II.2.3.4 Dosage de l'urée (méthode
enzymatique à l'uréase)
II.2.3.4.1 Principe
C'est une méthode enzymatique et colorimétrique
basée sur l'action spécifique de l'uréase qui hydrolyse
l'urée en carbonate et en ions ammonium. Les ions ammonium forment
ensuite avec le chlore de salicylate un complexe coloré bleu-vert.
L'intensité de coloration, proportionnelle à la concentration en
urée dans le spécimen est mesurée à 600nm (BIOLABO,
2011).
CO (NH2)2 + H2O
--uréase----> 2NH3 + CO2
Urée Eau Ammoniac Dioxyde de carbone
L'Urée présent dans le sang est dosée
à partir de l'Uréase contenue dans le réactif.
IV.2.3.4.2 Mode opératoire
L'urée sanguine est réalisée chez les
sujets à jeûne depuis 10 heures environ. Le dosage de
l'urée se fait sur le sérum non hémolysé, non
contaminé ou ayant subi plus d'une décongélation. Le
sérum doit être séparé du culot globulaire dans les
2 heures qui suivent le prélèvement.
Les réactifs
Les réactifs et les échantillons doivent
être équilibrés à la température ambiante
pendant 10 à 20 min avant usage:
Flacon R1 : il est constitué du salicylate de
concentration égale à 31mmol /l et du nitroprussiate à
concentration égale à 1.67mmol/l.
Flacon R2 (Urease) : il est constitué d'urease
à une concentration = 15KU/l. Flacon R3 (étalon) : notre
étalon est l'urée à une concentration égale
à 0.40 g /l.
Pour préparer la solution de travail, il est
nécessaire d'ajouter le contenu du flacon R2 dans le flacon R1 puis,
homogénéiser l'ensemble par retournements lents. Le contenu peut
rester stable jusqu'à 1 mois en absence de toute contamination à
une température comprise entre 2 et 8°C. Il est nécessaire
de transvaser dans un récipient la quantité nécessaire du
flacon R3 à utiliser afin de ne pas risquer de la contaminer. Utiliser
le blanc et l'étalon pour une série d'analyse. Ainsi, pour le
premier échantillon à doser, pipeter dans chacun des trois tubes
à essai différents (blanc, étalon, et le premier
échantillon) 1ml de la
Mémoire de Master en Biologie Clinique
rédigé par: MIMBOE BILONGO CELINE SYLVIE
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Filtration glomérulaire chez des patients
diabétiques et/ou hypertendus suivis à l'Hôpital de
district de la Cité Verte:
dosages de la créatinémie,
protéinurie et urémie
solution de travail (R1+R2). Ensuite, ajouter 10ul d'eau
distillée dans le tube du blanc, 10ul de l'étalon (R3) dans le
tube du standard et 10ul de notre spécimen dans le troisième tube
puis, lire l'absorbance à 546nm. La concentration de l'urée
contenue dans le sérum sera calculée automatiquement (BIOLABO,
2011). Le tableau 4 présente les volumes requis pour le dosage.
Tableau 4 : Mode opératoire du dosage de
l'Urémie (BIOLABO, 2011).
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Blanc réactif
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Standard
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Echantillon
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Salicylate + Urease (R1 + R2)
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1000ul
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1000 ul
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1000 ul
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Etalon
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-
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10ul
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-
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Sérum
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-
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-
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10ul
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Après calibration par l'étalon du coffret (R4)
ou tout calibrant traçable sur une méthode standardisée et
introduction du sérum de contrôle fourni par le fabriquant ; les
échantillons homogénéisés sont passés au
spectrophotomètre en deux essais et lues à 600 nm (BIOLABO,
2011).
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