VIII.2.4. Agglutination sur latex
Les billes de latex, gélatine ainsi que les Globules
Rouges (GR) peuvent jouer le rôle de particules
révélatrices de la présence des Ac qui vont agglutiner les
Ag recouvrant leur surface. Le recours à l'agglutination dépend
de la disponibilité de l'Ag purifié (Chapel et al.,
2004).
Les tests d'agglutination au latex sont
particulièrement utiles pour les Laboratoires de soins de santé
primaires, car ils sont simples et les résultats sont faciles à
interpréter. Depuis 1982, plusieurs études comparatives des tests
commerciaux d'agglutination au latex pour la détection des Ac de la
rubéole ont été signalées ( León et
al, 1988).
La sensibilité et la spécificité du test
d'agglutination au latex étaient de 100% et 94% (Weissfeld et
al., 1982).
ISTMT-IPT 2012-2013
19
VIII.2.5. Hémolyse Radiale (HR)
Dans le test HR pour les Ac spécifiques du virus de la
rubéole, les sérums obtenus peu après la primo-infection
produisent une perturbation appelée «hémolyse
ménagée». L'hémolyse ménagée est
provoquée par un Ac IgG contre le virus de la rubéole et
représente un nouveau principe de sérodiagnostic. Cette
technique, à coté du dosage des IgM, permet le diagnostic rapide
de la rubéole récente, sur un échantillon unique de
sérum (Hedman et al., 1986).
VIII.2.6. Test de neutralisation
La neutralisation du virus est définie comme la perte
de pouvoir infectieux due à la réaction d'un virus avec un Ac
spécifique.
La neutralisation peut être utilisée pour
identifier le virus isolé ou comme dans le cas du diagnostic de
rubéole de mesurer la réponse immunitaire au virus.
Comme un test fonctionnel, la neutralisation s'est
avérée très sensible, technique spécifique et
fiable, mais elle ne peut être réalisée que dans des
Laboratoires de virologie qui comprennent seulement une petite fraction des
Laboratoires effectuant la sérologie de la rubéole (Mendelson
et al., 2006).
VIII.2.7. Technique de fixation du
complément
Le principe de la technique de fixation du complément
repose sur le principe que le complément est fixé puis
activé par le complexe (Ac-Ag). Après la
décomplémentation du sérum à tester (pour
éliminer toute source non contrôlée du complément),
ce dernier est mis en présence de l'Ag viral à étudier
avec une quantité définie de complément de cobaye. La
réaction est révélée par l'ajout d'un second couple
(Ac-Ag) constitué de GR revêtus d'Ac anti-GR. Si le sérum
ne contient pas l'Ac spécifique du virus à étudier le
complément pout se fixer sur le second couple et entraine la lyse des
GR, mais si le complément est consommé par le premier couple et
les GR restent intacts. Ainsi l'hémolyse signifie l'absence d'Ac
(Mammette, 2002).
Les Ag spécifiques de la rubéole utilisés
pour la fixation du complément ont été
synthétisés dans des cultures tissulaires de cellules Rabbit
Kidney (RK13) et des cultures primaires de rein de singe vert africain.
Les Ac qui fixent le complément apparaissent chez des
patients atteints de rubéole peu de temps après la fin de
l'éruption et persistent pendant au moins 8 mois (Sever, et
al., 1965).
ISTMT-IPT 2012-2013
20
VIII.2.8. Test d'Inhibition d'hémagglutination
(IHA)
Jusqu'à maintenant, l'évaluation de
l'immunité contre la rubéole et son diagnostic ont
été effectués principalement par le test IHA qui est
basé sur la capacité du virus de la rubéole, à
agglutiner les GR. Le test IHA est un travail intensif, et est actuellement
réalisé principalement par des Laboratoires de
références. IHA est le «gold standard» de test sur
lequel la quasi-totalité de dépistage de la rubéole et
d'autres tests de diagnostic sont mesurés. Pendant le test,
l'agglutination est inhibée par la liaison d'Ac spécifiques
à l'agglutinine virale. Les titres sont exprimés comme la plus
haute dilution inhibant l'hémagglutination dans des conditions d'essais
normalisées (Mendelson et al., 2006).
VIII.2.9. Hémagglutination virale
Les GR humains, ou ceux d'autres animaux peuvent agglutiner le
virus à différentes quantités. Le virus peut être
identifié par l'hémagglutination qui est une méthode
quantitative, rapide et peu couteuse. Ce test mesure le nombre total de
particules virales présentes et peut servir à mesurer la
quantité d'Ac spécifiques (Jawetz et al., 1973).
? Le développement des tests d'hémagglutination
et IHA pour le virus de la rubéole a fourni des outils précieux
pour la détection des Ac dirigés contre ce virus. Ces tests sont
plus rapides et plus faciles à réaliser que le test de
neutralisation pour la détection des Ac par fluorescence, elles
fournissent des informations plus fiables sur la sensibilité que ceux du
test de fixation du complément (Auletta, et al., 1968).
te4e1
1
·4°ee~ d
on
es
0
ISTMT-IPT 2012-2013
21
I. Préparation du local et
matériel
Pour réussir le procédé de culture de
l'hémagglutinine rubéolique il faut d'abord réussir le
procédé de stérilisation et
désinfection du Laboratoire (local et matériel):
? Désinfection du Laboratoire
? Stérilisation du matériel (Les équipements
doivent être nettoyés et entretenus
régulièrement)
? Contrôle de stérilité
I.1. Préparation du local
C'est l'étape primordiale et la plus essentielle.
La stérilisation avec l'alcool 95% ou l'éthanol
à 70% est utilisé pour nettoyer et désinfecter les
paillasses et les équipements du Laboratoire (Microscope inversé,
Hotte, Bain marie, Appareil Roller, Étuve).
I.1.1. Stérilisation de
l'atmosphère
Le formol a été mis dans l'eau chaude (10 ml de
formol ont été mises dans 500ml d'eau bouillie) pour
stériliser le Laboratoire. La vapeur de formol dégagée va
assurer une stérilisation presque totale de tout le Laboratoire et
même des équipements (Hotte, Appareil Roller, Bain marie,
Étuve) qui sont en fonctionnement ou à porte ouvertes.
Un contrôle de stérilité sur boites de
pétris contenant la Gélose nutritive est nécessaire pour
s'assurer de la stérilisation des surfaces et de l'atmosphère.
I.2. Préparation du matériel
Les flacons, verreries, tubes et bouteilles Roller
utilisés lors de la culture cellulaire doivent être lavés
et stérilisés.
Tout le matériel utilisé a été
lavé par un détergent ou désinfectant, séché
dans un four à 60°C avant d'être stérilisé.
I.2.1. Stérilisation du
matériel
La stérilisation du matériel est obligatoire. Elle
peut se faire de deux manières: ? Stérilisation par la
chaleur sèche
? Stérilisation par la chaleur humide
ISTMT-IPT 2012-2013
La stérilisation par la chaleur sèche se fait
grâce au four Pasteur. Les verreries, bouteilles Roller, tubes et flacons
en verre pyrex sont mises 1h à 200°C au four.
La méthode de stérilisation par la chaleur humide
est assurée par l'autoclave.
Tout le matériel (verrerie, tubes, flacons et bouteilles
d'eau distillée...) est mis dans l'autoclave pour une
stérilisation à 120°C pendant 30 min (le cycle dure 2h
tenant compte du temps de chauffage et de refroidissement de l'autoclave).
Le matériel utilisé, les solutions de
contrôle de stérilité (Thioglycolate et Bouillon
Trypto-caséine de soja) et Tryptose phosphate passent par un seul cycle
d'autoclavage avec des températures différentes suivant la notice
des Milieux de culture.
|
I.3. Contrôle de stérilité du
local
Après la désinfection, la Gélose
nutritive a été répartie dans des boites de pétris.
Les boites contenant le Gel sont placées semi ouvertes sur les
paillasses et les équipements de culture (Étuve, Appareil Roller,
Hotte) pendant 30 min puis incubées dans l'Étuve à
37°C pendant 14 jours avec lecture tous les 24 h pour s'assurer de la
stérilité du matériel et du local.
|
|
|
Figure 11: Contrôle de
stérilité
|
II. Matériel utilisé pour la production et
la Validation de l'hémagglutinine (HA) rubéolique
II.1. Appareillage et matériel technique de la
culture cellulaire et test ELISA indirect de type IgG
· Hotte à flux laminaire (TelstarBio II 8)
|
· Étuve à CO2 JOUAN(IGI50)
|
|
· Bain marie(JOUAN)
· Microscope (CK
Olympus
TOXKYO)
22
· Appareil Roller (WHERTON 753680)
|
· Centrifugeuse (sigma 3K30)
|
|
ISTMT-IPT 2012-2013
· Spectrophotomètre lecteur de plaque ELISA (ELISA
MULTISKAN EX)
|
· Étuve d'incubation à 37°C (Memmert)
|
|
· Plaque de microtitration
· Plaque ELISA
· Micropipette multicanaux
II.2. Réactifs chimiques et Tampons pour la
production et Validation de l'HA rubéolique
· Polyéthylène glycol:
PEG6000
· Chlorure de sodium 1M: NaCl
· Tampon Glycine (1M, pH=10)
·
Di-éthyle Ether
· Solution Tween 80
· Tampon
GGB
· Tampon Tacetal (Tampon Acide +Tampon
Alcalin)
· Tampon de lavage PBS-Tween (Phosphate
Buffered saline-Tween)
· Tampon Carbonate/Bicarbonate (0,1M,
pH=9,6)
· Tampon de saturation PBS-Tween-Gélatine
5%
· Conjugué anti IgG humain
· Substrat chromogène OPD
(Orto-
Phénylène Diamine)
· Solution d'arrêt (acide sulfurique
H2SO4 4N)
III. Milieu pour la culture cellulaire
III.1. Milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle
Medium)
Figure 12: Milieu DMEM
23
Le Milieu DMEM (LONZA lab. LOT N 2MB103 CAT BE12-604f) est un
Milieu de culture cellulaire nécessaire au maintien et à la
prolifération des cellules BHK21.
Il s'agit d'un Milieu avec L.Glutamine et 4,5g de glucose. Il
contient plusieurs composantes comme les Vitamines, les acides aminés et
des sels inorganiques.
ISTMT-IPT 2012-2013
Nous avons ajouté au Milieu DMEM plusieurs autres
éléments comme l'Antibiotique (pénicilline et
streptomycine), le Sérum de veau foetal et la Tryptose phosphate, ce qui
va favoriser la croissance cellulaire. Le Milieu DMEM est utilisé
à différentes concentrations: 0%, 2%, 5% et 10% Sérum de
veau foetal (SVF) (annexe 1) selon les étapes de la culture cellulaire
ou au cours de l'inoculation du virus. Lors de la culture cellulaire le Milieu
DMEM est conservé à +4°C (Le Milieu doit être
conservé au froid et l'abri de la lumière).
III.2. Additifs pour Milieu DMEM
? Sérum de veau foetal (SVF)
La présence de Sérum est indispensable pour la
croissance des cellules.
Figure 13: SVF
Le Sérum de veau foetal (SVF) (GIBCO BRL Cat No 10106-060
lab .LOT N40G8843F) possède divers facteurs de croissance qui permettent
la prolifération cellulaire, des hormones, des protéines, des
facteurs d'attachement, comme la fibronectine, qui contribuent à une
bonne adhésion, indispensable à la division cellulaire, et assure
un rôle protecteur.
Le SVF est d'abord décomplémenté à
55°C pendant 30 min pour éliminer son action toxique sans
détruire les protéines. Le SVF doit être conservé
à -20°C et à +4°C après de son utilisation.
? Solution d'Antibiotique (ATB)
Figure 14: Antibiotiques
24
Les Antibiotiques (ATB) (annexe 1) utilisés sont la
pénicilline G et la streptomycine. La pénicilline G (Pharmachim
Bulgaria Lot NO 702321.1H) est utilisée contre les contaminations
bactériennes surtout par les bactéries Gram positives alors que
la streptomycine (Pharmadrug Production GmbH, Lot NO 4140) agit sur certains
bacilles Gram négatifs et certaines cocci Gram positives.
Ces deux ATB sont fournis sous forme de poudre. Ils sont
préparés sous forme de mélange dans 100ml d'eau
distillée.
ISTMT-IPT 2012-2013
Cette solution d'ATB est utilisée pour réduire le
risque de contamination dans la culture cellulaire.
Les solutions d'ATB sont conservées à +4°C.
|
? Tryptose phosphate
La Tryptose phoshate (DIFCO lab LOT 128487) (annexe 1) est un
additif (Vitamine) ajouté au Milieu de culture DMEM. Le pH du Tryptose
phosphate est égal à 7,3.
Nous avons mélangé la Tryptose phosphate avec l'eau
distillée (29,5g/L) puis stérilisé à
l'autoclave.
|
|
Figure 15: Tryptose phosphate
III.2.1. La Trypsine
La Trypsine (GIBCO BRL lab.lot N3055949 Cat N25300-054, flacon de
100ml) est une enzyme utilisée en culture cellulaire pour
détacher des cellules adhérentes sur les flasques de culture.
Figure 16: Trypsine
Le traitement par la Trypsine affecte un peu la viabilité
des cellules. C'est pourquoi l'action de la Trypsine doit être
limitée et inhibée par l'ajout du SVF.
Cette solution est conservée à -20°C et
à +4°C après son utilisation. La Trypsine est activée
à 37°C.
III.2.2. Préparation du Milieu de culture par la
méthode de stérilisation à froid
La stérilisation du Milieu de culture est un
procédé important. Cette étape nous permet d'éviter
la contamination du Milieu. (Elle se fait sous Hotte).
Le Milieu DMEM doit subir une stérilisation à
froid. La pression exercée par la bouteille d'azote pousse le Milieu
DMEM à travers 2 membranes filtrantes de 0,45 et 0,22 um. Ces deux
membranes empêchent le passage des microorganismes.
25
Après la filtration, le Milieu DMEM doit être
reparti dans des flacons et conservé à +4°C.
ISTMT-IPT 2012-2013
26
III.3. Contrôle de stérilité du
Milieu de culture et des additifs
Le Milieu de culture DMEM (0%, 2%, 5% et 10% SVF) et les
autres additifs doivent subir un test de stérilité avant
d'être utilisé en culture cellulaire.
1 ml de chaque lot (Milieu DMEM et additifs) est ajouté
dans 5ml des Milieux de contrôle de stérilité
(Thioglycolate, Bouillon Trypto-caséine soja et Gélose Sabouraud)
avec un Témoin de chaque solution. La lecture des tubes pour la
vérification de la contamination se fait pendant 14 jours à
37°C dans l'Étuve.
Figure 17: Contrôle de
stérilité du Milieu de culture et additifs
? Bouillon Trypto-caséine soja
Le Bouillon Trypto-caséine soja (BIOKAR Lot/Batch 9M577)
(annexe 2) permet de détecter et révéler une contamination
par des germes aérobies.
La lecture pour le contrôle de stérilité se
fait quotidiennement pendant 14 jours.
? Thioglycolate
Le Thioglycolate (Scharlau Ref.03-187) (annexe 2) est
utilisé pour le contrôle et la détection d'une
éventuelle contamination par les bactéries anaérobies.
La lecture pour le contrôle de stérilité se
fait aussi quotidiennement pendant 14jours.
? Gélose Sabouraud
La Gélose Sabouraud a été
préparée est fournie par le Laboratoire général de
L'institut Pasteur de Tunis. C'est un Milieu solide utilisé pour
détecter une éventuelle contamination par les champignons
(levures et moisissures).
L'incubation de la Gélose Sabouraud se fait entre 20
à 25 °C. La lecture du test de stérilité se fait
chaque jour pendant 14 jours.
ISTMT-IPT 2012-2013
27
IV. Production de l'HA rubéolique
IV.1. Matériel biologique
? Lignée cellulaire BHK21
La lignée cellulaire BHK21 va servir de support pour la
culture en masse et la prolifération du virus de la rubéole afin
de produire l'HA. Dans ce projet l'ampoule qui contient les cellules BHK21
passage 123 du 20/4/1996 est congelée dans l'azote liquide.
Les cellules sont maintenues en vie dans l'ampoule qui
contient un Milieu de conservation constitué par SVF et le DMSO
noté aussi diméthylsulfoxyde.
Figure 18: Observation
Microscopique des cellules BHK21
? Souche virale (virus de la rubéole
M33)
Le virus de la rubéole M33 a été
préparé a partir de la cellule souche VERO (lignée
cellulaire dérivant de rein de singe). La cellule VERO donne un ECP en
un temps court. La multiplication virale dans la culture cellulaire peut
être mesurée par une quantification de l'ECP.
La souche M33 (suspension virale préparée a
partir de la cellule VERO) a été fournie du Service de Virologie
Clinique de L'Institut Pasteur de Tunis. Cette souche est utilisée lors
de ce projet pour la production et la Validation de l'HA rubéolique
grâce à la lignée cellulaire BHK21.
IV.2. Procédé de production de l'HA
rubéolique par la technique de culture cellulaire
Les étapes de la culture cellulaire pour la production
de l'HA du virus de la rubéole sont décrites comme suit:
| 
