ANNEXE II
Protocole d'électrophorèse sur le gel de
polyacrilamide
1- Traitement des plaques
Avant les traitements, nettoyer soigneusement les deux plaque 3
fois avec l'eau distillée puis de l'alcool absolu.
a- Traitement de la plaque fixe
+ Traiter la plaque avec 1450 ul de Sigma cote pour ne pas
coller le gel (en y versant 2 fois 725 ul).
+ Après 10 minutes essuyer légèrement avec
papier sec (essuie tout) pour enlever l'excès du produit.
b- Traitement de la plaque mobile
+ Mettre 650 ul de solution Bind Silane pour coller le gel (1485
ul éthanol + 7,5 ul Acide Acetique + 7,5 ul Bind Silane).
+ Puis l'étaler rapidement (car il s'agit d'un
mélange volatile) à l'aide d'un papier sec (essuie tout).
+ Après 5 minutes essuyer 3 fois avec l'éthanol
absolu.
2- Préparation du moule
+ Mettre les espaceurs propres sur la plaque fixe, en
évitant de toucher la face traitée.
+ Puis poser la face traitée de la plaque mobile sur
l'autre plaque (sans permettre aux deux plaques de se toucher).
+ Mettre les pinces pour fixer horizontalement les deux
plaques.
+ Monter la plaque d'étancheté et bien vicer (de
façon à ne pas laisser le gel couler vers la base de plaques).
3- Préparation et écoulement du
gel
+ Mettre dans un erlenmayer, 18 ml polyacrylamide (40% ) = (38
g acrylamide + 2 g bisacrylamide dans 100 ml TBE (1x)) dans 50,2g urée
préalablement pesé + 24 ml TBE (5x).
+ Puis ajouter 20 ml eau distillée.
+ Chauffer jusqu'à la dissociation complète de
l'urée.
+ Laisser refroidir puis compléter avec l'eau
jusqu'à 120 ml.
+ Pour la polymérisation on ajoute simultanément et
rapidement 400 ul de Persulfate d'ammonium (0,1 g dans 1 ml eau
distillée) et 70 ul TEMED.
+ Verser rapidement la solution dans la seringue puis couler
rapidement le gel entre les plaques en faisant attention de ne pas former des
bulles d'air.
+ Laisser le gel polymériser 30 - 45 minutes.
+ Monter le dispositif pour une premigration 45 minutes.
+ Mettre le bleu dénaturant et faire une
dénaturation au thermocycleur pendant 8 minutes à une
température de 95 °C puis mettre les produits PCR au moins 10
minutes à -20°C.
+ Charger les produits avec un volume 10-12 ul par puit.
4- Coloration et révélation
a- Fixation du gel
+ Mettre la plaque mobile dans une solution d'Acide
Acétique 10% avec l'eau distillée froide.
+ Laisser la plaque sur agitation douce pendant 30 minutes.
+ Rincer avec la plaque 3 fois avec l'eau distillée
froide.
b- Coloration nitrate d'argent
+ Ajouter à la solution nitrate d'argent (2 g dans 2
litres eau distillée) 3ml de formaldéhyde et mettre la plaque
dans cette solution 30 minutes sous agitation douce.
+ A la fin de ces 30 minutes on ajoute 3ml de
formaldéhyde et 400 ml de Thiosulfate de sodium (0,1g dans 1ml eau
distillée) à la solution carbonates sodium (CaCo3) (60 g dans 2
litres eau distillée) pour révéler les bandes.
+ Mettre la plaque dans cette solution et agiter doucement
manuellement jusqu'à l'apparition des bandes.
+ Ajouter l'Acide Acétique 10% pour fixer les bandes
pendant 5 à 7 minutes. + Rincer avec l'eau distillée 3 à 5
minute.
+ Sortir la plaque pour la sécher.
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