	S. flexneri	S.paratyphi A	B. cereus
Sarriette	++	+++	+++	+++	++
CG	+++	+++	++	+++	++
Eucalyptus	+++	+++	+++	-	-

+++ : très sensible ; ++ : sensible ;

- : résistante.

Du fait de la non miscibilité des H.E. à l'eau et donc au milieu de culture, la mise en émulsion a été réalisée grâce à une solution d'agar à 0,2 % afin de favoriser le contact germe/composé. Chaque type d'huile est dilué avec l'eau distillée stérile afin d'obtenir les dilutions suivantes : 1/2 ; 1/4 (0,25) ; 1/5 (0,2) ; 1/10 (0,1) ; 1/20 (0,05) ; 1/40 (0,025) ; 1/50 (0,02) ; 1/60 (0,0166) ; 1/80 (0,0125) ; 1/100 (0,01).

Tableau VI : Valeurs des dilutions (ul d'HE/mL d'eau).

Rapport (HE/eau)	1/2	1/4	1/5	1/10	1/20	1/40	1/50	1/60	1/80	1/100
ul / mL (HE/ eau)	1000	333,3	250	111,1	62,5	25,64	20,4	16,94	12,66	10,1

Pour pouvoir comparer les CMI de différents micro-organismes, il est indispensable de travailler sur des cellules à des stades de croissance (de 18 à 20 h d'incubation) et à des concentrations similaires. Pour cela, les mesures de CMI doivent être réalisées sur des biomasses microbiennes fraîches (en phase exponentielle de croissance).

Les boîtes de Pétri sont remplies à moitié par le milieu Mueller Hinton et laissées solidifier sous la hôte à flux laminaire. Différentes concentrations d'H.E. (cf. tableau VI) sont incorporées en masse dans le milieu de culture en surfusion : 45 °C (Mueller Hinton Agar) avec les proportions suivantes : 1 mL de l'H.E. diluée et 3 mL du milieu en surfusion, puis on agite convenablement les tubes à l'aide d'un vortex avant de les verser sur la première couche. Après solidification, l'inoculation bactérienne des géloses est effectuée en surface à l'aide d'une micropipette automatique, sous forme de dépôts de 1 ul à partir de suspensions bactériennes de 10⁵ ufc/mL. L'ensemble est incubé à une T° de 37#177;1 °C pendant 24 h. La CMI est définie comme étant la plus faible concentration en H.E. où on n'observe aucune croissance bactérienne.

3.5.6 - Combinaison entre les huiles essentielles

Dans le but de mise en valeur d'un éventuel effet synergique entre les H.E., différents rapports d'H.E. sont effectués à savoir : [HE1/HE2] = 1/1; 1/2; 1/3. Puis les rapports sont inversés [HE2/HE1] = 1/1; 1/2; 1/3. Des aromatogrammes ont été réalisés en imprégnant des disques des mélanges d'H.E. précédemment préparés que l'on dépose au centre des boîtes du milieu Mueller Hinton préalablement inoculé avec la bactérie test et on les laisse diffuser pendant environ 20 mn. Après 24 h d'incubation à une T° de 37#177;1 °C, on mesure les auréoles d'inhibition à l'aide d'un pied à coulisses et on les compare à celles obtenus avec les H.E. testées toutes seules.

3.6- Activité antimicrobienne des H.E. en présence des pathogènes inoculées dans la viande hachée bovine

Dessin Expérimental

3.6.1- Préparation de la viande

Des muscles (Longissimus dorsi) ont été obtenus directement à partir d'une carcasse bovine 04 jours post-mortem (Boucherie et Volaille Khatir, coopérative immobilière des frères Haddad, Draa Ben Khedda, Tizi-Ouzou). La viande a été transportée dans une enceinte réfrigérante (Mobicool, UK) à 2#177;1°C, puis acheminée vers le Laboratoire Régional Vétérinaire de Draa Ben Khedda pendant les 30 mn qui suivent son achat.

Une fois au Laboratoire, les muscles sont aseptiquement débarrassés de leurs couches périphériques, constituées par du tissu conjonctif et de matière grasse. Plusieurs morceaux de viande ( 8 kg) ont été découpés à l'aide d'un couteau Inox stérile, puis placés dans un hachoir stérile (ENIEM, Algérie) pour être transformés en viandes hachées.

3.6.2- Optimisation de la CMI appliquée à la viande par des tests sensoriels

Il a été bien établi que les doses effectives d'H.E. approuvées dans des tests antibactériens "in vitro", ne pourraient être les mêmes quand il s'agit d'une matrice alimentaire. BURT (2004) a suggéré que les CMI devraient être multipliées par un coefficient qui peut osciller entre 2 et 100, si on veut les appliquer dans un aliment pour obtenir des résultats satisfaisants.

Selon les résultats des CMI des différentes huiles que nous avons obtenu, nous avons jugé utile de multiplier ces valeurs par un coefficient de 2, du moment que nous considérons que les valeurs obtenus sont relativement supérieures: les valeurs des CMI correspondant aux H.E. des clous de girofle, de sarriette ainsi que d'eucalyptus après multiplication fois le facteur 2 sont respectivement : 110 ul / mL ; 10,1 ul / mL ; et 20,4 ul / mL d'eau distillée.

La CMI relative au Myrte n'a pas été déterminée car les études préliminaires "in vitro" ont montré que les souches bactériennes testées n'ont présenté qu'une relative faible sensibilité à l'H.E. extraite de cette plante.

Afin d'établir un protocole pour tester l'efficacité des H.E. sur la conservation de la viande ; il convient d'abord de déterminer le plus faible volume en H.E. qui n'altère pas les qualités organoleptiques de cette dernière, à savoir le goût et l'odeur. C'est pourquoi on a procédé pour un test préalable de dégustation durant lequel on a rajouté des volumes différents à 100 g de viande hachée et faire une approche sensorielle.

Pour les tests sensoriels préalables, quatre (04) échantillons de 100 g chacun ont été préparés pour être inoculés avec des volumes de 10-30-40 et 50 tl de chacune des H.E. testées dans cette étude et qui ont révélé dans des tests "in vitro" une activité antimicrobienne considérable, en l'occurrence les Clous de girofle, Sarriette et Eucalyptus.

Les échantillons de viande hachée contenant les différents volumes en H.E. correspondantes ont été mélangés manuellement en utilisant des gants latex. Les différents échantillons ont été cuits dans un four à gaz butane (ENIEM, Algérie) puis servis aux dégustateurs dans des petits plats en plastiques jetables. Le panel des dégustateurs est constitué par cinq (05) personnes âgées entre 23 et 25 ans (4 filles et 1 garçon), l'ensemble des dégustateurs sont des étudiants (es) de l'Université de Tizi-Ouzou. Les tests de dégustation ont été réalisés dans les conditions du laboratoire (température ambiante, lumière de jour...) de Microbiologie de Centre Vétérinaire Régional de Draa Ben Khedda selon la méthode décrite par DJENANE et al. (2001). Les cinq dégustateurs ont été entraînés au départ par des tests préalables. Plusieurs sessions dirigées par Dr Djenane ont été organisées afin de permettre aux étudiants de se familiariser avec les attributs mesurés selon les échelles choisies.

Les attributs sensoriels déterminés sont le goût et l'odeur. Le critère d'odeur a été structuré sur une échelle de 6 valeurs: 1=odeur très forte; 2=odeur forte; 3=odeur moyenne; 4= odeur ni faible ni forte; 5=odeur faible; 6=odeur inaperçue. Par contre le critère goût a été structuré sur une échelle de 9 valeurs: 1=extrêmement mauvais; 2=très mauvais; 3=mauvais; 4=moyennement mauvais; 5=ni bon, ni mauvais; 6=moyennement bon; 7=bon; 8=très bon ; 9=extrêmement bon.

À travers ces tests, il conviendra d'abord de déterminer le plus faible volume d'H.E. qui n'altère pas les qualités organoleptiques du produit, à savoir le goût et l'odeur. C'est pourquoi des tests préalables de dégustation dans ce genre de travail sont indispensables.

3.6.3- Préparation des échantillons

Pour chaque combinaison de paramètres étudiés (H.E. + bactérie pathogène), 200 grammes (g) de viande hachée ont été préparés dans un récipient Inox stérile et ensuite mélangés avec de l'H.E. donnée. Ensuite, la viande contenant de l'H.E. a été inoculée par la bactérie pathogène correspondante (? 5 log ufc/g). L'ensemble a été homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur pour bien répartir la distribution de l'huile et de la bactérie à travers la viande. Au total trois (03) échantillons de 50 g chacun ont été préparés pour chaque combinaison (cf. figure 24). Les échantillons sont ensuite placés dans des boîtes de conserve Inox stériles de 6 cm de ? (03 boîtes/germe/H.E.) et conservés à une T° de réfrigération: 2#177;1 °C.

Les échantillons témoins (contrôles) ont été traités avec de l'eau distillée stérile en présence de la souche pathogène et, conservés dans les mêmes conditions (cf. figure 23 étape II).

- Dessin expérimental du test sur la viande fraîche

Étape I :

Viande + HE + Bactéries

Syzygium
aromaticum

E. coli

Eucalyptus
sp.

Satureja
hortensis

E. coli

S. paratyphi A. S. aureus

S. paratyphi A

S. aureus Shigella flexneri

3 échantillons pour chaque espèce bactérienne

Étape II :

Viande + Bactéries

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Salmonella paratyphi A

Shigella flexneri

3 échantillons 3 échantillons 3 échantillons 3 échantillons

Fig. 23: Schéma du test de l'activité antibactérienne des H.E. sur une viande contaminée
par les souches pathogènes.

Fig. 24: Test de l'effet des H.E. sur la conservation de la viande hachée. 3.6.4- Analyses Microbiologiques

Pour déterminer l'efficacité inhibitrice des H.E. sur les bactéries pathogènes présentes dans la viande, des analyses microbiologiques sont effectuées pour suivre la cinétique microbienne de chaque espèce en présence et en absence d'H.E. Toutes les analyses ont été réalisées en duplicata.

La cinétique microbienne de chaque espèce a été mesurée au 1^er , 4^ème et 7^ème jour pendant une durée globale de conservation de sept (07) jours. Les échantillons ont été conservés à 2#177;1 °C à l'air libre. Pour chaque prélèvement, 25 g de viande de chaque échantillon étudié sont placés puis dilués dans 225 mL d'eau peptonée (0.1%). Chaque échantillon est homogénéisé à l'aide d'un stomacher Lab Blender (model BA 6021; Seward Laboratory, London, UK) pendant 1 minute. Des dilutions décimales sont préparées par dilution de 1 mL dans 9 mL d'eau peptonée stérile (0.1%). Deux boîtes de pétri sont ensemencées pour chaque dilution en

versant 1 mL de chaque suspension dans de la gélose en surfusion, chaque germe a été ensemencé sur son milieu sélectif:

Le dénombrement de S. paratyphi A et d'E. coli a été déterminés en comptant les boîtes dans un milieu Hektoen (Himedia Laboratories Pvt. Ltd Mumbai India), incubées à 37 °C pendant 24 h. Celui de S. aureus a été déterminé dans un milieu Chapman (Biomérieux^® SA- France) incubées à 37 °C pendant 48 h, et S. flexneri a été dénombrée dans un milieu SS (Himedia Laboratories Pvt. Ltd. Mumbai India) incubées à 37 °C pendant 24 h. Le nombre de bactéries est exprimé en _Log10 d'unité formant colonie/g (Log ufc/g).

4. Analyse statistique

L'analyse de la variance (anova) a été utilisée pour déterminer les différences significatives entre les échantillons aux diférents jours de stockage (logiciel Stat box version 6.0.). La différence entre les moyennes est considérée significative à un niveau p<0.05.

Resultats

&

Discussion

1. Rendement en huiles essentielles

Durant notre travail, les parties des végétaux faisant l'objet d'extraction sont constituées par un matériel végétal sec (boutons floraux séchés du giroflier) et frais (myrte et eucalyptus).

Tableau VII : Le rendement (%) en H.E. des différentes plantes utilisées.

H.E.	Clous de Girofle (C.G.)	Eucalyptus	Myrte
Rendement	3,5	0,048	0,056

Fig. 25: Rendement en H.E.obtenues par hydrodistillation.

La figure 25 montre les résultats des différents rendements en H.E. des différentes espèces végétales utilisées dans cette étude. D'après cette figure, il s'avère que le rendement en H.E. extraite par hydrodistillation à l'échelle de laboratoire à partir des Clous de girofle est de 3,5 %. Ce résultat ne coïncide pas avec les résultats obtenus par d'autres auteurs qui ont procédé par la même technique d'hydrodistillation. ANDREA (2004) a obtenu un résultat de (14 à 20 %) en utilisant la même technique d'hydrodistillation.

Cette différence de rendement est probablement due à une perte d'huile dans la phase aqueuse du distillat et la simplicité de notre dispositif d'hydrodistillation. Cependant, les rendements en H.E. de Myrte et de l'Eucalyptus ont été presque nuls quand l'extraction se faisait à l'échelle de laboratoire, cependant les rendements en H.E. de ces deux plantes ont été améliorés de 0.056 % et 0.048 %, respectivement quand l'extraction est de type semiindustriel. On peut dire qu'en terme de quantité et, malgré que ces pourcentages semblent inférieurs mais dans la pratique restent satisfaisants pour mener à bien une telle étude, car les quantités en H.E. nécessaires sont de l'ordre des tl. En termes de valeurs, le rendement en H.E. de Clous de Girofle est significativement (P<5%) meilleur par rapport aux rendements obtenus en H.E. avec les deux autres plantes à savoir le Myrte et l'Eucalyptus. Selon certains auteurs, la composition chimique et le rendement en H.E. varient suivant diverses conditions :

la méthode employée, les parties végétales utilisées et les produits et réactifs utilisés pendant l'extraction, l'environnement, le génotype de la plante, son origine géographique, la période de récolte de cette plante, le degré de séchage, les conditions de séchage, la température et la durée de séchage, présence de parasites, de virus et mauvaises herbes (BAJPAI et al., 2008; KELEN et al., 2008).

2. Tests de sensibilité microbienne envers les H.E.

Ces tests consistent à déterminer la sensibilité des microorganismes vis-à-vis des H.E. Nous avons testé l'activité de quatre H.E par les méthodes de diffusion sur gélose, diffusion en puits et microatmosphère. Les mesures des halos d'inhibitions nous ont permis de classer les bactéries suivant leur degré de sensibilité à l'H.E. donnée.

Les résultats des témoins sont représentés dans la figure 26.

Fig. 26: Photos montrant les témoins réalisés par la méthode d'aromatogramme.

Les figures ci-dessous montrent les zones d'inhibition observées avec l'ensemble des bactéries pour chaque H.E. par les trois méthodes adoptées. Les tableaux renseignent sur les diamètres des zones d'inhibition en mm qui sont la moyenne des deux essais.

2.1- Essais avec les Clous de Girofle - Méthode d'aromatogramme

Fig. 27: Photos montrant l'activité antimicrobienne de l'H.E. à l'état pur des CG par la
méthode d'aromatogramme.

- Méthode de diffusion en puits

Fig. 28: Photos montrant l'activité antimicrobienne de l'H.E. des CG diluée à 1/2 par la
méthode de puits.

Le tableau suivant représente les résultats des moyennes de deux essais pour chacune des méthodes testées.

Tableau VIII: Halos d'inhibition (mm) provoqués par l'H.E. des Clous de girofle.

Méthodes Souches	Méthode de diffusion sur disque (huile pure)	Méthode de diffusion en puits (huile diluée à 1/2)
S. aureus	10,29 (sensible: +)	09,03 (sensible: +)
E. coli	16,31 (très sensible:++)	10,96 (sensible: +)
S. flexneri	12,41 (sensible: +)	9,66 (sensible: +)
S. paratyphi A	12,47 (sensible: +)	12,36 (sensible: +)
B. cereus	15,34 (très sensible:++)	20,43 (extrêmement sensible: +++)
P. aeruginosa	00,00 (résistante)	Non déterminée

Les valeurs obtenues en puits diffèrent des résultats des aromatogrammes. Vis-à-vis du S. paratyphi A, les résultats obtenus par les deux méthodes ne sont pas significativement différents. Cependant, on notera une grande signification entre les valeurs obtenues vis-à-vis des autres espèces. On peut en conclure que la méthode de diffusion en puits ne pourrait raisonnablement se substituer à celle des aromatogrammes pour le cas des Clous de girofle. Il faut noter que pour B. cereus, la méthode de diffusion en puits, l'huile des Clous de girofle est la plus active avec un halo d'inhibition de 20,43 mm de ~ devant celui de diffusion sur disque égale à 15,34 mm. D'après les résultats d'aromatogrammes, nous pouvons dire que toutes les espèces testées présentent une certaine sensibilité vis-à-vis de l'H.E. des Clous de girofle. Cependant E. coli et B. cereus se sont révélées très sensibles, tandis que S. aureus, S. flexneri et S. paratyphi A se sont révélées sensibles à l'exception de P. aeruginosa qui se révèle résistante.

Nous observons également que même lorsque l'H.E. est diluée à 50% pour la méthode en puits, toutes les espèces ont montré une sensibilité envers cette huile excepté la souche B. cereus qui a montré une très grande sensibilité.

Après 24 h d'incubation des boîtes du test de diffusion en puits, on s'est rendu compte que leur fond (en plastique) qui était en contact avec l'H.E. des C.G. avait fondu. Pour cela, nous émettons une hypothèse : certaines molécules des huiles des C.G. auraient un pouvoir corrosif (l'eugénol). Ceci a été confirmé par les travaux de BACHELOT et ses collaborateurs (2006), ayant conservé cette H.E. dans des tubes en plastiques et qui ont observé le même phénomène.

De récentes études (PALMER et al., 2000), ont démontré que les H.E. des C.G. se sont fortement antimicrobiennes. Cette activité pourrait être attribuée à son composé majoritaire qui est "l'eugénol" . Les travaux de VALERO et GINER (2006), ont prouvé que l'eugénol parmi d'autres composés a provoqué l'inhibition complète de la croissance de B. cereus. Les mêmes auteurs ont constaté également qu'aucune croissance n'était observée après 60 jours en présence de 150 ul d'eugénol/100 mL de bouillon. THOROSKI et al. (1989), ont démontré que l'eugénol à faible concentration empêchait la production d'amylase et de protéase par B. cereus, ils ont également noté que l'activité inhibitrice de ce composé est due à son action directe sur la détérioration de la membrane cellulaire de la bactérie cible. BURT, (2004) et OUSSALAH et al. (2005) ont démontré que l'H.E. des Clous de girofle contenant 78% d'eugénol était effective contre quatre bactéries pathogènes (E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes (L. monocytogenes), S. Typhimurium et S. aureus). À une concentration de 1% : vol/vol, l'H.E des Clous de girofle exerce une action bactéricide (LEUSCHNER et LELSCH, 2003). Selon ces mêmes auteurs, la charge initiale de L. monocytogenes égale à 6.77 Log ufc/mL passe à 1 log ufc/mL en présence de cette H.E. à une température d'incubation égale à 37 °C, cependant lorsque la température d'incubation était de 4 °C, la réduction de la charge bactérienne a atteint une valeur de 3 Log ufc/mL.

MOLEYAR et NARASIMHAM (1992), ont observé qu'un mélange de cinnamaldéhyde et d'eugénol à 250 et 500 ug/mL, respectivement empêchait complètement la croissance de Staphylocoque sp., Micrococcus sp., Bacillus sp., et Enterobacter sp. pendant plus de 30 jours, alors que les substrats appliqués individuellement n'ont pas empêché le développement microbien.

A la lumière de tous ces travaux, l'extrait des Clous de Girofle présente un large spectre d'activité antimicrobienne d'où l'importance de cette huile comme étant un conservateur, très efficace pour empêcher le développement microbien surtout quand il s'agit de protéger la santé vis-à-vis de la présence des pathogènes.

2.2- Essais avec la Sarriette

- Méthode d'aromatogramme

Fig. 29: Photos montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. de sarriette par la méthode
d'aromatogramme.

- Méthode de microatmosphère

Fig. 30: Photos montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. de Sarriette par la méthode de
microatmosphère.

Tableau IX : Halos d'inhibition (mm) provoqués par l'H.E. pure de la Sarriette.

Méthodes Souches	Méthode de diffusion sur disque (aromatogrammes)	Méthode de Microatmosphère
S. aureus	14,23 (sensible:+)	15,71 (très sensible:++)
E. coli	23,32 (extrêmement sensible:+++)	21,59 (extrêmement sensible:+++)
S. flexneri	25,87 (extrêmement sensible:+++)	16,18 (très sensible:++)
S. paratyphi A	13,61(sensible:+)	15,52 (très sensible:++)
B. cereus	13,54(sensible:+)	11,29 (sensible:+)

Fig. 31: Représentation graphique des deux tests antimicrobiens de l'H.E. de Sarriette.

La figure 31 représente les résultats des deux tests d'inhibition réalisés avec les deux méthodes (l'aromatogramme et la microatmosphère). Elle montre que l'H.E. de Sarriette est dotée d'une activité antibactérienne sans exception sur l'ensemble des bactéries testées. Toutes les souches ont présenté des degrés de sensibilité vis-à-vis de cette huile. Les résultats des aromatogrammes sont très proches de ceux des microatmosphères (Tableau IX). On peut en conclure que la méthode de Microatmosphère pourrait raisonnablement se substituer à celle des aromatogrammes pour le cas de la Sarriette. D'après ces résultats, nous pouvons remarquer que l'huile de Sarriette exerce une activité antimicrobienne extrêmement remarquable vis-à-vis de E. coli et S. flexneri avec un halo d'inhibition de Ø=23.32 et 25.87mm, respectivement pour la méthode d'aromatogramme. Cependant, à travers la méthode de microatmosphère, toutes les souches ont présenté presque une grande sensibilité. S. aureus: L1=15.71mm; E.coli: L1=21.59mm; S. flexneri: L1=16.18mm; S. paratyphi A: L1=15.52mm. En revanche, P. aeruginosa a manifesté une résistance totale vis-à-vis de l'huile de Sarriette.

Nous pouvons dire que, grâce aux profils chromatiques des H.E. de Sarriette, publiés dans la littérature (LAWRENCE et al., 1997), il a été identifié les proportions des phénols (49.3%), thymol (49.3%) et carvacrol (47.1%), responsables de l'effet antimicrobien de l'huile de Sarriette. PIBIRI (2006) a montré que 790 ppm d'H.E. de Sarriette ont un effet bactéricide sur S. aureus.

OUSSALAH et ses collaborateurs (2007) ont rapporté que l'H.E. de deux espèces de sarriette : S. hortensis (sarriette des jardins) et S. Montana (sarriette des montagnes) avec une concentration de carvacrol de 41% et de 43%, respectivement ont montré une forte activité antibactérienne contre toutes les bactéries pathogènes examinées (E. coli O157:H7, S. typhimurium, S. aureus et L. monocytogenes).

HELANDER et ses collaborateurs (1998), ont montré que des changements morphologiques au niveau de la membrane externe d'E. coli sont observés suite à son exposition au carvacrol, un composé majoritaire de la Sarriette.

Il est à préciser que cette essence est caractérisée par la dominance de l'á-pinène connu pour son effet inhibiteur. En effet, une étude réalisée par BOURKHISS et ses collaborateurs (2007) sur les H.E. des feuilles de Juniperus oxycedrus a montré qu'elle présente une bonne activité inhibitrice de S. aureus. Cette H.E. est caractérisée par l'abondance de l'á-pinène.

De même, au cours de leurs travaux sur l'H.E. de Croton stellulifer, MARTIN et ses collaborateurs (2000), ont rapporté que l'activité observée contre les bactéries et champignons étudiés est attribuée particulièrement à la présence de l'á-pinène parmi les composés majoritaires de cette essence. Une autre étude réalisée par ANGIONI et al (2003) sur les H.E. des feuilles de Juniperus oxycedrus a montré qu'elle présente une bonne activité inhibitrice de Candida albicans et S. aureus. L'H.E. de sarriette est caractérisée par l'abondance de l'ápinène (environ 86 % d'après LAWRENCE, 1992; MIKUS et al.,1997 ).

2.3- Essais avec l'Eucalyptus

- Méthode d'aromatogramme

Fig. 32: Photos montrant l'activité antimicrobienne de l'H.E. d'Eucalyptus par la
méthode d'aromatogramme.

- Méthode de diffusion en puits

Fig. 33: Photo montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. d'Eucalyptus par la
méthode de diffusion en puits.

- Méthode de Microatmosphère

Fig. 34: Photo montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. d'Eucalyptus par la
méthode de microatmosphère.

Tableau X : Diamètres (mm) des halos entourant les disques exprimant la sensibilité à
l'H.E. d'Eucalyptus (état pur et dilué à 1/2) des bactéries pathogènes.

Méthodes Souches	Aromatogramme (huile pure)	Méthode de diffusion en puits (huile diluée à 1/2)	Microatmosphère (huile pure)
S. aureus	29 (extrêmement sensible: +++)	47,17 (extrêmement sensible: +++)	11,7 (sensible : +)
E. coli	12,84 (sensible: +)	00 (résistante : -)	00 (résistante : -)
S. flexneri	10,3 (sensible : +)	00 (résistante : -)	00 (résistante: -)
S. paratyphi A	00 (résistante : -)	00 (résistante : -)	00 (résistante: -)
B. cereus	00 (résistante : -)	00 (résistante : -)	00 (résistante: -)

Tout comme l'H.E. des Clous de girofle et celle de Sarriette, l'huile d'Eucalyptus a manifesté une activité très importante vis-à-vis de S. aureus par rapport aux autres microorganismes testés. DORMAN et DEANS (2000), ont observé une tendance semblable quant à la sensibilité de S. aureus en présence de l'extrait d'Eucalyptus.

D'après le tableau ci-dessus, l'H.E. d'Eucalyptus exerce un pouvoir antibactérien très prononcé sur cette souche à l'état dilué: le diamètre de la zone d'inhibition obtenu par la méthode de diffusion en puits à 1/2 d'H.E. est supérieur à celui obtenu par l'aromatogramme (47,17 et 29 mm respectivement). Probablement, l'opération de dilution favorise mieux son activité antimicrobienne par une meilleure diffusion de son principe actif.

Toutefois, à travers la méthode d'aromatogramme, cette H.E. possède une activité antimicrobienne intermédiaire vis-à-vis d'E. coli et S. flexneri ([1=12,84, 10,3 mm, respectivement), par contre, S. paratyphi A et B. cereus se sont révélées très résistantes vis-à-vis de cette H.E. ([1=0mm).

L'huile d'Eucalyptus à l'etat pure a montré une activité antimicrobienne relativement moyenne ([1=11,7 mm) par la méthode de microatmosphère vis-à-vis de S. aureus, cependant et, toujours par la même méthode, les autres espèces pathogènes ont exprimé une résistance considérable vis-à-vis de cette huile ([1=00 mm). De même pour la méthode de diffusion en puits, mais cette fois-ci avec une huile diluée à 1/2, la sensibilité vis-à-vis de cette huile a été manifesté uniquement par S. aureus avec un degré extrêmement sensible ([1=47,17 mm).

Selon BOUAOUN et al. (2007), l'activité antimicrobienne de l'H.E. d'Eucalyptus est attribuée à l'eucalyptol, ou 1.8-cinéole qui est un monoterpène appartenant à la classe des éthers. Il a des propriétés antioxydantes (AMAKURA et al., 2002) et antibactériennes et donc explique l'origine de l'activité antimicrobienne de cette huile.

Plusieurs travaux ont déjà démontré l'activité antimicrobienne des composés d'Eucalyptus dans différents domaines des sciences de la vie (OSAWA et al., 1998; MURATA et al., 1990, 1992).

2.4- Essais avec le Myrte

- Méthode d'aromatogramme

Fig. 35: Photos montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. du Myrte par la méthode
d'aromatogramme.

- Méthode de diffusion en puits

Fig. 36: Photo montrant l'effet antimicrobien de l'H.E. du Myrte par la méthode
de diffusion en puits.

Tableau XI : Halos d'd'inhibition (mm) en présence d'H.E. de Myrte.

Méthodes Souches	Aromatogramme (huile pure)	Méthode de diffusion en puits (huile diluée à 1/2)
S. aureus	10,69 (sensible : +)	11,5 (sensible : +)
E. coli	14,79 (très sensible : ++)	00 (resistante: -)
S. flexneri	8,55 (non sensible :-)	00 (resistante: -)
S. paratyphi A	8,83	00 (resistante: -)
B. cereus	00 (resistante: -)	00 (resistante: -)

L'aromatogramme réalisé avec l'H.E. du Myrte montre que E. coli présente une grande sensibilité (L1=14,79mm) envers cette huile en comparaison avec les autres espèces bactériennes (L1=10,69, 8,55 et 8,83 mm, respectivement pour S.aureus, S. flexneri et S. paratyphi A.). Dans une étude réalisée par SAGDIÇ et al. (2002), l'extrait de Myrte a démontré une activité antimicrobienne considérable, spécialement vis-à-vis E. coli.

B. cereus a démontré une résistance accrue vis-à-vis de l'huile de Myrte même lorsque les deux méthodes (aromatogramme et diffusion en puits) sont appliquées.

Nos résultats ont montré que P. aeruginosa est l'espèce la plus résistante vis-à-vis des H.E. testées et ceci n'est pas surprenant ! Selon la littérature et les travaux menés sur les souches de cette espèce, plusieurs hypothèses ont été supposées quant à leur résistance. Selon PIBIRI, (2006), cette dernière a la réputation d'être très résistante à toutes sortes d'agents antimicrobiens et antibiotiques en général. Il est établi que l'inhibition de cette bactérie par des agents antimicrobiens, nécessite des concentrations considérables.

Des bactéries Gram - se sont montrées généralement plus résistantes que les Gram + aux effets de diverses H.E. en raison des lipopolysaccharides présents dans la membrane externe, mais ce n'était pas toujours vrai (OUSSALAH et al., 2007). Il semble que le mécanisme d'action de ces huiles est lié essentiellement à la structure de la paroi (BERCHE , 2003). Les mécanismes d'action des H.E. et leur sélectivité envers certaines bactéries restent jusqu'à présent mal élucidés. Selon plusieurs auteurs (DORMAN et DEANS, 2000), cette sélectivité est le résultat de la composition variée des fractions actives des huiles, qui présentent souvent des actions synergiques.

La méthode de microatmosphère n'a pas été concluante pour la plupart des H.E. testées, ceci est probablement dû aux conditions expérimentales défavorables (T° très élevée) ce qui favorise l'évaporation des huiles.

Au fil du temps, on a remarqué une perte progressive de l'efficacité des H.E. sous l'effet des conditions du travail (période estivale) : chaque ouverture des flacons induit à un renouvellement de l'O2 (oxydation) ainsi que l'évaporation des huiles sous l'effet de la chaleur.

2.5- Récapitulatif des aromatogrammes

Les résultats des tests d'inhibition de l'activité microbienne sont regroupés dans le tableau suivant.

Tableau XII : Récapitulatif des aromatogrammes des H.E. avec six souches bactériennes
pathogènes.

H.E. souches	Clous de girofle	Eucalyptus	Myrte	Sarriette
S. aureus	10,29 (sensible : +)	29 (extrêmement sensible : +++)	10,69 (sensible : +)	14,23 (sensible : +)
E. coli	16,31 (très sensible: ++)	12,84 (sensible : +)	14,79 (très sensible : ++)	23,32(extrêmement sensible : +++)
S. paratyphi A	12,47 (sensible: +)	00 (resistante: -)	8,83(resistante: -)	13,61 (sensible : +)
S. flexneri	12,41(sensible : +)	10,3 (sensible : +)	8,55 (resistante: -)	25,87 (extrêmement sensible : +++)
B. cereus	15,34 (très sensible : ++)	00 (resistante: -)	00 (resistante: -)	13,54 (sensible : +)
P. aeruginosa	00 (resistante: -)	00 (resistante: -)	00 (resistante: -)	Non réalisés

Fig. 37: Représentation graphique des effets antimicrobiens des H.E. vis-à-vis de 6
souches bactériennes pathogènes par la méthode d'aromatogramme.

3- Interprétation de la nature de l'activité des H.E.

Les résultats de l'activité des H.E. sont répertoriés dans le tableau suivant:

Tableau XIII: Nature de l'activité antimicrobienne des différentes H.E. testées après
repiquage sur BHIB puis sur gélose nutritive.

H.E. Souches	Clous de girofle	Eucalyptus	Sarriette
S. aureus	+ (effet bactériostatique)	- (effet bactéricide)	- (effet bactéricide)
E. coli	+ (effet bactériostatique)	+ (effet bactériostatique)	+ (effet bactériostatique)
S. flexneri	+ (effet bactériostatique)	- (effet bactéricide)	+ (effet bactériostatique)
S. paratyphi A.	- (effet bactéricide)	Non déterminée	+ (effet bactériostatique)
B. cereus	- (effet bactéricide)	Non déterminée	+ (effet bactériostatique)

(+): développement bactérien ; (-) : absence de développement bactérien.

H.E. à effet bactéricide: Un prélèvement sur la surface de la gélose ne montre aucun développement lorsqu'il est repiqué ce qui signifie que l'H.E. semble exercer un effet bactéricide sur le germe. C'est le cas pour: l'H.E. de Sarriette vis-à-vis de S. aureus; l'H.E. d'Eucalyptus vis-à-vis de S. flexneri et S. aureus; l'H.E. des Clous de girofle vis-à-vis de B. cereus et S. paratyphi A.

H.E. à effet bactériostatique: cas de toutes les autres H.E.

4- Concentrations minimales inhibitrices (CMI)

Les figures suivantes regroupent les CMI en H.E. correspondant à chaque souche bactérienne testée. Sur l'ensemble des dilutions effectuées (10 pour chaque huile), ne sont présentées que les boîtes où les CMI sont impliquées.

4.1- Clous de Girofle

Fig. 38: Photos montrant les CMI de l'H.E. des CG vis-à-vis de certaines bactéries
pathogènes.

L'H.E. des Clous de girofle montre un effet inhibiteur très prononcé. Les CMI sont comprises entre 1/10 et 1/50 (c.-à-d. 111,1 et 20,4 ul/mL).

Toutes les boîtes dont la concentration en H.E. est comprise entre 1/60 et 1/100 développent des colonies résistantes, ceci pour les trois souches bactériennes testées.

La valeur de CMI de l'H.E. des Clous de girofle vis-à-vis de S. aureus est de 1/50 (première boîte dans laquelle on n'observe aucun développement microbien) (cf. figure 38-b) ; aucune colonie n'est visible à partir de 1/20 pour E. coli (cf. figure 38-d) ; et de1/10 pour S. paratyphi A (cf. figure 38-e).

4.2- Sarriette

Fig. 39: Photos montrant les CMI de l'H.E. de Sarriette vis-à-vis de certaines bactéries
pathogènes.

L'extrait de Sarriette est très actif sur l'ensemble des souches bactériennes choisies pour la détermination de la CMI à savoir : S. aureus, S. paratyphi A. S. flexneri et E. coli. Il conserve son activité jusqu'à une dilution de 1/100 (10,1 ul / mL).

4.3- Eucalyptus

Fig. 40: Photos montrant les CMI de l'H.E. d'Eucalyptus.

La valeur de la CMI de l'H.E. d'Eucalyptus pour S. aureus est de 1/50 c'est-à-dire 20,4 ul / mL d'eau distillée (première boîte dans laquelle on n'observe aucun développement microbien) (cf. figure 40-d);

La valeur de CMI de l'H.E. de l'Eucalyptus pour E. coli et S. flexneri est de 1/2 (1000 ul / mL) (cf. figure 40-a).

4.4- Myrte

Fig. 41: Photos montrant les CMI de l'H.E. du Myrte.

La valeur de la CMI de l'H.E. du Myrte pour S. aureus est de 1/4 (cf. figure 41-b); au bout de 48h d'incubation, on a observé un développement bactérien dans les deux premières boîtes (a et b). Ce qui signifie que cette huile perd son activité après la moindre dilution.

Les valeurs des concentrations minimales inhibitrices sont reportées dans le tableau suivant :

Tableau XIV : Récapitulatif des valeurs de CMI des H.E. testées sur les 6 souches
pathogènes (en ul/mL d'eau).

H.E. souches	Clous de Girofle	Eucalyptus	Myrte	Sarriette
S. aureus	20,4	20,4	333,3	10,1
E. coli	62,5	1000	non déterminée	10,1
S. paratyphi A	111,1	non déterminée	non déterminée	10,1
S. flexneri	non déterminée	1000	non déterminée	non déterminée

Fig. 42: Représentation graphique des valeurs de CMI des quatre H.E. sur 4 souches
bactériennes testées.

Dans l'ensemble, les quatre H.E. testées présentent une activité antibactérienne "in vitro" sur la plupart des souches tests. La plus faible CMI a été obtenue avec l'H.E. de Sarriette sur S. aureus, S. paratyphi A et E. coli (10,1 ul/mL), tandis que les plus hautes CMI ont été obtenues avec les H.E. de l'eucalyptus sur E. coli (CMI : 1000 ul/mL) et S. flexneri (1000 ul/mL) et du myrte sur S. aureus (333,3 ul/mL). Il est à noter que l'efficacité d'une H.E. est inversement proportionnelle à la valeur de sa CMI vis-à vis d'une souche donnée.

Les valeurs de la CMI sont inversement proportionnelles au degré d'efficacité des H.E. Les résultats ont révélé que parmi les quatre huiles étudiées, l'H.E. de sarriette est celle qui possède le plus grand pouvoir antibactérien, elle garde son activité même après une dilution de 1/100 de l'huile pure, cela n'est pas étonnant du faite qu'elle soit une huile pure et certifiée ; puis vient celle des Clous de girofle.

5- Combinaison entre les H.E.

Généralement, il est bien admis que les composés majeurs d'une H.E. donnée reflètent souvent son activité biologique (IPEK et al., 2005), l'amplitude et les différences de leur activité dépendent de leur concentration dans le milieu en présence d'autres composés minoritaires. Cependant, les actions synergiques entre les molécules issues de différentes H.E. en comparaison avec l'action individuelle d'un ou plusieurs composés restent mal élucidées.

Cependant, il serait possible que l'activité d'une molécule majoritaire soit modulée par d'autres molécules minoritaires (HOET et al., 2006).

Tableau XV: Résultats des interactions entre les différentes H.E. testées par la méthode
des aromatogrammes (zones d'inhibition en mm).

Mélange d'H.E.	Bactérie	Rapports
		1/1	1/2	1/3
Eucalyptus/Clous de Girofle	S. aureus	09,80	12,89	10,78
Clous de Girofle / Eucalyptus	S. aureus		09,68	07,92
Clous de Girofle / Sarriette	E. coli	18,64	24,46	21,77
Sarriette/ Clous de Girofle	E. coli		18,23	19,05
Clous de Girofle / Sarriette	S. flexneri	19,67	24,82	26,12
Sarriette/ Clous de Girofle	S. flexneri		16,85	18,23

En comparant ces valeurs à celles obtenues avec les H.E. testées séparément, on peut conclure que l'H.E. d'Eucalyptus exerce un effet d'antagonisme sur celle des Clous de girofle vis-à-vis de S. aureus c'est-à-dire que l'effet de la somme des deux huiles est inférieur à l'effet des deux huiles testées séparément.

De même pour l'H.E. des Clous de girofle avec celle de Sarriette pour les deux souches bactériennes testées (E. coli et S. flexneri).

6- Application des huiles essentielles dans la viande

Depuis le moyen âge, les H.E. ont été utilisées comme des substances bactéricides, virucides, fongicides, antiparasitaires, insecticides, en médecine et produits cosmétiques. Actuellement leur usage est étendu vers l'industrie pharmaceutique et surtout en agroalimentaire. Les nouvelles techniques d'extraction des H.E. des espèces végétales ont permis d'obtenir des substances aromatiques volatiles variées qui sont généralement très riches en terpènes et terpenoïdes, phénols et des composés aliphatiques divers (BAKKALI et al., 2008). Les H.E. et leurs composants sont connus pour posséder des activités antimicrobiennes (MAHBOUBI et HAGHI, 2008 ; PAPARELLA et al., 2008) et pourraient donc servir de conservateurs alimentaires, d'autant plus qu'ils sont pour la plupart classés

« généralement reconnus comme sains » ou approuvés comme additifs alimentaires par les autorités sanitaires internationales.

Plusieurs études ont été réalisées dans le but de sélectionner les H.E. aux propriétés antibactériennes importantes. Une large gamme d'huiles et de bactéries ont été testées.

6.1- Optimisation de la quantité d'huile appliquée dans la viande par des tests préalables de dégustation

- Critère du goût: Le tableau suivant regroupe les appréciations des individus qui ont dégusté la viande hachée cuite avec des volumes d'H.E. différents.

Tableau XVI: Résultats du test de dégustation selon le critère du goût.

H.E.	Volumes (ul / 1OOg)	APPRECIATIONS
		1	2	3	4	5	6	7	8	9
Clou de Girofle	50	1	2	2
	40	1	1	2	1
	30		1		2	2
	10					1		2	2
Sarriette	50			1	2		2
	40			1	2	1	1
	30							2	2	1
	10						1	2	1	1
Eucalyptus	50		1	1	2	1
	40			1	2	2
	30						1	2	1	1
	10						2	1	1	1

1=extrêmement mauvais; 2=très mauvais; 3=mauvais; 4=moyennement mauvais; 5=ni bon, ni mauvais; 6=moyennement bon; 7=bon; 8=très bon ; 9=extrêmement bon.

Le tableau XVII représente les résultats du test d'appréciation de la qualité organoleptique (le goût) de la viande hachée par le jury de dégustation en fonction d'une série de volumes croissants des différentes H.E. (10 à 50 ul).

Les résultats du test de dégustation ont indiqué que l'acceptation par le panel de dégustation est inversement proportionnelle au volume de l'H.E. diluée utilisé pour l'H.E. des Clous de girofle. Le plus faible volume en cette huile qui n'altère pas le critère « goût » est celui rajouté à l'échantillon le plus apprécié par la majorité des membres du jury (10 ul). Par contre,

l'échantillon traité par un volume de 50 ul a été jugé de très mauvais goût (niveau 02 et 03). Les échantillons appréciés le plus sont ceux traités avec 30 ul pour les H.E. de Sarriette et d'Eucalyptus.

- Critère d'odeur : même démarche que pour le critère du goût.

Tableau XVII: Résultats du test de dégustation selon le critère d'odeur.

H.E.	Volumes (ul / 100g)	APPRECIATIONS
		1	2	3	4	5	6
Clous de Girofle	50	3	2
	40	1	3	1
	30		3	2
	10					2	3
Sarriette	50		3	2
	40			1	4
	30					3	2
	10				2	3
Eucalyptus	50	2	3
	40		1	3	1
	30					2	3
	10					4	1

1=odeur très forte; 2=odeur forte; 3=odeur moyenne; 4= odeur ni faible ni forte; 5=odeur faible; 6=odeur inaperçue.

Le tableau XVII montre les résultats du test d'appréciation du critère d'odeur de la viande hachée traités par les mêmes volumes que ceux rajoutés précédemment.

Selon l'appréciation du panel de dégustation, le plus faible volume en l'H.E. des Clous de girofle qui ne présente pas une odeur forte à percevoir est de 10 ul, celui de sarriette et d'eucalyptus est de 30 ul.

6.2- Effet des huiles essentielles appliquées dans la viande sur la flore pathogène

6.2.1- S. aureus

Tableau XVIII: Résultats du dénombrement de S. aureus dans chaque échantillon (Log10 ufc/g/temps).

JOURS
	0	1	4	7
Echantillons
Contrôle	5	5,3	6,83	7,3
Clous de Girofle	5	4,63	5,72	6,67
Eucalyptus	5	0	0	0

0 2 4 6 8 jours

Durée de conservation (jours)

Contrôle

Clous de Girofle Eucalyptus

log ufc/g

8

7

6

5

4

3

2

1

0

Fig. 43: Effets dans la viande des H.E. des Clous de girofle et d'Eucalyptus vis -à -vis de
S. aureus (à 2#177;1 °C).

La figure 43 montre l'activité antimicrobienne des H.E. des Clous de girofle et d'Eucalyptus sur S. aureus appliqué à la viande hachée maintenue à une T° d'entreposage de réfrigération pendant une période qui ne dépasse pas les 8 jours. Il s'avère que la présence de ces deux huiles ont permis une réduction significative du nombre logarithmique de S. aureus et, ceci pendant toute la durée de conservation. Le graphe montre que l'huile d'Eucalyptus exerce une activité antimicrobienne plus considérable que les Clous de girofle, on remarque que, dès les premières heures d'entreposage, l'huile d'Eucalyptus a permis une réduction en chute libre du nombre bactérien. Après 24 h d'entreposage jusqu'au dernier jour, le nombre de S. aureus a atteint une valeur nulle. Ce qui explique que l'huile d'Eucalyptus exerce une très forte activité antibactérienne contre S.aureus une fois qu'elle est en contact avec la bactérie cible (effet bactéricide). Ce résultat confirme ceux obtenus "in vitro".

Il est noté à travers ce graphe que le nombre maximal de S. aureus pendant toute la durée de conservation a été enregistré dans les échantillons de viande qui ne contiennent pas d'H.E (contrôle). Ces échantillons contrôles ont atteint une valeur de 7,3 Log UFC/g à la fin de la période de conservation (au 7^ème jour). La présence d'H.E. des C.G. a inhibé la croissance de S. aureus de 12,64, 16,25 et 8,63 % après 24 h, 04 jours et 07 jours de conservation respectivement. DEANS et RITCHIE (1987) ont étudié l'effet antimicrobien de plusieurs H.E. sur plusieurs genres de bactéries grâce à une méthode de contact direct en milieu solide (puits). Sous leur forme non diluée, toutes les H.E. inhibent au moins un genre bactérien. Parmi les H.E. qui ont manifesté les propriétés inhibitrices les plus importantes, on note celles des Clous de girofle, du thym, du laurier...Elles inhibent plus de 20 genres de bactéries testées. Cette étude, ainsi que beaucoup d'autres, comme celles de KOTZEKIDOU et al., (2008) ; RAZZAGHI-ABYANEH et al., (2008) et DORMAN et DEANS (2000), confirment les propriétés antibactériennes de certaines H.E. Mais les H.E. de plantes sont souvent des mélanges complexes de différents composés dont certains, sont dotés de propriétés antimicrobiennes. La composition des H.E. d'une même espèce varie selon la localisation géographique, les conditions climatiques...par conséquent, leurs propriétés antibactériennes varient également. Il serait donc d'une importance primordiale de séparer et d'identifier les composants actifs présents dans une huile à pouvoir antimicrobien. Certains auteurs ont procédé par des techniques de laboratoire à l'identification des molécules chimiques qui contiennent les H.E.

BAGAMBOULA et al. (2004) ; BAYDAR et al. (2004) ont démontré que différents constituants des H.E. possèdent des activités antibactériennes et que les constituants volatils majeurs ont les propriétés antimicrobiennes les plus importantes : carvacrol chez l'origan, eugénol chez les Clous de girofle, linalool chez le coriandre, thymol chez le thym....

6.2.2- S. paratyphi A.

Tableau IXX : Résultats du dénombrement de S. paratyphi A. dans chaque échantillon (Log ufc/g/temps).

JOURS
	0	1	4	7
Échantillons
Contrôle	5	5,91	6,83	7,3
Clous de
Girofle	5	5,13	6,51	6,83
Sarriette	5	5,65	6,83	7,3

2

1

0

0 2 4 6 8

Durée de conservation (jours)

7 6 5

8

log ufc/g

Contrôle

Clous de Girofle Eucalyptus

4
3

Fig. 44: Évolution de la croissance de S. paratyphi A. en présence et en absence d'H.E.
(à 2#177;1 C).

La figure 44 illustre l'activité antimicrobienne des H.E. des Clous de girofle et de Sarriette sur la croissance de S. paratyphi A. dans la viande hachée pendant une période de

conservation de 7 jours. À travers ce graphe, on remarque que l'huile des Clous de girofle exerce une activité antimicrobienne plus considérable que celle de Sarriette. Cette dernière a ralenti la croissance de S. paratyphi A. uniquement durant les premières heures d'entreposage de la viande à une T° de 2#177;1 °C. Une réduction du nombre logarithmique de cette souche en présence des H.E. de Sarriette et des Clous de girofle est réduite d'un facteur de 4,4 et 13,19 % respectivement, jusqu'au 4^e jour où la Sarriette perd complètement son activité antibactérienne, contrairement à celle des Clous de girofle qui la maintient partiellement jusqu'au dernier jour.

Plusieures études (KIM et al., 1995a) ont porté sur la sensibilité des salmonelles à différents composés d'H.E. Le composé le plus efficace est le carvacrol. KARAPINAR et ARTUG (1987) ont montré en milieu gélosé que la croissance de Salmonella typhimurium encemencée à un niveau de 10⁶ ufc/mL est complètement inhibée par 0,1 g/L d'eugénol.

6.2.3- E. coli

Tableau XX : Résultats du dénombrement d' E. coli dans chaque échantillon (Logufc/g/temps).

JOURS Échantillons	0	1	4	7
Contrôle	5	6,01	6,83	8,7
Clous de Girofle	5	4,81	6,01	7,3
Sarriette	5	1,9	3,04	5,2

Résultats et Discussion

9

8

7

6

Contrôle

Clous de Girofle Sarriette

2

1

0

0 2 4 6 8

10

Log ufc/g

5

4

3

Durée de conservation (jours)

Fig. 45: Effets dans la viande des H.E. de Clou de girofle et de Sarriette vis-à-vis de E.
coli (à 2#177;1 C).

Pour les échantillons inoculés avec E. coli, une augmentation exponentielle de la croissance bactérienne est observée dans ceux qui ne contiennent pas des H.E. pendant la période d'entreposage. Comme le montre la figure 45, une diminution très remarquable de la croissance bactérienne de l'échantillon traité avec l'H.E. des C.G. atteignant une réduction d'un facteur de à 1,2 cycle logarithmique au bout du premier jour, et de 0,82 au bout de 4 jours. L'effet de l'H.E. de Sarriette est très prononcé si on le compare à l'effet de l'huile des C.G. vis-à-vis d'E. coli. La cinétique de croissance de cette souche est ralentie de 4 cycles logarithmiques au jour 1 ce qui correspond à une charge bactérienne de 10⁴ ufc/g, et une réduction de 3,79 cycles après 4 jours. Au-delà de cette période, on observe une perte progressive du pouvoir antibactérien.

KIM et al. (1995 b), se sont intéressés à E. coli O 157 : H7. Leurs résultats montrent que la croissance de cette souche est complètement inhibée par le citral, le carvacrol, le géraniol et le perillaldehyde à 0,5 g/L.

6.2.4- S. flexneri

Tableau XXI : Résultats du dénombrement de S. flexneri dans chaque échantillon (Log ufc/g/temps).

JOURS
Échantillons	0	1	4	7
Contrôle	5	6,05	6,54	8,15
Sarriette	5	5,85	6,02	7,3

2

1

0

0 2 4 6 8

Durée de conservation (jours)

8 7 6 5

9

log ufc/g

Contrôle
Sarriette

4
3

Fig. 46: Effets dans la viande de l'H.E. de Sarriette vis-à-vis de S. flexneri (à 2#177;1 C).

Le graphe illustré par la figure 46 montre l'effet inhibiteur de la croissance de S. flexneri en présence de l'H.E. de Sarriette. Cet effet est non significatif durant les premières 24 h de conservation, mais qui augmente au fur et à mesure qu'on avance dans le temps comparativement aux échantillons témoins: avec une diminution de 8 % entre le troisième et le cinquième jour. L'H.E. de Sarriette présente," in vitro", une bonne activité inhibitrice vis-à-vis de S. flexneri. Cependant, cette souche n'a pas manifesté la même sensibilité une fois introduite dans la viande fraîche hachée.

Parmi la totalité des H.E. testées sur la viande, seule celle d'Eucalyptus a exercé un effet bactéricide contre S. aureus. Tandis que l'effet bactériostatique est montré par le reste des H.E. testées.

Il est bien connu que le pouvoir antimicrobien des H.E. dans des matrices alimentaires est généralement réduit une fois comparé au travail "in vitro", du fait que la présence de graisses, des hydrates de carbone, de protéines, de sels et de pH (facteurs intrinsèques) influence fortement l'efficacité de ces agents (BURT, 2004).

CUTTER (2000) a supposé que l'activité antimicrobienne liée aux extraits de fines herbes peut être diminuée par la présence de composants adipeux dans la viande hachée. PALMER et ses collaborateurs (2001), ont supposé que la teneur en protéines constitue un facteur empêchant l'action de l'H.E. des Clous de girofle sur salmonella enteritidis dans un fromage à faible teneur en matière grasse.

DORMAN et DOYENS (2000) ont observé l'activité l'antibactérienne de certaines H.E. de plantes telles que l'origan (Origanum copactum), contre 25 genres bactériens "in vitro". Ils ont conclu que l'ajout de ces extraits aux produits alimentaires, ne causerait aucune modification des propriétés organoleptiques, et retarderait la contamination microbienne.

Contrairement à cette conclusion, les résultats de notre étude ont montré que les effets antibactériens sont différents de ceux qu'on a obtenus "in vitro", ceci revient à dire que l'activité antimicrobienne des H.E. dans la viande hachée est influencée par les facteurs intrinsèques à l'exception de l'H.E. d'Eucalyptus qui a maintenu son pouvoir antibactérien vis-à-vis de S. aureus.

D'après CAILLET et LACROIX (2007), certains facteurs comme la T°, les conditions de stockage, le pH ou la composition de l'aliment, peuvent avoir une influence sur l'action des H.E. Il est établi que l'efficacité de l'huile augmente avec la diminution du pH de l'aliment, de la température de stockage ou encore de la quantité d'oxygène dans l'emballage. Il est également prouvé qu'une même huile sera plus efficace dans un aliment pauvre en gras et/ou en protéines et ce n'est pas le cas pour la viande. Les fortes teneurs en eau et en sels d'un aliment vont aussi favoriser l'action de l'H.E.

WENDAKOON et SAKAGUCHI (1993), ont démontré que l'addition du chlorure de sodium (NaCl) aux H.E., augmentant leur activité antimicrobienne. Le NaCl a montré un effet synergique avec celle-ci. Le mécanisme suggéré pour son interaction avec l'eugénol est l'augmentation de la perméabilité de la membrane cellulaire, et par conséquent inhibition de la croissance bactérienne en raison de son action sur les enzymes intracellulaires. BUSATTA et ses collaborateurs (2007) ont examiné l'effet des H.E. d'Origanum majorana sur la croissance de plusieurs espèces bactériennes dont E. coli dans une saucisse fraîche. L'H.E. et la saucisse ont été mélangées avec du NaCl.

Des mélanges d'H.E. de cannelle et des Clous de girofle ont été examinés contre S. aureus sous atmosphère modifiée (AM): O2 (< 0,05 à 10 %) et CO2 (20 ou 40 %) par MATAN et ses collaborateurs (2005). Cette combinaison de systèmes (H.E. et AM) a augmenté considérablement l'efficacité antibactérienne.

CONCLUSION

Conclusion et perspectives

La contamination des viandes constitue un énorme problème pour la santé publique, mais cette situation peut être mieux contrôlée par l'utilisation de conservateurs naturels.

Les quatre espèces végétales ayant fait l'objet de notre étude, à savoir les Clous de Girofle, l'Eucalyptus, le Myrte et la Sarriette sont fréquemment utilisées dans la pharmacopée traditionnelle. Cette recherche a permis de mettre en évidence l'effet antibactérien des H.E. de ces plantes "in vitro" et dans une matrice alimentaire "la viande".

Le rendement en huile essentielle des plantes étudiées (Clous de girofle, Eucalyptus et Myrte) est acceptable et peut être rentable à l'échelle industrielle.

Suivant nos résultats, nous pouvons prédire que les H.E. étudiées sont des agents antimicrobiens naturels efficaces et peuvent être une source très importante de conservateurs utilisés pour limiter les empoisonnements d'origine bactérienne, notamment l'huile d'Eucalyptus contre S. aureus. Cependant, il faut signaler que les activités biologiques d'une huile essentielle ne sont pas seulement dues aux composés majoritaires mais à l'ensemble des composées de base. Cette étude mérite une analyse approfondie des mécanismes d'action des ces composés purifiés, et une recherche plus avancée sur la synergie de ces derniers. Il faut donc mener une étude détaillée sur la composition qualitative et quantitative de ces huiles par le couplage de la CPG/SM.

Des études ultérieures plus approfondies doivent être effectuées afin de cerner l'activité antimicrobienne des huiles essentielles dans les aliments. Vérifier leur innocuité par des tests de toxicité et des tests d'allergénicité semble d'une grande importance.

Les résultats obtenus "in vitro" ne constituent qu'une première étape de recherche et qui ne sont pas tout à fait parallèles à ceux obtenus une fois appliquée dans la viande. Cependant, les techniques récentes d'encapsulation en liposomes semblent surmonter de tels problèmes. Ce procédé permet d'améliorer la stabilité de l'huile essentielle et son disponibilité biologique. D'autres procédés plus élaborés, comme l'addition de sel (NaCl) à l'huile essentielle, ou le couplage avec la méthode de conservation sous atmosphère modifiée permettent de bénéficier d'une plus longue conservation.

Cette étude confirme l'intérêt des H.E. offrant ainsi un patrimoine à préserver, à développer et à valoriser, dans la mesure où nos résultats constituent, avec ceux des études réalisées auparavant, une base essentielle en faveur de leur exploitation dans l'industrie agroalimentaire.

Références bibliographiques

Références bibliographiques

· AFSSA (Association Française de Sécurité Sanitaire des Aliments), (2006). Hy giène domestique. CHU Bordeaux, (France).

· AFNOR (Agence Française de Normalisation), (1989). Huile Essentielle 3 ^ème Edit., Pari s (France).

· AFNOR (2000). Recueil de norm es : les huiles es sentielles. Monographies relatives aux huiles essentielles (H à Y). AFNOR, Paris, 661-663.

· AHMAD N. (2005). Antimicrobial activity of clove oil and its potential in the treatment of vaginal candidiasis, J. Drug. Target. 13, 555-61.

· AKROUT A. (2001). Étude des huiles essentiell es de quelques plantes pastorales de la région de Matmata (Tunisie).

· ALITONOU G.A., AVLESSI F., SOHOUNHLOUE K.C. ALLISNET D., (2008). Aromathérapie - Les huiles essentielle s, un po uvoir antim icrobien avéré. Fondation pour le Libre Choix.

· AMAKURA Y., UMINO Y., TSUJI S., ITO H., HATANO T., YOSHIDA T., TONOGAI Y. (2002). Constituents and t heir antioxidative effects in eucalyptus leaf extract used as a natural food additive. Food Chemistry. 77, 47-56.

· ANGIONI, A. BARRA, M. T. RUSSO, V. CORONEO, S. DESSIP, P. CABRAS (2003). Chemical composition of the essential oils of Juniperus from ripe and unripe berries and leaves and their antimicrobial activity. J. Agric. Food Chem, 51, 3073-3078.

· ANONYME (2005), Institut Suisse des Huiles Ess entielles. Plantes Aromatiques et Médici nales, Cahier des charges SWISSEO, Edition 11.

· ANTON R. et LOBSTEIN A. (2005). Plantes aromatiques. Épices, aromates, condiments et huiles essentielles. Tec & Doc, Paris (France).

· AVERTIT P. (2004). Des huiles essentielles tuent les sta phylocoques dorés résistant s à la
methicilline.

· AVRIL J.L. (2000). Bactériologie clinique. 3^ème Edition.

· BAGAMBOULA C. F., UYTTENDAELE M. , DEBEVERE J. (2004). Inhibitory effect of thyme and basil es sential oils, carv acrol, th ymol, estragol, linalool and p-cymene toward s Shigelle sonnei and S. flexneri. Food Microbiology. 21, 33-42.

· BAJPAI V.K., RAHMAN A., KANG S.C., (2008). Chemical co mposition and i nhibitory parameters of essential oil and extracts of Nandina domestica Thunb. to control food-borne pathogenic and spoilage bacteria. International Journal of Food Microbiology. 125, 117-122.

· BAKKALI F., AVERBECK S., AVERBECK D., IDAOMAR M. (2008). Biological effects of essential oils - A review. Food and Chemical Toxicology. 46, 446-475.

· BARRAL J., BOIVIN J., COUDURIER S., DESMAZIERES C., GONZALEZ A., GUIDEZ F., LAPOTRE A., MEGY F. (2007). Valorisation des effets antim icrobiens de l' huile essentielle de lavandin Grosso. ONIPPAM, 1- 67.

· BAYDAR H., SAGDIC O., OZKAN G., KARADOGAN T. (2004). Antibacterial activity and composition of essential oils fro m Origanum, Thymbra and Satureja species with commercial importance in Turkey. Food Control. 15, 169-172.

· BEL HADJ S.K., MAHJOUB M.A., AMMAR S., IMED F., ZINE M., MAHJOUB A. (2006). Propriétés antioxydantes de l'huile essentielle de Coridothymus capitatus (L.). Les Plantes à Parfum, Aromatiques et Médicinales. Faculté de Pharmacie- 5000 Monastir, Tunisie.

· BELGHAZI L., LAHLOU N., ALAOUI I., ABOUSAOUIRIA T., HABTI N., TANTAOUI IA., TALBI M., BLAGHEN M., FELLAT-ZARROUK. (2002). Extraction et analyse par chromatographie en phase gazeuse de l'huile essent ielle de la menthe pouliot . Test antifongique . Congrèsde biochimie. Casablanca. Biochimie et santé, 38-40.

· BENINI C. (2007). Contribution à l'étu de de la divers ification de la prod uction d 'huiles essentielles aux Com ores. Thèse Bioingénieur. Faculte Universitaire Des Sciences Agronom iques De Gembloux, Belgique.

· BENNIS S., CHAMI F. S. (2004). Surface alteration of Saccharomyces cervisiae induced by thymol and eugenol. Letters in Applied Microbiology. 38, 454-458.

· BERCHE P. (2003). Bactériologie générale. PCE M 2. Faculté de médecine Necker-E nfants malades (France). pp 89.

· BERKEL B. M., BOOGAARD B., HEIJNEN C. (2005). La conservation du poisson et de la viande. Deuxième édition, Fondation Agromisa, Wageningen, Pays-Bas.

· BESSIERE J.-M., CHANTAL M. (2007). Étude chimique, activités anti-inflammatoires et antiradicalaire d e l' huile essentielle extraite des feuilles de Cymbopogon nardus (Linn.) R endle.
(Poaceae) récoltées au Benin.

· BILLERBECK V.-G. (2007). Huiles es sentielles et ba ctéries résist antes aux antibiotiques. Phytothérapie. 5, 249-253.

· BOUAOUN D., HILAN C., GARABETH F., SFEIR R. (2007). Etude de l'activité antimicrobienne de l'huile essentielle d'une plante sauvage Prangos asperula Boiss. Phytothérapie. 5, 129-134.

· BOUIHDID S., IDAOMAR M., ZHIRI A., BAUDOUX D., SKALI N.S., ABRINI J. (2006). Thymus essential oils: chem ical co mposition and in vitro antioxidant and antibacterial activities. Département De Biologie, Faculté des Sciences- Université Abdelmalek Essaâdi. Tétouan (Maroc).

· BOUSBIA N. (2004). Extraction et identification de quelques huiles e ssentielles (nigelle,
coriandre, origan, thym, romarin), étu de de leur s activités antimicrobiennes . Thèse de Magistère, option Sciences Alimentaires, Institut National Agronomique, Alger (Algérie).

· BOUZOUITA N., FATEN K., BEN HALIMA M., MONCEF M.C. (2006). Composition chimique, activités antioxydante antimicrobienne et insecticide de l'huile es sentielle de Juniperus phoenicea. Revue des Ré gions Arides - Nu méro spécial - A ctes du sé minaire international « les Plantes à Parfum, aromatiques et médicinales ».

· BRANGER C., (2007). Enseignement dirigé de b actériologie. Université PARIS 7 Faculté de médecine Denis DIDEROT (France). pp 81.

· BRUNETON J. (1993). Phytochimie. Plantes médicinales. Tec. & Doc., Lavoisier, Paris.

· BRUNETTON (1999). Pharmacognosie. Phytochimie - plantes médicinales. 3^ème Dd. Paris.

· BURT S. (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods_a review. International. Journal. of Food Microbiology. 94, 223-253.

· BUSATTA C., VIDAL R.S., POPIOLSKI A.S., MOSSI A.J., DARIVA C., RODRIGUES M.R.A., CORAZZA F.C., CORAZZA M.L., VLADIMIR O. J.,. CANSIAN R.L (2008). Application of Origanum majorana L. essential oil as an antimicr obial agent in sausage. Food Microbiology. 25, 207-211.

· CAILLET S., LACROIX M. (2007). Les huiles essentielles : leurs propriétés antimicrobiennes et leurs applications potentielles en alime ntaire. Laboratoire de Recherche en Sciences Appl iquées à l'Alimentation (RESALA) INRS-Institut Armand-Frappier, Université de Laval (Québec).

· CARSON C.F., RILEY T. V. (1995). Antimicrobial activity o f the m ajor components of the essential oil of Malaleuca alternifolia. Journal of Applied Bacteriology. 78, 264-269.

· CHAMI F. (2005). Oregano and clove essential oils indu ce surface alteration of Saccharom yces cerevisiae. Phytother. Res. 19, 405-8.

· CHICHOUNE A. (2005). Huiles es sentielles de Thym et d' Origan : Etude de la co mposition chimique, de l' activité antioxydante et anti microbienne. Thèse de Magist ère, Institut National Agronomique, Option Sciences Alimentaire, El Harrach (Algerie).

· CHIRON (1996). Synthèse d' hydroperoxydes de te rpènes. Relatio n avec l' activité
antimicrobienne et applica tion à la synthèse de poly terpènes hy droperoxydés. Mémoire d'ingénieur CNAM Paris.

· COSENTINO S., TUBEROSO C. I. G. (1999). In-vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential oils. Lett Appl Microbiol. 29, 130-135.

· COX S.D., MANN C.M., MARKHAM J.L. (2000). The m ode of antim icrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). J Appl Microbiol. 88, 170-175.

· CURADO M.A., OLIEIRA C.B.A, JESUS J.G., SANTOS S.C., SERAPHIN J.C., FERRI P.H. (2006). Environm ental fators influence on che mical polym orphism of the essentia l oils of Lychnophora ericoides. Phytochemistry. 67, 2363-2369.

· CUTTER C. N. (2000). Antimicrobial effect of herb extracts against Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, and Salmonella typhimurium associated with beef. Journal of Food Protection. 63, 601-607.

· DABBAH R., EDWARDS V. M., MOATS W. A. (1970). Antimicrobial action of som e citrus fruit oils on selected food-borne bacteria. Applied Microbiology. 19, 27-31.

· DAWIDOWICZ A. L., WIANOWSKA D., BARANIAK B. (2006).The antioxidant properties of alcoholic extracts fro m Sambucus nigra L. (anti oxidant properties of extracts). Lebensmittel-
Wissenschaft und Technologic. 39, 308-315.

· DEANS S. G. et RITCHIE G. A. (1987). Antimicrobial pr operties of plant essenti al oils. International Journal of Food Microbiology. 5, 165-180.

· DELARRAS C. (2007), Microbiologie Pratique pour le laboratoire d' analyses ou de contrôle sanitaire. Edition Tec & Doc, Lavoisier, Paris.

· DE MASI L., SIVIERO P., ESPOSITO C., CASTALDO D., SIANO F., LARATTA B. (2005). Assessment of agronomic, chemical and genetic variability in common basil (Ocimum basilicum L.). European food research technology. 223, 273-281.

· DEMIRCI F., GUVEN K., DEMIRCI B., DADANDI M.Y., BASER K.H.C. (2008). Antibacterial activity of two Phlom is essential oils against food p athogens. Food Control. 19, 1159- 1164.

· DIDRY, N., DUBREUIL L. (1993). Activité antibactérienne du th ymol, du carvacrol et de l'aldehyde cinnamique seuls ou associés. Pharmacize. 48, 301-304.

· DJENANE D., SANCHEZ E., BELTRAN J.A., RONCALES P. (2001). Extraction of the retail display life of fresh beef pack aged in modified atmosphere by varying lighting conditions. Journal of Food Sciences. 66, 181-185.

· DJENANE D., MEDDAHI A., RONCALES P. (2006). Les sy stèmes antioxydants et antimicrobiens pour la conservation de la viande. Sciences des aliments. 26, 37-73.

· DORMAN H. J. D. et DEANS S. G. (2000). Antimicrobial agents fro m plants: Antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology. 88, 308-316.

· ENRICO V., PAPINI A., BALDO F., ZHAN J. M. (2004). Étude expérimentale du renfort de l'immunité par le sirop du père Michel (POE 20). Institut de Sciences Naturopathiques (ISN) .
C.R.A.O.

· ERKAN N., AYRANCI G., AYRANCI E. (2008). Anti oxidant acti vities of ro semary (Rosmarinus Officinalis L.) extract, blackseed ( Nigella sativa L.) es sential oil, carn osic a cid, rosmarinic acid and sesamol. Food Chemistry. 110, 76-82.

? EUZEBY J.P. (2008). Dictionnaire de bactériologie vétérinaire. http://www.bacdico.net.

· FARAG R.S., BADEI A.Z.M.A., ELBAROTY G.S.A. (1989). Antioxidant Activity of Some Spice Essential Oils on Linoleic Acid Oxydation in Aqueous Media. J. Am. OU. Chem. Soc. 66, 792.

· FAUCHERE J.-L., AVRIL J.-L. (2002). Bactériologie générale et médicale. Ellipses éditent, Paris, pp 365.

· FREEMAN L., CAREL Y. (2006). Aromathérapie. NUTRA NEWS Science, Nutrition, Prévention et Santé. http:/ www. nutranews.org

· GARNERO J. (1978). L'évolution des méthodes et techniques d'analy se dans l' étude de la composition chimique des huiles essentielles. Labo-pharma Problèmes et Techniques n° 277.

· GHEDIRA K. (2006). La nigelle cultivée : Nigeila sativa L. (Ranunculaceae). Phytothérapie. 5, 220-226.

· GIORDANI R., KALOUSTIAN J. (2006). Action anticandidosique des huiles es sentielles : leur utilisation concomitante avec des médicaments antifongiques. Phytotherapie. 3,121-124.

· GORDON R. E., HAYNES W. C., PANG C.H.N. (1973). The genus Bacillus. Agri culture Handbook. N° 427, ARS-USDA, Washington (USA).

· GUÉRIN P.J., BRASHER C., BARON E., MIC D., GRIMONT F., RYAN M. AAVITSLAND P., LEGROS D. (2004). Case management of a multidrug-resistant Shigella dysenteriae serotype 1 outbreak in a crisis context in Sierra Leone, 1999-2000. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 98,635-643.

· GUESMI A. et BOUDABOUS A. (2006). Activité antim icrobienne de cinq huiles essentielles associées dans les produi ts de thalassothérapie- les Plantes à Parfum, aro matiques et médicinales. Faculté des Sciences de Tunis, Université Tunis - El Manar, 2092, Tunis.

· HALUK J. P. (2005). Les arbres à parfums. Bulletin de l'Académie Lorraine des Sciences, Nancy (France) 4-32.

· HAMMER K.A., CARSON C. F., RILEY T.V. (1999). Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. J. Appl. Microbiology. 86, 985-990.

· HAY R., K.M., WATERMAN PETER G. (1993). Volatile Oil Crops, Their Biology Biochemistry and Production. Longman Scientific & Technical, U.K.

· HELANDER I. M., ALAKOMI H. L., LATVA-KALA K., MATTILA-SANDHOLM, T., POL I., SMID E. J. (1998). Characterization of the action of sel ected essential oil components on gram-negative bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 46, 3590-3595.

· HELME J.-P., CHAZAN J.-B., PERRIN J.-L. (2004). Les antioxydants.

· HERMAL C. (1993). Activité bactériostatique de sept ém ulsions d'huiles essentielles et de deux associations d'émulsions d'huiles essentielles, Faculté de Pharmacie, Université de Montpellier.

· HERNANDEZ R. et OCHOA L. (2005). Substitution de solvants et matières actives de synthèse par un combine « solvant/actif » d'origine vé gétale. Thèse de doctorat- l'institut national
polytechnique de Toulouse (France), 32-225.

· HOET S., STEVIGNY C., HERENT M.F., QUETIN-LECLERCQ J. (2006). Antitrypanosomal compounds from leaf essential oil of Strychnos spinosa. Planta Med. 72, 480-482.

· HUBERT R. et MULTON J. L. (1992). Les arômes alimentaires. Tec & Doc. Lavoisier- Paris.

· HURTEL J. (2006). Huiles ess entielles et médecine. Phytothérapie, pl antes médicinales, aromathérapie, huiles essentielles. Phytomania.

· HURTEL J.M. (2001). Phytothérapie, plantes m édicinales, aromathérapie, huiles essentielles. http://www.phytomania.com/index.html.

· INOUYE S. et ABE S. (2007). Nouvelle approche de l'aromathérapie anti-infectieuse. Phytothérapie. 1, 2-4.

· IPEK E., ZEYTINOGLU H., OKAY S., TUYLU B.A., KURKCUOGLU M., HUSNU C.B.K. (2005). Genotoxi city and anti genotoxicity of Origanum oil and carv acrol evaluated b y Ames Salmonella/microsomal test. Food Chem. 93, 551-556.

· JOLY B. et REYNAUD A. (2002). Entérobactéries : Systématique et Méthode de diagnostic. Tec & Doc, Lavoisier.

· JOUHANNEAU D.G. (2000). La médecine des plantes aro matiques : phy to-aromathérapie et les huiles essentielles de l'océan indien. Azalées Edition, St Denis.

· JOUVE J. L. (1990). Microbiologie alimentaire et filière des viandes. Viandes et Produits Carnés, 11; 6 ; bis 6 ter, 207-213.

· KABERA J, KOUMAGLO K. H., NTEZURUBANZA L., INGABIRE MG., KAMAGAJU L. (2002). Caractérisation des huiles essentielles d' Hyptis spicigera Lam., Pluchea ovalis (Pers.) DC. et Laggera aurita (L.F.) Benth. Ex. C.B. Clarke, plantes aromatiques tropicales. Centre de Recherche en Pytomédicaments et Sciences de la Vie (Butare -Rwanda).

· KARAPINAR M. et ARTUG S.E. (1987). Inhibition of f ood borne pa thogens by t hymol, eugenol, menthol. International Journal of Food Microbiology. 4, 161-166.

· KELEN M. et TEPE B. (2008). Chemical composition, antioxidant and antimicrobial properties of the essential oils of three Salvia spe cies from Turkish flora. Bioresource Technology. 99, 4096- 4104.

· KIM J.M., MARSHALL M.R., CORNELL J.A., WEI C.I. (1995a). Antibacterial activity of carvacrol, cit ral and geran iol against Salmonella Typhimurium in culture medium and on fish cubs. Journal of Food Science. 60, 1364-1374.

· KIM J.M., MARSHALL M.R., CORNELL J.A., WEI C.I. (1995b). Antibacterial activity of some essential oil components against five food borne pathogens. Journal Of Agricultural and Food Chemistry.43, 2839-2845.

· KOOHMARAIE M., ARTHUR T.M., BOSILEVAC J.M., GUERINI M., SHACKELFORD S.D., WHEELER T.L. (2005). Post-harvest interventions to reduce/eliminate pathogens in beef. Meat Science. 71, 79-91.

· KOTZEKIDOU P., GIANNAKIDIS P., BOULAMATSIS A. (2008). Antimicrobial act ivity of some plant extracts and essential oil s against f oodborne pathogens in vitr o and on t he fate o f inoculated pathogens in chocolate. LWT. 41, 119-127.

· LABIE C. (1993). Problemas en los cambios intracommunitarios de la carne. Eurocarne, 21, 19- 28.

· LAMBERT R. J. W., SKANDAMIS P. N., COOTE P., NYCHAS G.-J. E. (2001). A study of the m inimum inhibitory concentration and m ode of action of oregano essential oil, thy mol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology. 91, 453-462.

· LAHLOU M. (2004). Methods to study phytoc hemistry and bioactivit y of essential oils. Phytotherapy Research. 18, 435-448.

· LAMBERT R. J. W., SKANDAMIS P. N. (2001). A stud y of the minimum in hibitory concentration and mode of action of or egano essential oil, thy mol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology. 91- 3, 453-462.

· LAMARTI A., BADOC A., DEFFIEUX G., CARDE J.-P. (1994). Biogénèse des monoterpènes. Bull. Soc. Pharm, 13 3, 79 - 9 9. Département de Biologie , Faculté des Sciences Mhanach II, Tetouan (Maroc).

· LAREDJ H. (2004). Les plantes médicinales: Extracti on des huiles essent ielles et acti vités antibactériennes. Premières journées de pharm acie. Université, Badji Mokhtar -Faculté de Médecine, Annaba (Algérie). 17-29.

· LARPENT J.P. (1997). Microbiologie Alimentaire, Techniques de laboratoire. Tec & Doc, Lavoisier, pp 1074.

· LAVIGNE J.P. (2007). Effet des antib iotiques, mécanismes de r ésistance. 1^er cycle - PCEM 2 - MB7 - Bactériologie- Faculté de Médecine Montpellier-Nîmes, France.

· LAWRENCE B.M. (1992). Perfumer Flavorist. 13, 46-52.

· LEUSCHNER, R. G. K., LELSCH V. (2003). Antimicrobial effects of garlic, clove and red hot chilli on Listeria monocytogenes in broth model systems and soft cheese. International Journal of food Sciences and Nutrition. 54, 127-133.

· LEYRAL et VIERLING (2001). Microbiologie et toxicologie des ali ments, h ygiène et séc urité alimentaires, 3° édition.

· LIQUET J., WEYNANS B. (2002). Les différentes visions des arômes alimentaires.52-103.

· LINDBERG M. (1996). Lebensm. Unters. Forsh. 203, 333-338.

· TURGEON M. (2001). Profil des produits forestiers. Première transformation : huiles essentielles. Ministère des Ressources naturelles, Québec (Canada). 5-21.

· MAHBOUBI M. et HAGHI G. (2008). Antim icrobial activity and chem ical co mposition of Mentha pulegium L. essential oil. Journal of Ethnopharmacology. 119, 325-327.

· MAHMOUD B. S. M., YAMAZAKI K., MIYASHITA K., IL-SHIK S., DONG-SUK C., SUZUKI T. (2004). Bacterial microflora of carp ( Cyprius carpio) and its shelf-life extension by essential oil compounds. Food Microbiology. 21, 657-666.

· MAINEBAU P. (1994). La nouvelle Aromathérapie, 2ème édition Jakin, Paris.

· MAMADOU D.A. (2005). Étude des plantes médicinales de Niafunke (région T ombouctou), phytochimie et pharmacologie de maerua crassifolia forsk. (Capparidacée). Thèse doctorale - Faculté de Médecine, de Pharmacie et d'Odonto-Stomatologie (Mali). 50-140.

· MARTIN R., SALGUEIRO L.R., GONCALVES M.J., VILA R., TOMI F., ADZET T., CASANOVA J. (2000). Activity and chem ical composition of the bark oil of Croton stellulifer. Planta Medica. 66, 647-650.

· MATAN N., RIMKEEREE H., MAWSON A.J., CHOMPREEDA P., HARUTHAITHANASAN V., PARKER M. (2006). Antimicrobial activity of cinnamon and clove oils under modified atm osphere conditions. International Journal of Food Microbiology. 107, 180 - 185.

· MAU J-L., HUANG S-J, CHEN C.-C. (2004). Antioxidant properties of methanolic extracts fron two kinds of Antrodia camphorate mycelia. Food Chemistry. 86, 25-31.

· MENPHINI A. (1993). Riv. Ital. EPPOS 4. 566-571.

· MERENS A. (2008). Facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa. Saint-Mandé, Lyon. pp

· MEZAOUR N. (2006). Contribution à l'étude de l'effet antibactérien des polyphénols et des huiles essentielles d'Allium sativum sur quatre genres bact éries. Thèse de Magister. Faculté des s ciences de l'ingénieur, Université Abdelhamid Ibn Badis de Moustaghanem, (Algérie).

· MICROSOFT ENCARTA (2008).

· MOCKUTE D., BERNITIENE G., JUDZENTIENE A. (2006). Germacrene D c hemotype of essential oils of Leonurus cardiaca L. growing wild in Vilnius district (Lithuania). Journal of essential oil research. 18, 566-568.

· MOLEYAR V., NARASIMHAM P. (1992). Antibacterial activity of essential oil com ponents. International Journal of Food Microbiology. 16, 337- 342.

· MOMPON B. (2006). Procédés d'extr action et de purification des produits d 'origine natu relle, Québec (Canada).

· MURATA M., YAMAKOSHI Y., HOMMA S., AIDA K., HORI K., OHASHI Y. (1990). Macrocarpal A, a novel antibacterial compound from Eucalyptus globulus. Agricultural and Biological Chemistry. 54, 3221-3226.

· MURATA M., YAMAKOSHI Y., HOMMA S., ARAI K., NAKAMURA Y. (1992). Macrocarpals, antibacterial co mpounds from Eucalyptus, i nhibit aldose reductase. Bioscience,
Biotechnology and Biochemistry. 56, 2062-2063.

· NAIT SAID N. (2007). Étude phy tochimique des extraits chloroformiques des plantes: « pituranthos chloranthus » et « marrubium vulgare ». Thèse de Magister, Faculté des Sciences, Département de Chimie, Université El-Hadj Lakhdar - Batna, (Algérie).

· NAMIKI M. (1990). Anti oxydants / a ntimutagens in food Critic al reviews in Food. Science et nutrition. 29, 273-300.

· NÉPOMUSCÈNE M. J. (1995). Caractérisation des huiles essentielles du ble uet nain, vaccinium angustifolium aiton. Thèse Magistrale, Université du Québec à Chicoutimi (Canada).

· ODOUL M. (2003). La lettre de l' Institut français de Shiatsu : Les Huiles E ssentielles. Numéro hors série de l'Institut français de Shiatsu N° 02. 6-12.

· OKE F., ASLIM B., OZTURK S., SENOL A.S. (2008). Essential oil composition, antimicrobial and antioxidant activities of Satureja cuneifolia Ten. Food Chemistry. 112, 874-879.

· OSAWA K., SAEKI T., YASUDA H., MORITA H., TAKEYA K., ITOKAWA H. (1998). Antibacterial activity of Eucalyptus g lobulus o n cariogenic bacteria and its inhibitor y effect on glucosyltransferase. Natural Medicines (Tokyo). 52, 32-37.

· OURAÏNI D., AGOUMI A., ISMAÏLI A.M., ALAOUI K., CHERRAH Y., ALAOUI M.A., BELABBAS M.A. (2007). Activité antifongi que de l' acide ol éique et des huiles essentielles de Thymus saturejoides L. et de Mentha pulegium L., com parée aux antifongiques dans les derm atoses mycosiques. Phytothérapie. 1, 6-14.

· OUSSALAH M., CAILLET S., SAUCIER L., LACROIX M. (2007), Inhibitory effects of selected plant essential oils on the gr owth of four pathogenic bacteria: E. coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Food Control. 18, 414-420.

· PALLERONI N.J. (1984). Genus I. Pseudomonas Migula. http://www.bacdico.net.

· PALMER S., STEWART A., FYFE J.L. (1998). Antimicrobial properties of plant essentia l oils and essences against five i mportant food-borne pathogens. Letters in Food Microbiology. 26, 118- 122.

· PALMER S., STEWART A., FYFE, L. (2001). The potential application of plant essential oils as natural food preservatives in soft cheese. Food Microbiology. 18, 463- 470.

· PAPARELLA A., TACCOGNA L., AGUZZI I., CHAVES-LÓPEZ C., SERIO A., MARSILIO F., SUZZI G. (2008). Flow cy tometric ass essment of the anti microbial ac tivity of essential oils against Listeria monocytogenes. Food Control. 19, 1174-1182.

· PARIS M. et MURABIELLE H. (1981). Abrégé de Matière médicale. Pharmacognosie. Tome I Masson, Paris, 182-194.

· PEDNEAULT K., LEONHART S., ANGERS P., RAMPUTH A., ARNASON J.T., DORAIS M. (2001). Influence de la culture h ydroponique de quelques plantes médicinales sur la croissance et la concentration en composés secondaires des organes végétaux. Texte de conférence - 5 ^ème Colloque sur les produits naturels d'origine végétale. Université Laval, Québec (Canada).

· PEIFFER B. (2000). Intoxications causées par bacillus cereus. file http://www.bacillus cereus.htm

· PEYRON L. et HUBERT R. (1992). L'extraction des épices et herbes aromatiques et le s
différents types d'extraits. Epices et aromates. Tec et Doc - Lavoisier, APRIA., Paris.

· PIBIRI M.C. (2005). Assainissement microbiologique de l' air et des sy stèmes de ventilation au moyen d' huiles essentielles. Thèse de doctorale. Ecole poly technique fédé rale, EPFL. Lausanne
(Suisse).

· PONCE A.G., FRITZ R., DEL VALLE C., ROURA S.I. (2003). Antimicrobial activit y of essential oils on the native microflora of organic Swiss chard. 36, 679-684.

· RASOOLI I., BAGHER R.M., ALLAMEH A., (2006). Growth inhibition and morphological alterations of Aspergillus Niger by essential oils from Thymus Eriocalyx and Thymus x-porlock. Food Control. 17, 359-364.

· RAYOUR (2003). Mechanis m of ba ctericidal action of oregano and clove essential oils and of their phenolic major components in Escherichia coli and Bacillus subtilis, The Journal of Essential oil Research. 86, 985-990.

· RAZZAGHI A. M., SHAMS G.A.M., YOSHINARI T., REZAEE M.B., JAIMAND K., NAGASAWA H., SAKUDA S. (2008). Inhibitory effects of Satureja hortensis L. essential oil on growth and aflatoxin production b y Aspergillus parasiticus. International Journal of Food Microbiology. 123, 228-233.

· ROTA R.M., HERRERA A., MARTÍNEZ R.M., SOTOMAYOR J. A., JORDÁN M.J. (2008). Antimicrobial act ivity and che mical co mposition of Thymus vulgaris, Thymus zygis and Thymus hyemalis essential oils. Food Control. 19, 681-687

· SAGDIÇ O., KUSÇU A., ÖZCAN M., ÖZÇELIK S. (2002). Effects of Turkish spice extrac ts at various concentrations on the growth of Escherichia coli. Food Microbiology. 19, 473-80.

· SERRANO M., MARTINEZ-R.D., GUILLEN F., VALVERDE J. M., ZAPATA P. J., CASTILLO S., VALERO D. (2008), The addition of essential oils to MAP as a tool to maintain the overall quality of fruits. Trends in Food Science & Technology. 1-8.

· SCHWAMMLE B., WINKELHAUSEN E., KUZMANOVA S., STEINER W. (2001). Isolation of carvacrol assimilating microorganisms. Biotechnol. 39, 341-345.

· SKOÈIBUIÆ M., BEZIÆ N., DUNKIÆ V. (2006). P hytochemical co mposition an d antimicrobial activities of the essential oils from Satureja subspicata Vis. Growing in Croatia. Food Chemistry. 96, 20-28.

· SLUSARENKO J., KEVAN A., CROFT P. C., JIITTNER F. (1993). Volatile Products of Lipoxygenase Pathway Evolved from Phaseolus vulgaris (L.) Leaves Inocula ted with Pseudomonas syringae pv phaseolicola. Plant Physiol. 101, 13-24.

· TEPE B., SOKMEN M., SOKMEN A., DAFERERA D., POLISSIOU M. (2005). Antimicrobial and antioxidative activity of the essential oil and various extracts of Cyclotrichium
origanifolium (Labill.) Manden. and Scheng. J. food engineering. 69, 335-342.

· TEUSCHER E., ANTON R., LOBSTEIN A. (2005). Plantes aro matiques : épices, aro mates, condiments et huiles essentielles, Ed. Française Tec & Doc., Lavoisier.

· THOROSKI J., BLANK G., BILIADERIS C. (1989). Eugenol ind uced inhi bition o f extracellular enzyme production by Bacillus cereus. Journal of Food Protection. 52, 399- 403.

· TREINER J. (2000). Extrait du Bulletin officiel n° 6 du 12 août 1999, France. 39-143.

· ULTEE R., SLUMP A., STEGING G., SMID E.J. (2000). Antimicrobial activity of ca rvacrol toward Bacillus cereus on rice. Journal of Food Protection. 620-624.

· VALERO M. et GINER M.J. (2006), Effects of antim icrobial components of essential oils on growth of B acillus cereu s INRA L2104 i n an d the sensory qualities of carrot broth. International Journal of Food Microbiology. 106, 90 - 94.

· VERRECK J. (2007). Journées portes ouvertes à l'ISIa de Gembloux (Belgique).

· VIAUD H. (1993), Thérapeutiques naturelles- Cara ctérisation des huiles esse ntielles d' Hyptis spicigera Lam, Pluchea ovalis - GNOMA .

· WALSH, S. E., J.-Y. MAILLARD et al., (2003). Activity and mechanisms of action of selected biocidal agents on Gram -positive and negative bacteria. Journal of Applied Microbiology. 94-2, 240- 247.

· WENDAKOON C. N., SAKAGUCHI M. (1993). Combined effect of sodium chloride and clove on gr owth and b iogenic amine form ation of Enterobacter aerogenes in m ackerel muscle extract. Journal of Food Protection. 56, 410-413.

· ZWEIFEL C., BALTZER D., STEPHAN R. (2005). Microbiological contamination of cattle and pig carcasses at five abatt oirs determined by swab sampling in accordance with EU Deci sion. Meat Science. 69, 559-566.

· IX ème congrès International des Huiles Essentielles de Singapour, Parf. Cosmet., Arômes, 1983, 53,63-73

- Les graphiques sont réalisés au m oyen du logiciel commercialisé Microsoft^® Office Exce l® 2007 (12. 0. 4518 . 1014) MSO (12.0. 4518 . 1014). Partie de Microsoft Office Professional Plus 2007.

- Le logiciel de traitement d'image qu'on a utilisé est Photo Filtre 6.3.1 pour Windows. - Le logiciel de statistique Stat box version 6.0.

ANNEXES

ANNEXE 01: Composition des principaux milieux de culture utilisés > Milieux liquides

· Eau physiologique stérile

L'eau utilisée pour la préparation de l'eau physiologique est de l'eau distillée. La concentration de Na Cl est de 9 g/L, et la solution est stérilisée à l'autoclave 15 minutes à 121 °C.

· Milieu BHIB (BRAIN HEART INFUSION) CM 225 La formule théorique de ce milieu de culture en g/L d'eau purifiée est :			Culf brain infusion solids
12,5 ;		Beef heart infusion solids
5,0 ;		Proteose peptone
10,0 ;		Glucose
2,0 ;		Sodium chloride
5,0 ;		Di-sodium phosphate
..2,5.

> Milieux solides

· Gélose Mueller Hinton La formule théorique de ce milieu de culture en g/L d'eau purifiée est :			Beef, infusion Form
300,00 ;		Casein acid hydrolysate
.17,50 ;		Starch
.1,50;		Agar
17

pH 7,3

· Gélose nutritive

La formule théorique de ce milieu de culture en g/L d'eau purifiée est :

Peptic digest of animal tissue		5,0 ;	Beef extract
1,50;		Yeast extract
.1,50;

Sodium chloride 5,0 ;

Agar 15,00.

pH 7,4

· Gélose Chapman

La formule théorique de ce milieu de culture en g/L d'eau purifiée est :

Extrait de viande (bovin ou porcin) 01 ;

Peptone de caséine et de viande (bovin et porcin) .10 ;

Chlorure de sodium .75;

D-Mannitol ...10;

Agar 15;

Rouge de phénol 0,025.

pH 7,4

· Gélose de Baird-Parker La formule théorique du milieu complet en g/L d'eau purifiée est :

Peptone de caséine (bovin) 10 ;

Extrait de viande (bovin) 05 ;

Extrait de levure 01 ;

Glycine 12 ;

Chlorure de lithium .05 ;

Pyruvate de sodium 10 ;

Tellurite de potassium 00,01.

Suspension de jaune d'oeuf 10 mL

Agar 17,00.

pH 7,2

· Bouillon lactosé au bromocrésol pourpre : BCP La formule théorique du milieu complet en g/L d'eau purifiée est :
Peptone	.5
Extrait de viande	3
Lactose	10
Agar	15
Pourpre de bromocrésol	.0,025

pH 7,2

ANNEXE 02

Tableau XXII : Résultats des antibiogrammes.

Souche ATB	S. aureus	E. coli	S. flexneri	S. paratyphi A
Pénicilline	00,00	non déterminée	non déterminée	non déterminée
Kanamycine	non déterminée	17,25	17,30	16,50
Ticarcilline	non déterminée	09,47	11,07	10,30

ANNEXE 03