2.4/ Réalisation des herbiers
Les exemplaires d'Ebenus pinnata Aiton et Genista
ferox poiret échantillonnés sont mis sous presse et
asséchés entre des feuilles de papier journal, puis fixés
sur papier dure. Les morceaux séparés de la plante, tels que
fruits et graines, sont placés dans une enveloppe fixée sur la
page correspondante de l'herbier. Chaque planche est ainsi
étiquetée comme il convient: nom de la plante, date et lieu de
cueillette, nom du collecteur, caractéristiques.
2.5/ Etude cytogénétique
Différentes méthodes sont décrites pour
l'étude des chromosomes, elles mettent en jeu l'application d'agents
chimiques pour le prétraitement, la fixation et la coloration des
cellules en divisions. Ces méthodes sont largement décrites dans
le cahier des techniques de cytogénétique végétale
(Jahier 1992).
L'emploi d'une technique adéquate doit permettre une
bonne séparation des chromosomes avec des détails morphologiques
permettant l'établissement correct du caryotype.
L'étude caryologique est effectuée sur des
méristèmes racinaires et caulinaires de graines faites
germées et sur les racines de plantules et méristèmes
caullinaires d'arbustes, et sur des boutons floraux de fleurs dont l'analyse
cellulaire révélerait le plus grand nombre de mitoses et de
méioses possibles.
2.5.1/ Etude des mitoses
2.5.1.1/ Obtention des apex racinaires
La difficulté de germination de certaines graines,
appartenant à la famille des Légumineuses est due à la
présence de téguments (Mazliak, 1984). Pour résoudre ce
problème, raison pour laquelle nous avons scarifié à
l'aide d'un papier verre. Cette scarification est importante pour lever
l'inhibition tégumentaire des graines, surtout pour les graines de
Genista ferox. Les graines sont mises à germer dans des
boîtes de Pétri tapissées de papier filtre humide plus une
goutte de javel. Ensuite on a mit les graines à prégermer au
réfrigérateur pendant 48h afin de lever la dormance et
déterminer ainsi la température optimum de germination pour
chaque espèce, en variant la température des différents
échantillons à l'aide d'une étuves en la réglant
à différentes températures allant de 22 °C à
27 °C.
2.5.1.2/ Prétraitement
Nous nous sommes référés à une
technique qui a pour effet de contracter les chromosomes ce qui facilitera leur
individualisation (La Cour, 1935). Le prétraitement consiste à
prélever des pointes de racines avec les zones
méristématiques et à les mettre dans une solution
antimitotique saturée.
Cette étape à pour but de bloquer les divisions
mitotiques en métaphase, contracter les chromosomes car la colchicine
inhibent la formation du fuseau achromatique et retardent la division du
centromère, ce qui entraînera l'éparpillement des
chromosomes dans la cellule et obtenir un grand nombre de plaques
métaphasiques. La colchicine est de loin la substance qui
présente le moins de danger, parmi les substances antimitotiques.
Les méristèmes caulinaires de G. ferox
poiret extraits à partir de plantules cultivés, et de
rameaux de feuilles d'arbuste, sont immergés dans la colchicine à
0.05% pendant 2h à température ambiante et à
l'obscurité.
Les pointes racinaires d'E.pinnata Aiton atteignant 2
à 2,5 cm, dont on a coupé 0.5 cm, sont extraites à partir
de graines germées, ou de plantules cultivées dans des pots en
cône troués pour permettre la sortie des racines pour les
récupérer, ensuite ces racines sont immergées dans de la
colchicine à 0,5% pendant une heure à 1h 15mn à
température ambiante à l'obscurité.
A fin de ne pas gaspiller notre matériel
végétale, les graines germées dont on a coupé
l'apex qui ne dépasse pas 0.5 cm, sont plantées dans des pots
afin de récupérer environ 18 méristèmes caulinaires
après croissance qui a durer 2mois à compté du jour de
prégermination, ou bien récupérer dés le
départ un seul méristème collinaire à partir de la
première paire de foliole formés.
2.5.1. 3/ Fixation
Nous avons utilisé le fixateur Ethanol-acide
acétique glacial (3v : 1v), qui assure non seulement la fixation mais
aussi un mordançage de la préparation. Ce fixateur peut
être suivi d'une hydrolyse appropriée (Farmer et Moore, 1905).
Le but de cette étape est de détruire toute vie
cellulaire, bloquer les divisions cellulaires en conservant
l'intégrité structurale des chromosomes et protéger les
chromosomes de l'action de l'agent mitoclasique de prétraitement.
La fixation est réalisée pendant 24h au
réfrigérateur pour E. pinnata Aiton, et de 4 jours pour
G.ferox ssp salditana.
2.5.1.4/Stockage
Le matériel végétal peut être
conservé pendant plusieurs mois dans une solution d'éthanol 70 %
congélateur, ou laissé dans le Carnoy I à (-10 °C)
jusqu'à utilisation.
2.5.1.5/ Hydrolyse
L'hydrolyse est une étape nécessaire elle se fait
dans une solution d'acide Hcl (1N) à 60 °C pendant 5 mn.
2.5.1.6/Coloration
Les méristèmes racinaires ou caulinaire
hydrolysé sont colorés avec l'orcéine lactopropionique
pendant une 5 à 10 min au bain marie à 60 °C.
2.5.1.7/Méthode simple et rapide de la mise en
évidence de tous les stades de division
Le protocole précédent dure 27 heures, afin
d'obtenir de très bonnes métaphases pour le comptage
chromosomique, mais l'observation de tous les stades de divisions peut
être réalisée avec une nouvelle technique qui dure
seulement 25 minutes, qui consiste à prendre les
méristèmes racinaire ou caulinaire et faire directement une
hydrolyse pendant 20 min au bain marie à 60°C, suivie de coloration
pendant 5 min, toujours au bain marie à 60 °C.
2.5.1.8/ Montage et observation au microscope
Les zones méristématiques hydrolysées,
colorées et isolées sont déposées sur une lame dans
une goutte d'orcéine lactopropionique, puis écrasées entre
lame et lamelle pour assurer la dissociation. Les cellules en division sont
repérées au microscope photonique à l'aide d'un objectif
de faible grossissement (X 10) puis au grossissement (X 40) pour une bonne
visualisation de l'image. Le dernier grossissement est celui de l'objectif (X
100) à huile à immersion.
Les bonnes plaques métaphasiques ont été
photographiées à l'aide d'un microscope ZEISS West Germany 475002
sur lequel on a placé une camera digitale de marque Panasonic, FS 4
LUMIX à 8.1 mégapixeles.
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