Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire bhk21

		RÉPUBLIQUE TUNISIENNE MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
		Université de Tunis El Manar Institut Pasteur de Tunis Institut Supérieur des Technologies Médicales de Tunis Mémoire De Projet de Fin d'Études Pour l'obtention de la LICENCE en Biotechnologies Médicales Option: Génie Cellulaire Sujet
		Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire BHK21
		Elaboré par: Encadré par: Ghaith BEN MESSAOUD Pr. Abderrazak MAAROUFI
		Année Universitaire 2012-2013
	RÉPUBLIQUE TUNISIENNE MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université de Tunis El Manar Institut Pasteur de Tunis Institut Supérieur des Technologies Médicales de Tunis Mémoire De Projet de Fin d'Études Pour l'obtention de la LICENCE en Biotechnologies Médicales Option: Génie Cellulaire Sujet
	Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire BHK21
	Elaboré par: Encadré par: Ghaith BEN MESSAOUD Pr. Abderrazak MAAROUFI
	Année Universitaire 2012-2013

DEDICACE

Je dédie ce travail à:
A mes parents
Vous vous êtes dépensés pour moi sans compter. En
reconnaissance de tous les sacrifices consentis pour me
permettre d'atteindre cette étape de ma vie.

A mon frère et à ma soeur

Pour leur affection, compréhension et patience.
Meilleurs voeux de succès dans vos vies et vos études.

A toutes ma famille

Vous avez de près ou de loin contribué à ma formation.
Affectueuse reconnaissance.

Aux membres de l'Association Tunisienne de lutte Contre le
Cancer
Pour leur aide précieuse dans mon travail et le savoir qu'ils
m'ont donné.

A mes amis et camarades de l'ISTMT.

Merci...

REMERCIMENTS

Comme préambule à cette mémoire, je souhaite adresser mes
remerciements les plus sincères aux personnes qui m'ont
apporté leur aide et qui ont contribué à l'élaboration de cette
mémoire ainsi qu'à la réussite de cette formidable année
universitaire.
Je tiens à remercier sincèrement Monsieur Hechmi LOUZIR
directeur général de l'Institut Pasteur de Tunis pour m'avoir
offert l'opportunité d'effectuer ce stage au sein de son
institution.

Mon Encadreur Monsieur Abderrazak MAAROUFI responsable du Service d'Immunotechnologie et Réactifs Biologiques, qui s'est toujours montré à l'écoute et très disponible tout au long de la réalisation de cette mémoire, sa confiance et tous ses conseils

utiles pour la réalisation de ce modeste travail.

J'adresse mes plus sincères remerciements aux membres de
jury qui ont accepté de juger mon travail.

Mes remerciements s'adressent également à Madame Nejia
BEN ALI pour sa générosité et pour la grande patience dont elle
a su faire preuve malgré ses charges professionnelles.

J'exprime ma gratitude à tous le personnel du Service d'Immunotechnologie et Réactifs Biologiques et en particulier à Madame Faten MEZNI, Madame Chedia AOUADHI, Madame Raja REZGUI et Madame Najet HAMMAMI qui ont accepté de répondre

à mes questions avec gentillesse.

Je tiens à remercier le personnel du Service de Virologie Clinique
et Service de Microbiologie Vétérinaire de L'Institut Pasteur de
Tunis pour leurs aides précieuses dans ce travail.
Je tiens à saisir cette occasion pour adresser mes sincères
remerciements et mes profondes reconnaissances à Madame
Halima MAHJOUBI Directrice de l'ISTMT et tous mes Professeurs
qui m'ont aidé pendant ces trois ans en particulier Madame Ines
ZIDI et Madame Ahlem DJEBBI

Introduction 1

Partie bibliographique

I. Maladie de la rubéole 2

II. Caractéristiques cliniques 2

III. Infection par le virus de la rubéole . 3

III.1. La rubéole acquise . 3

III.2. Réinfection rubéolique 3

III.3. La rubéole congénitale . 3

IV. Virus de la rubéole . 4

IV.1. Historique 4

IV.2. Classification du virus de la rubéole ... 5

IV.3. Morphologie du virus .. 6

IV.4. Type et classification antigénique . 6

IV.4.1. Protéines non structurales . 7

IV.4.2. Protéines structurales 7

IV.5. Génome du virus de la rubéole 8

IV.6. Réplication du virus 9

V. Réponse immunitaire ... 10

VI. Epidémiologie et prévention .. 11

VI.1. Epidémiologie 11

VI.2. Prévention et vaccination 12

VI.2.1. Prévention 12

VI.2.2. Vaccination 12

VII. Cellule BHK21 et multiplication du virus de la rubéole à l'échelle cellulaire 13

VII.1. Cellule BHK21 13

VII.2. Multiplication du virus de la rubéole a l'échelle cellulaire 13

VIII. Diagnostic 14

VIII.1.Diagnostic direct 15

VIII.1.1. Recherche du virus par isolement en culture de cellules 15

VIII.1.2. Détection du génome viral . .. 16

VIII.2. Diagnostic indirect 17

VIII.2.1. Centrifugation en gradient de saccharose . 17

VIII.2.2. Mesure de l'avidité spécifique des IgG . .. 17

VIII.2.3. ELISA (Enzyme-Linked-Immuno Sorbent Assay) 17

VIII.2.4. Agglutination sur latex 18

VIII.2.5. Hémolyse radiale (HR) . 19

VIII.2.6. Test de neutralisation . .. 19

VIII.2.7. Technique de fixation du complément 19

VIII.2.8. Test d'Inhibition d'hémgglutination (IHA) 20

VIII.2.9. Hémagglutination virale . 20

Matériel et méthodes

I. Préparation du local et matériel 21

I.1. Préparation du local 21

I.1.1. Stérilisation de l'atmosphère ... 21

I.2. Préparation du matériel 21

I.2.1. Stérilisation du matériel 21

I.3. Contrôle de stérilité du local 22

II. Matériel utilisé pour la production et la Validation de l'hémagglutinine (HA)

rubéolique .. 22

II.1. Appareillage et matériel technique de culture cellulaire et test ELISA indirect

de type IgG 22

II.2. Réactifs chimiques et Tampons pour la production et Validation de l'HA

rubéolique . 23

III. Milieu pour la culture cellulaire . 23

III.1. Milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 23

III.2. Additifs pour Milieu DMEM 24

III.2.1. La Trypsine . 25

III.2.2. Préparation du Milieu de culture par la méthode de stérilisation à froid. 25

III.3. Contrôle de stérilité du Milieu de culture et des additifs . 26

IV. Production de l'HA rubéolique 27

IV.1. Matériel biologique .. 27

IV.2. Procédé de production de l'HA rubéolique par la technique de culture

cellulaire 27

IV.2.1. Décongélation des cellules BHK21 27

IV.2.2. Les différents passages lors de la culture des cellules BHK21 . 28

V. Inoculation du virus M33 30

V.1. Récolte 31

V.2. Extraction de l'HA rubéolique . 31

V.3. Titrage de l'HA rubéolique par la technique d'hémagglutination 31

V.3.1. Etapes de titrage de l'HA 32

VI. Validation du procédé de production de l'HA rubéolique par le test ELISA

indirect type IgG 33

VI.1. Matériel biologique .. 33

VI.2. Principe et étapes du test ELISA . 33

VI.2.1. Principe 33

VI.2.2. Réalisation du test ELISA indirect type IgG 34

Résultats et discussion 37

Conclusion et perspectives 43

Références bibliographiques . 44
Annexes

·	C: Protéine C	·	BHK21: Baby Hamster Kidney
·	E1: Protéine E1	·	RK 13: Rabbit Kidney		·
E2: Protéine E2	·	ECP: effet cytopathique
·	HA: Hémagglutinine	·	HR: Hémolyse Radiale
·	ARN: acide ribonucléique	·	IHA: Inhibition d'hémagglutination
·	S: coefficient de sédimentation	·	ELISA: Enzyme-Linked-Immuno-
			Sorbent-Assay
·	DMSO: diméthysulfoxyde	·	PCR: Polymerase Chain Reaction
·	nm: nanomètre	·	RT-PCR: Reverse Transcriptase
			PCR
·	kDa: kilo Dalton	·	Nested PCR: PCR nichée
·	kb: kilobase	·	DMEM: Dulbecco's Modified Eagle
			Medium
·	IgM: immuglobuline M	·	SVF: Sérum de veau foetal
·	IgG: immuglobuline G	·	ATB: Antibiotique
·	Ig A : immuglobuline A	·	GR: Globules Rouges
·	HLA: Human leukocyte antigen	·	UHA: unité hémagglutinante
·	Ac: Anticorps	·	OPD: Ortho-Phénylène-Diamine
·	Ag: Antigène	·	LIRB: Laboratoire d'Immunotechnologie et Réactifs
			Biologiques

Figure 1: Symptômes de la rubéole ( www.larousse.fr) 2

Figure 2: Un enfant atteint de rubéole congénitale (Lasek-Duriez et al., 2008) 4

Figure 3: Représentation schématique du virus de la rubéole (Guillet, 2010) 6

Figure 4: Virus de la rubéole au microscope électronique (Bienvenu et al., 2004) 6

Figure 5: Représentation du génome de la rubéole (Bienvenu et al., 2004) 9

Figure 6: Réplication du virus de la rubéole (Bienvenu et al., 2004) 10

Figure 7: Cinétique d'apparition des anticorps lors d'une infection et réinfection

rubéolique ( www.microbe-edu.org) 11
Figure 8: Détection du virion de la rubéole dans les cellules BHK21 (Risco et al.,2003).....

14
Figure 9: Cellules VERO et BHK21 infectées par le virus de la rubéole. (Risco et al.,

2003) 14
Figure 10: Technique de détection de l'infection rubéolique a partir du liquide amniotique

de foetus par PCR et électrophorese RT-PCR(A),Nested PCR(B) (Bienvenu et al.,2004) 16

Figure 11: Contrôle de stérilité 22

Figure 12: Milieu DMEM 23

Figure 13: SVF 24

Figure 14: Antibiotiques 24

Figure 15: Tryptose phosphate 25

Figure 16: Trypsine 25

Figure 17: Contrôle de stérilité du Milieu de culture et additifs 26

Figure 18: Observation Microscopique des cellules BHK21 27

Figure 19: Décongélation des cellules BHK21 28

Figure 20: Observation Microscopique des cellules BHK21 dans la flasque 150cm² 29

Figure 21: Incubation dans l'Étuve à 37°C 29

Figure 22: Passage des cellules BHK21 30

Figure 23: Inoculation du virus 30

Figure 24: Lot d'hémagglutinine 31

Figure 25: Titrage de l'hémagglutinine rubéolique 32

Figure 26: Lavage par le Tampon PBS Tween de la plaque ELISA 35

Figure 27: Incubation du sérum des malades 35

Tableau 1: Résultats de titrage de l'HA 37

Tableau 2: Test numéro 1 . 38

Tableau 3: Test numéro 2 . 39

Tableau 4: Test numéro 3 .. 40

Tableau 5: Test numéro 4 . 41

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ISTMT-IPT 2012-2013

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a culture cellulaire s'est considérablement développée tant pour ses aspects fondamentaux que pour ses applications pratiques et cliniques. Cette discipline s'avère aujourd'hui d'une grande utilité dans le domaine de virologie puisqu'elle nous permet d'isoler des virus et contribuer aux diagnostics des maladies virales.

Le virus utilisé au cours de ce projet, est le virus de la rubéole. Ce virus appartient à la famille des Togaviridae. C'est un virus enveloppé, à acide ribonucléique (ARN) de polarité positive.

La transmission de ce virus peut se faire par les gouttelettes nasales expulsées par les personnes infectées lorsqu'elles éternuent ou toussent. L'homme est le seul hôte connu.

Plusieurs techniques de sérodiagnostic de la rubéole nécessitent la présence de l'hémagglutinine (HA) rubéolique, comme:

· Technique d'Inhibition d'hémagglutination (IHA)

· Technique d'agglutination sur latex

· Test ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) ...

Le développement des techniques immunoenzymatiques en particulier la technique ELISA a contribué à améliorer la spécificité et la sensibilité de dépistage des antigènes (Ag) et des anticorps (Ac), en particulier dans le diagnostic de la rubéole.

Pour la femme enceinte, la sérologie rubéolique est demandée d'une manière systématique. Ainsi des milliers d'analyses sérologiques sont réalisées chaque année en Tunisie. Ceci représente une importante consommation des réactifs pour le diagnostic de cette virose.

C'est dans ce cadre que nous nous sommes intéressés à développer une technologie de production de réactifs pour le sérodiagnostic de la rubéole ce qui nous permettra d'éviter le cout élevé d'importation du Kit commercial de diagnostic.

Toute fois, le développement de tel Kit de diagnostic nécessite la préparation de l'Ag rubéolique.

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I. ISTMT-IPT 2012-2013

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Maladie de la rubéole

Le nom «rubéole» est dérivé de l'exanthème typique, qui signifie rouge clair à petite tâche. Le virus responsable est ubiquitaire, strictement humain (Ellakhdi et al., 2009). Le virus de la rubéole est responsable de maladie éruptive, contagieuse, épidémique et immunisante, le plus souvent bénigne. La transmission se fait par voie aérienne (rubéole acquise) ou par voie transplacentaire au cours de la grossesse (rubéole congénitale). La gravité est due à la tératogénicité du virus lorsqu'il contamine une femme enceinte surtout au premier trimestre de la grossesse. (Pebret, 2003). Au cours de la grossesse le virus peut exercer des effets dévastateurs sur le foetus en développement. Ce virus est responsable de plusieurs cas de mort foetale et de graves malformations congénitales (Dontigny et al., 2008).

II. Caractéristiques cliniques

La rubéole s'annonce généralement par une éruption brusque, une sensation de malaise, un faible degré de fièvre et apparition le même jour d'une éruption morbilliforme (Figure1). Les symptômes peuvent précéder l'éruption d'un ou deux jours.

L'éruption commence au visage et s'étend au tronc et aux extrémités, dure rarement plus de trois jours (jawetz et al., 1973).

Les symptômes de la rubéole congénitale sont classés en deux rubriques:

? Des anomalies malformatives au cours de l'embryogenèse qui sont surtout

occasionnées par des contagions précoce au cours du 1^èr semestre de la grossesse.

? Une infection chronique et disséminée des différents organes foetaux. Cette infection peut persister jusqu'à la naissance (Chosidow, 1994).

Figure 1: Symptômes de la rubéole ( www.larousse.fr)

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III. Infection par le virus de la rubéole III.1. La rubéole acquise

Il s'agit d'une maladie bénigne qui passe le plus souvent inaperçue.

Le contage se fait par la pénétration du virus de la rubéole dans la muqueuse naso-pharyngée ensuite il arrive au système lymphatique.

· La phase d'incubation est de 14 à 18 jours.

· La phase d'invasion dure moins de deux jours. Elle est inapparente, elle se caractérise par des courbatures et parfois purpura de la voile du palais.

· La phase d'état où il y a une éruption macculo-papuleuse. Elle disparait sans laisser de trace au 3^eme jour. Il peut apparaitre (1 cas sur 20000) une méningo-encéphalite après l'éruption (peut être mortelle) (Pebret, 2003).

Au cours de cette maladie on peut constater l'apparition de plusieurs adénopathies qui précédent l'éruption comme les adénopathies cervicales postérieures, et une fièvre entre 38 et 38,5 °C, enfin des arthralgies sont fréquentes et en particulier chez l'adulte.

La guérison totale survient après quelques jours avec l'acquisition d'une immunité quasi-définitive. Une réinfection peut être possible mais elle passe inaperçue (Mammette, 2002).

III.2. Réinfection rubéolique

Une réinfection rubéolique est possible, les Ac résiduels (même un faible taux d'Ac) jouent le rôle de barrière pour cette maladie. Ces Ac empêchent la pénétration et la diffusion du virus dans le corps. Il y a une multiplication locale du virus dans le pharynx sans virémie. Cliniquement, la réinfection est inapparente. Elle se traduit par une remontée des Ac rubéoliques (Mammette, 2002).

III.3. La rubéole congénitale

C'est la forme la plus grave. Elle survient après l'infestation de la femme enceinte par le virus de la rubéole pour la première fois au cours de la grossesse.

Au cours de la grossesse, la rubéole peut entrainer:

· Une rubéole congénitale

· Un avortement spontané

· Un retard de croissance intra-utérin.

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Chez la femme enceinte, le passage du virus dans le sang (virémie) lui permet de passer à travers le placenta et atteindre l'embryon qui est en cours de développement. Il se développe dans ce cas une infection virale chronique de tous les tissus qui persiste pendant toute la gestation et même après la naissance.

Le virus infecte les cellules embryonnaires et peut provoquer l'arrêt des mitoses cellulaires causant des malformations décelées à la naissance (Pebret, 2003).

La rubéole congénitale peut associer de diverses atteintes:

? Hématologiques: purpura thrompbopénique, anémie hémolytique, aplasie médullaire

? Hépatiques: hépatite néo-natale

? Pulmonaire: pneumopathie interstielle

? Neurologique: méningo-encéphalite, calcification cérébrale, retard psychomoteur lié au déficit sensoriel (Armengaud, 2003).

Figure 2: Un enfant atteint de rubéole congénitale (Lasek-Duriez et al., 2008)

IV. Virus de la rubéole

IV.1. Historique

Dans l'histoire ancienne, la rubéole en tant que maladie s'est perdue parmi la maladie exanthématique. Dans un examen approfondi, Griffith a suggéré que la rubéole était connue en premier par les médecins arabes sous le nom d'al-hamikah. Ils considèrent la rubéole comme une forme de rougeole.

Deux médecins allemands, De-Bergen en 1752 et Orlow en 1758 sont crédités pour fournir les premières descriptions cliniques de la rubéole comme une entité spécifique.

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Dans les premiers écrits la rubéole était généralement appelé Rotheln en raison du grand intérêt des médecins allemands de la maladie au cours de la période allant du milieu du 18^ème siècle au milieu du 19^ème siècle. Le nom allemand été utilisé dans d'autres pays.

En 1866, un médecin écossais nommé Veale a décrit 30 cas de rubéole. Dans son exposé, il a donné à la maladie son nom actuel «rubéole».

En 1881, lors du Congrès international de la médecine à London un consensus s'est dégagé que la rubéole est une maladie distincte.

La rubéole a obtenu son importance actuelle en 1941, lorsque Gregg un ophtalmologue australien a rapporté des anomalies congénitales chez les bébés de mères qui ont eu la rubéole en début de la grossesse.

En dépit du scepticisme considérable, les observations de Gregg ont été confirmées rapidement par Swan et ses collègues chercheurs australiens et d'autres chercheurs aux États-Unis et Royaume-Uni.

En 1947, vingt huit communications décrivant 500 enfants souffrant de graves malformations congénitales associées à la rubéole maternelle étaient apparues dans la littérature.

L'isolement du virus de la rubéole en 1962 a ouvert la voie à l'étude définitive de la pandémie de la rubéole en 1964.

Après l'isolement du virus de la rubéole dans la culture de tissus, un effort intensif à travers le monde pour développer des vaccins a été monté, l'accumulation de ces expériences a donné lieu à un vaste champ de connaissances liées à la rubéole et la vaccination contre la rubéole en février 1969.

Trente trois ans depuis l'homologation du vaccin et l'utilisation universelle aux États-Unis l'apparition annuelle de la rubéole a chuté de 40.000 cas à moins de 300 (Feigin et al., 2004).

IV.2. Classification du virus de rubéole

Le virus de la rubéole est placé dans le genre Rubivirus de la famille des Togaviridae. À l'heure actuelle, il est la seule espèce de ce genre. Le virus est similaire sur le plan physico-chimique aux autres membres de sa famille (Alphavirus), mais n'est pas lié sérologiquement. Le virus de la rubéole n'a pas de hôte invertébré (une caractéristique de tous les Alphavirus), et l'homme est le seul hôte connu des vertébrés (Feigin et al., 2004).

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IV.3. Morphologie du virus

Le virus de la rubéole est sphérique avec un diamètre de 60 à 70 nanomètre (nm), et il est constitué de protéine de capside (C) et deux glycoprotéines (E1 et E2). E1 (poids moléculaire 58.000) et E2 (poids moléculaire, 42.000 à 47.000) sont glycosylées et sont situées sur la membrane de surface virale.

E1 est l'hémagglutinine (HA) virale que l'on retrouve à la surface, elle mesure entre 5 à 6 nm de longueur. La nucléocapside a un diamètre de 30 à 40 nm et se compose d'un polypeptide (protéine C) et l'ARN génomique. L'acide nucléique du virus de la rubéole est un simple brin d'ARN avec un poids moléculaire de 3,2 à 3,8 10⁶. La couche externe du virus (enveloppe) est une lipoprotéine dans la nature avec la cellule hôte des lipides et des polypeptides spécifiques du virus (Feigin et al., 2004).

Figure 3: Représentation schématique du virus de la rubéole (Guillet, 2010)

Figure 4: Virus de la rubéole au microscope électronique (Bienvenu et al., 2004)

IV.4. Type et classification antigénique

Le virus de la rubéole contient deux types de protéines: ? Protéines structurales

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? Protéines non structurales

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IV.4.1. Protéines non structurales

Le rôle des protéines de la rubéole a été démontré à partir de cellules infectées par le virus. Les premières études ont montré plusieurs protéines de poids moléculaire 200, 150, 87, 75 et 27 kilo Dalton (kDa) dans les cellules infectées par le virus.

Des travaux plus récents ont révélé que la protéine de 200 kDa est un précurseur de polyprotéine qui est clivée pour produire deux produits, de 150 et 90 kDa.

? Produit 150 a une activité enzymatique protéase.

? Produit 90 a une activité hélicase et réplicase.

De plus, il y a présence d'une courte région de fonction inconnue dite motif X et un acide aminé (méthyltransférase).

Ainsi l'ordre des gènes du virus pour la 5'OFR est 5'-méthyl-X-protéase-hélicase-réplicase-3' (Lee et al., 2000).

IV.4.2. Protéines structurales

? Protéine de capside C

La protéine de capside est une protéine non glycosyléé, phosphorylée. Sa masse moléculaire est entre 33 à 38 kDa. La protéine de capside C contient des clusters de résidus proline et arginine de nature basique qui sont impliqués dans leur liaison avec l'ARN génomique du virus formant ainsi les nucléocapsides virales. L'interaction de la protéine de capside avec l'ARN viral ne peut pas être uniquement dépendante de la densité des résidus basiques parce que d'autres régions de base au sein de la protéine ont été trouvées pour lier mal. Dans le génome du virus de la rubéole 29 nucléotides tronçon (nucléotide 347 à 375) interagissent avec la protéine de capside (Lee et al., 2000).

? Protéines membranaires E1 et E2

Les protéines de l'enveloppe du virus sont E1 et E2, ces protéines sont des glycoprotéines membranaires.

La glycoprotéine E1 du virus a une masse moléculaire de 58 kDa, alors que la glycoprotéine E2 est hétérogène de 42 à 47 kDa.

E1 contient trois sites de N-glycosylation pour toutes les souches alors que le nombre de sites de N-glycosylation de la protéine E2 semble varier selon la souche.

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Le rôle majeur de la N-glycosylation sur l'antigénicité et l'immunogénicité d'E1 a été étudié. Les études dans lesquelles E1 a été exprimé dans Escherichia coli et ont indiqué que la glycosylation peut être nécessaire pour le repliement d'E1.

Les fonctions des protéines E1 et E2 ont été largement étudiées en utilisant des Ac monoclonaux, il a été montré que la protéine E1 contient au moins six épitopes différents, dont certains sont liés à l'hémagglutination et de neutralisation. E1 apparaît comme la protéine de surface principale, avec des domaines impliqués dans la fixation du virus à la cellule.

La fonction de E2 n'est pas encore totalement déterminé mais E2 contient hémagglutination partielle et épitopes neutralisants (Lee et al., 2000).

IV.5. Génome du virus de la rubéole

Le virus de la rubéole est le seul virus dans la famille des Togaviridae à avoir un génome qui contient un seul brin d'ARN de polarité positive, son génome est d'environ 10 kilobases (kb) (Yumei et al., 2007), soit environ 9764 nucléotides.

Le génome contient deux trames de lecture (ORF):

? ORF 5' proximal codant pour 2 protéines non structurales est qui sont p150 et p90. L'ORF 5' proximal contient environ 6345 nucléotides.

? ORF 3' proximal codant pour les trois protéines structurales E1, E2 qui sont les protéines de l'enveloppe et enfin C qui est une protéine de la capside. L'ORF 3' proximal contient environ 3189 nucléotides. Ainsi l'ordre des gènes pour l'ARN 40S (coefficient de sédimentation) est 5'-p150-p90-C-E2-E1-3'. Le génome du virus de rubéole a un contenu élevé en G + C de 69%, le plus élevé de tout virus connu jusqu'à ce jour l'ARN (Lee et al., 2000).

Le génome contient également des régions non transcrites (UTR) à son extrémité 5' et 3' et entre les ORF (la région de jonction) (Yumei et al., 2007).

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Figure 5: Représentation du génome de la rubéole (Bienvenu et al., 2004)

IV.6. Réplication du virus

Les effets de la réplication du virus de la rubéole sur la cellule hôte est dépendante du type de cellules infectées. Ainsi, il faut être prudent de ne pas extrapoler d'une lignée cellulaire à l'autre, et plus important encore, de la réplication du virus de la rubéole dans des lignées cellulaires à la réplication du virus de la rubéole chez les humains.

La fixation du virus de la rubéole à des récepteurs cellulaires se produit probablement par l'intermédiaire des sites de liaison sur l'E2 et / ou E1 glycoprotéines moléculaires, même si le récepteur cellulaire du virus de la rubéole n'a pas été identifié pas plus que le site récepteur de liaisons sur une ou les deux glycoprotéines (Banatvala et al., 2007).

La pénétration du virus dans la cellule se fait par le phénomène d'endocytose et relargue sa nucléocapside dans le cytosol. La réplication du virus se fait dans le cytoplasme. Après le phénomène de décapsidation, les deux tiers 5' terminaux de l'ARN 40S se traduisent en polypeptides non structuraux nécessaires à la synthèse de l'ARN complémentaire de polarité négative.

Cette étape donne naissance à des ARN double brin, les intermédiaires de réplication. L'ARN messager 24S est après traduit en protéine C et les glycoprotéines E1 et E2 qui sont essentiels et entrent dans la structure des nouveaux virions. La protéine C se combine

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à L'ARN 40S formant ainsi la nucléocapside. Le virus acquière son enveloppe par le phénomène de bourgeonnement à partir des membranes intracellulaires ou plasmiques de la cellule cible. L'enveloppe est faite des lipides des cellules hôtes et des glycoprotéines E1 et E2 hérissant ainsi l'enveloppe sous forme de spicules (Denis, 1999).

Figure 6: Réplication du virus de la rubéole (Bienvenu et al., 2004)

V. Réponse immunitaire

Les immuglobulines M (IgM) spécifiques apparaissent après quelques jours de l'infection et sont suivies par l'apparition des immuglobulines G (IgG).

Le taux d'IgM augmente jusqu'à un maximum dans les 10 premiers jours puis ce taux diminue pour devenir presque négligeable après quelques semaines.

L'augmentation rapide des IgM spécifique est utile pour diagnostiquer l'infection. Les IgG vont être maximales en même temps que les IgM et persistent plusieurs années, de même pour les immuglobulines A (IgA) qui sont détectables dans le sérum et dans les sécrétions naso-pharyngées.

L'immunité cellulaire précède l'apparition des Ac de quelques jours, est atteint un maximal au même moment de l'apparition des Ac. Elle reste détectable plusieurs années (Collier et al., 2004).

La réponse immunitaire contre la rubéole et d'autres virus implique le traitement de peptides viraux et leur présentation à la fois CD8+ lymphocytes T cytotoxiques (CTL) restreints par des allèles Human leukocyte antigen (HLA) de classe I et de cellules T CD4+ restreints par des allèles HLA de classe II (Ovsyannikova et al.,2009).

Figure 7: Cinétique d'apparition des anticorps lors d'une infection et réinfection rubéolique ( www.microbe-edu.org)

VI. Epidémiologie et prévention

VI.1. Epidémiologie

Le virus se propage par un contact direct entre les humains (voie respiratoire). La rubéole est une maladie qui touche surtout les enfants.

Cette maladie est cosmopolite et épidémique qui se propage le plus souvent au printemps à cause du climat. Elle varie en fonction de l'âge la zone géographique et surtout le programme de vaccination dans les pays. Dans les pays tropicaux l'infection par cette maladie survient chez les enfants à un âge précoce.

Au 19^éme siècle l'épidémie de la rubéole était beaucoup plus fréquente avec des conséquences dramatiques. Au Etats-Unis la rubéole a engendré 12,5 million de cas, et 20000 enfants sont nés avec un syndrome de rubéole congénitale entre 1964 et 1965.

En 1969 cette épidémie a connu une chute importante en raison des compagnes et la politique de vaccination de certains pays comme l'Australie, Finlande, France, Grande Bretagne, Suède (Denis, 1999).

VI.2. Prévention et vaccination VI.2.1. Prévention

Il n'existe pas de traitement curatif de la rubéole.

Aucun traitement préventif n'a fait la preuve de ses efficacités après le contage. Les gammaglobulines sont inefficaces.

La prévention repose donc sur la vaccination:

? Vaccination de tous les enfants a partir de l'âge de 12 mois, avec rappel entre 3 et 6 ans dans le but d'atteindre une couverture vaccinale supérieur a 95%.

? Vaccination de rattrapage systémique de tous les enfants non vaccinés antérieurement entre 11 et 13 ans.

? Vaccination des femmes non immunisées doit se faire (chez la femme la sérologie de la rubéole est obligatoire pour le certificat prénuptial. Pour les femmes enceintes séronégatives, la vaccination doit être faite après l'accouchement (Anglaret et al., 2002).

VI.2.2. Vaccination

Le premier vaccin contre le virus de la rubéole a été fait en 1969.Une seule dose du vaccin entraine des taux d'Ac chez prés de 95% des personnes sensibles. Ces taux d'Ac persistent au moins 18 ans chez plus de 90% des personnes vaccinées.

Le vaccin contre la maladie de la rubéole est souvent bien toléré. Des effets indésirables peuvent survenir au cours de la vaccination comme le rash (éruption), l'adénopathie, l'arthrite et la fièvre.

Parmi les contre indications de la vaccination contre cette maladie, on peut trouver la présence de maladie fébrile, l'immunodéficience, les antécédents de réaction anaphylactique à la néomycine et la grossesse.

Le virus vivant atténué de la rubéole dans le vaccin peut traverser le placenta et infecter le foetus mais aucun cas d'embryopathie rubéolique n'a été signalé chez les enfants dont les femmes ont été vaccinées au cours des premiers mois de la grossesse.

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Le vaccin peut être administré avec toute sécurité en période postpartum, aux femmes allaitante, il peut aussi être administré aux enfants de femmes enceintes (Dontigny et al., 2008).

VII. Cellule BHK21 et multiplication du virus de la rubéole a l'échelle cellulaire

VII.1. Cellule BHK21

La souche baby hamster kidney (BHK21) a été isolée à partir du rein de hamster syrien. Elle possède plusieurs caractéristiques et propriétés qui font d'elle un support génétique facile dans son utilisation:

? Elle doit être facilement clonable afin d'obtenir des lignées provenant d'une cellule isolée.

? Elle doit posséder une hérédité stable, qui évolue peu au cours des divisions successives.

? Elle se cultive à la fois en tapis et en suspension.

Le caryotype de la souche BHK21 est stable. Il est très proche de celui de l'animal. Cette souche possède en total entre 43 à 44 chromosomes dans son caryotype assez difficile à distinguer par les techniques de coloration homogène.

Les conditions optimales de clonage correspondent à un pH de 7,2 et une température de 37°C.

Les milieux MEM et 199 ne permettent pas un clonage correct de la souche BHK21 (efficacité d'étalement inférieure à 1/100). Seul le milieu MEM complémenté avec les acides aminés non essentiels permet cette croissance clonale en présence de Sérum foetal bovin. Le temps de dédoublement des cellules est 14 heures (Caboche et al., 1973).

Les cellules BHK21 se multiplient rapidement au cours de 48 premières heures et font une couche complète et confluente pour une incubation de 72 heures (Rahman et al., 2007).

VII.2. Multiplication du virus de la rubéole a l'échelle cellulaire

La multiplication du virus se fait dans le cytoplasme. L'ARN du virus va servir de messager. Il y a formation d'un intermédiaire de réplication. L'ARN est encapsidé et les virions acquièrent leur peplos par le phénomène de bourgeonnement grâce à la membrane

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cytoplasmique ou dans les vacuoles intracytoplasmiques et libérées dans le milieu extérieur.

L'HA présenté sur le peplos apparait sur les bourgeons de la membrane cytoplasmique. Dans ce cas il est possible de faire une hemadsorption surtout sur les cellules VERO (lignée cellulaire provenant de rein de singe cercopithèque) ou BHK21 (Huraux et al., 1991).

Figure 8: Détection du virion de la rubéole dans

les cellules BHK21 (Risco et al., 2003) Figure 9: Cellules VERO et BHK21 infectées par

le virus de la rubéole. (Risco et al., 2003)

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VIII. Diagnostic

La recherche du virus de la rubéole ne se fait que dans les Laboratoires de virologie de haute technologie, elle est limitée au diagnostic anténatal. Elle s'effectue soit par isolement sur culture cellulaire soit par technique Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) simples ou multiplex.

Le diagnostic sérologique repose soit sur la présence d'IgM antivirus de la rubéole sans ou avec les IgG soit sur la séroconversion ou ascension du titre des Ac IgG ou totaux. La recherche des Ac anti rubéoliques fait appel au titrage des Ac par l'Inhibition de l'hémagglutination (IHA), méthode Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA)

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indirecte ou immunocapture qui permet la différenciation entre les IgG et IgM. La détermination de l'avidité est aussi appliquée au Laboratoire spécialisé pour faire la différence entre la primo-infection (infection acquise) ou réinfection (Gaudelus, 2008).

VIII.1. Diagnostic direct

VIII.1.1. Recherche du virus par isolement en culture de cellules

Le virus de rubéole peut se propager dans des cultures de tissu mais ne donne pas un effet cytopathique (ECP).

Toutefois dans la culture du virus de la rubéole certains cellules produisent une cytopathologie suffisante détectable par les observateurs expérimentés (Jawetz et al., 1973).

On cite ci-dessous quelques lignées cellulaires animales pour la culture de virus de la rubéole:

· BHK21: de Stoker et Macpherson. C'est une lignée cellulaire qui provient de rein de bébé hamster, cette lignée a subi plusieurs transformations et a été clonée plusieurs fois. Certains clones donnent un ECP alors que d'autre permettent d'obtenir un titre élève d'hémagglutinine.

· RK13: C'est une lignée cellulaire de rein de lapin.

· SIRC: Lignée cellulaire issue de cornée de lapin établie par Leerhoy de l'Institut de Copenhague.

· VERO: Lignée cellulaire qui provient de rein de singe cercopithèque.

Dans la pratique on utilise surtout:

· RK13 et SIRC pour l'isolement du virus, ces lignées donnent un ECP total et rapide.

· BHK21 et d'autres lignées comme PS-Y155 (lignée cellulaire de rein de porc) ou BSC1 (lignée cellulaire de rein de singe) pour la préparation et le titrage de l'HA. La culture in vitro a permis de comprendre plusieurs phénomènes sur la pathogénicité de la rubéole (Maurin, 1984).

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VIII.1.2. Détection du génome viral

La détection du génome viral est réalisée soit par hybridation moléculaire directe ou par la méthode d'amplification génique méthode de Polymerase Chain Reaction (PCR).

C'est en 1986 que Terry et al ont rapporté le premier essai de diagnostic anténatal de l'infection rubéolique par hybridation moléculaire.

? L'hybridation moléculaire directe repose sur l'utilisation de sonde localisée dans la région 3' du gène E1. Cette hybridation permet de détecter 1 à 2 pico-gramme d'ARN.

? D'autres auteurs ont mis au point la méthode d'amplification génique en utilisant des amorces dans le gène E1.

Toutes ces techniques nécessitent la validité sur un grand nombre de prélèvements.

? La recherche d'ARN viral par PCR nichée (Nested PCR) semble avoir une excellente sensibilité (détection d'une à deux copies d'ARN). Elle se fait a partir de la de villosité choriale, du placenta ou du produit d'avortement (Denis, 1999).

? La méthode RT-PCR a été développée et évalué pour la détection de l'ARN du virus de la rubéole directement prélevé à partir d'échantillons cliniques en utilisant des amorces qui ont amplifié 592 nucléotides, d'une région variable dans le gène E1.

La sensibilité de la PCR a été jugée équivalente à celle des essais déjà publiés, qui amplifient les petites régions du gène E1 (Cooray et al., 2006).

Figure 10: Technique de détection de l'infection rubéolique a partir du liquide amniotique

de foetus par PCR et électrophorèse RT-PCR(A),Nested PCR(B) (Bienvenu et al.,2004)

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VIII.2. Diagnostic indirect

VIII.2.1. Centrifugation en gradient de saccharose

L'ultracentrifugation en gradient de densité de saccharose a permis la séparation des IgG et IgM et de résoudre le problème chez la femme enceinte ayant en début de grossesse une suspicion de contamination rubéoleuse (signes cliniques et/ou Ac à titre élevé). La présence d'IgM spécifique de la rubéole dans le sang du sujet indique qu'il y a une affection récente, alors que leur absence est en faveur d'une réponse du type secondaire chez un individu anciennement protégé. En plus des IgM, il y a habituellement présence d'IgG à titre supérieur.

La valeur de cet examen apparaît certaine, mais les IgM n'étant pratiquement plus décelables après un mois, dans le sang de la femme ne doit pas excéder cette valeur si nous voulons disposer de résultats interprétables ( Maurin et al., 1973).

VIII.2.2. Mesure de l'avidité spécifique des IgG

La mesure de l'avidité des IgG peut aider à dater l'infection (Picone et al., 2005).

On a montré que le test d'avidité des IgG est utile pour différencier entre une récente ou ancienne infection de la rubéole ou une réinfection, elle est particulièrement utile pour étudier la rubéole chez les femmes enceintes (Mubareka et al., 2007).

VIII.2.3. ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay)

Les techniques d'ELISA sont des techniques sensibles et faciles à réaliser. La stabilité du virus (stabilité génétiques) fait que ce test sérologique est fiable (Ellakhdi et al., 2009).

La technique a été appliquée avec succès pour la détection des Ac spécifiques de la rubéole.

? Presque les Kits ELISA IgG spécifiques pour la détection de la rubéole sont tous disponibles dans le commerce et de type indirect, en utilisant l'Ag de la rubéole fixé à une phase solide (microplaque de polystyrène des plaques ou des billes en plastique). La source de l'Ag (peptide, l'antigène du virus recombinant ou entier) affecte la sensibilité et la spécificité du test. Après le lavage et l'élimination des Ag non liés, le sérum dilué est ajouté et incubé avec l'Ag immobilisé. Les Ac spécifiques de la rubéole présents dans le sérum se lient à l'Ag. Ensuite, les Ac non liés sont éliminés par lavage et un anti-IgG humain conjugué à enzyme est ajouté pour l'incubation. La quantité du Conjugué qui se lie à chaque puits est

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proportionnelle à la concentration de l'Ac de la rubéole spécifiques présents dans le sérum du patient. Les plaques sont ensuite lavées et le Substrat est ajouté, il en résulte un développement de la couleur. La réaction enzymatique est arrêtée après une courte période d'incubation, et la densité optique est mesurée par un instrument lecteur ELISA.

? Les Kits ELISA IgM disponibles dans le commerce pour la détection des IgM contre la rubéole spécifique sont principalement de deux types:

A. ELISA indirecte: Le principe de l'essai a été décrit ci-dessus pour la rubéole IgG, sauf pour l'utilisation de l'enzyme et l'anti-IgM humain étiqueté comme Conjugué. Dans cet essai, des résultats faux négatifs peuvent se produire en raison d'une concurrence dans le dosage entre les Ac IgG spécifiques avec une forte affinité, tandis que l'IgM spécifiques à une plus faible affinité pour l'Ag.

B. ELISA IgM de capture: Dans ces essais l'Ac anti-IgM humain est fixé à la phase solide pour la capture des IgM sériques. L'Ag du virus de la rubéole est lié à un Ac marqué par une enzyme pour détecter le complexe (Ac-Ag). Ce type d'essai permet d'éliminer la nécessité d'un prétraitement de l'échantillon avant le dosage (Mendelson et al., 2006).