2.3 Analyse en Biologie Moléculaire par
RT-PCR
L'utilisation des outils de la Biologie Moléculaire a
permis l'étude des bactéries à l'état viable non
cultivable. Ce paragraphe décrit comment ces outils peuvent permettre la
détection de bactéries VNC.
La Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
est une technique utilisée pour la recherche de VNC. Les cibles de cette
réaction sont les mRNA transcrits à partir des gènes
potentiellement indicateurs d'une viabilité cellulaire. Une étude
de S. Yaron et K.R. Matthews compare l'efficacité de la RT-PCR sur des
mRNA de différents gènes cibles (Yaron M., Matthews K.R., 2002
[45]). Dans cette étude, la transcription des gènes
rfbE, fliC, stx1, stx2, mobA,
eaeA, hly et le gène codant pour les ARN 16S est
recherchée par une RT-PCR sur des cultures de E. coli O157 :H7
à différents stade de la croissance (figure 8).
Cette expérience permet de montrer que les gènes
rfbE, stx1 et le gène codant pour les ARN 16S sont
transcrits tout au long de la croissance.
Une seconde expérience est réalisée sur
des cellules viables non cultivables ; l'amplification de tous les gènes
par PCR, ainsi que l'amplification des mRNA par RT-PCR sont
réalisées. Tous les gènes sont amplifiés par PCR
alors que la RT-PCR ne permet d'amplifier que les gènes 16S RNA,
stx1, rfbE et mobA. Cela signifie que malgré
la présence de tous les gènes dans les cellules viables non
cultivables seuls les gènes 16S RNA, stx1, rfbE et
mobA sont transcrits. Cette expérience fait de ces gènes
des cibles préférentielles pour la recherche des E. coli
0157 :H7 par RT-PCR. Les auteurs soulèvent cependant un problème
de sensibilité de la méthode en précisant que la
présence de 5.105 à 107 UFC sont requis
selon le gène ciblé pour obtenir une amplification des transcrits
par RT-PCR ; là ou 104 UFC sont nécessaire pour
amplifier les gènes par une PCR classique.
Figure 8 : Amplification par RT-PCR : prélèvement
d'échantillons à différents temps de la culture (a),
résultat des
amplifications (b) : -, pas d'amplification ; +,
amplification positive. nt : non traité. (Yaron M., Matthews K.R.,
2002
[45])
Une équipe de chercheurs a récemment repris les
travaux commencés par Yaron et Matthews et ont réussi diminuer le
seuil de détection de la méthode en obtenant une amplification
positive à partir de 50 UFC pour un litre d'échantillon (Liu Y.
et al. 2008 [21]). Ces résultats ont été possibles
grâce à l'utilisation d'une station électronique
intégrant la technologie des puces à ADN.
L'inconvénient des méthodes RT-PCR est la
spécificité. En effet, lors d'une PCR les cibles sont
spécifiques, les gènes exploités dans l'exemple
cité ci-dessus ne peuvent être utilisé que dans le cas
d'une recherche de E. coli O157 :H7. La méthode restreint
l'utilisateur à une seule cible, d'autres auteurs ont cependant
déjà développé des méthodes de
détection des cellules viables et VNC par RT-PCR pour d'autres
espèces, par exemple : Listeria monocytogenes (Klein et Jejuna,
1997 [18]) ou Staphylococcus aureus (McKillip et al., 1998 [24]).
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