Diversité génétique des Rhizobia associés à un champ de pois d'Angole (Cajanus cajan l.) à Yamoussoukro (centre de la Côte d'Ivoire)

VIII.2- DISCUSSION DES RESULTATS

La différence de temps de croissance observée entre les isolats symbiotiques du pois d'Angole, pendant les cycles de culture et de purification sur milieu TY solide, pourrait être rapprochée des résultats obtenus en cultivant les rhizobia sur milieu YMA (Yeast Manitol Agar) (VINCENT, 1970). En effet, les rhizobia se subdivisent en deux groupes lorsqu'ils sont cultivés sur le milieu de culture YMA. Ce milieu est celui utilisé pour l'évaluation de la vitesse de croissance des bactéries à travers la détermination de leur temps de génération ainsi que le temps nécessaire pour le développement de colonies complètes. En l'utilisant, JORDAN (1982) a pu établir la première classification des bactéries symbiotiques fixatrices d'azote en deux genres (genres Rhizobium et Bradyrhizobium). Le premier genre représente le groupe des bactéries possédant un temps d'apparition de colonies complètes inférieur ou égal à cinq jours d'incubation et dites bactéries ``à croissance rapide''. Quant au second, il représente les bactéries dites `` à croissance lente '', caractérisées par le développement de colonies complètes entre cinq et sept jours d'incubation.

Par ailleurs, en prenant pour critère leur vitesse de croissance sur le milieu de culture YMA, SY et al. (2000) ont pu répartir une collection de 126 souches de rhizobia isolées du Crotalaria spp. en 2 groupes distincts. Un premier groupe de 81 souches à croissance rapide, dont les colonies apparaissent après 48 h de culture, et un second groupe de 45 souches à croissance lente pour lesquelles les colonies n'apparaissent qu'au bout de 72 h de culture.

Nos résultats sont quasi-identiques à ce résultat obtenu au Sénégal et révèlent de ce fait, une diversité physiologique au sein des bactéries étudiées. Le milieu TY pourrait donc être utilisé pour évaluer la diversité physiologique des rhizobia en fonction de leur vitesse de croissance.

Le taux d'amplification de 88,4 % de l'ADNr 16S des isolats cultivés sur ce milieu est un résultat satisfaisant, tenant compte du protocole utilisé pour obtenir les fragments d'ADN à amplifier. En effet, si ce protocole (Préparation des bactéries par effet thermique) a l'avantage d'être très rapide comparativement au protocole d'extraction de l'ADN, il ne permet pas par contre d'éliminer totalement certains inhibiteurs susceptibles d'influencer les résultats de la PCR (protéines, etc.). Ainsi, un calibrage de l'ADN dans le milieu réactionnel de la PCR, tenant compte de ces inhibiteurs, pourrait améliorer le résultat. Par ailleurs, une variation du volume d'ADN de 2,5 à 4 ul selon les souches a été nécessaire pour avoir nos résultats.

La taille des amplifiats obtenus (1500 pb) est bien celle attendue de 1'ADNr 16S parmi les bactéries (WEISBURG et al., 1991). Ce résultat est aussi identique à celui obtenu par DUBEY et al. (2010), en amplifiant cette même région chez des rhizobia isolés également du pois d'Angole en Inde. Le nombre de profils obtenus après digestion des amplifiats (3) met en évidence une diversité génétique au sein des bactéries symbiotes du pois cajan en Côte d'Ivoire. Ce résultat confirme l'importance de l'ADNr 16S dans l'évaluation de la diversité des bactéries en général et des rhizobia en particulier. En effet, grâce à sa structure très conservée mise en évidence par WOESE (1987), l'étude du gène de l'ARNr 16S constitue une excellente approche rapide pour évaluer la variabilité génétique entre les souches de rhizobia (LAGUERRE et al., 1994; NOUR et al., 1994b; SYLLA ,1998; NDOYE, 1999). Par ailleurs, la diversité observée est aussi comparable à celle obtenue en 2010 par DUBEY et ses collègues en Inde. En effet, utilisant trois enzymes de restriction différentes (contre une dans notre cas), leur étude a pu établir une diversité au sein des symbiotes du pois cajan dans le District de Betul. Les profils variaient d'un à quatre selon l'enzyme utilisée et quant au nombre de bandes de digestion généré par profil, il s'est situé entre deux et trois.

Enfin, l'inégalité constatée entre les fréquences des trois groupes génétiques constitués par l'étude peut s'expliquer d'une part par une capacité compétitive non identique de ces groupes au cours du processus de nodulation (ZEZE et al., 2001). En effet, les différentes souches de rhizobia coexistant simultanément dans un sol présentent des différences de capacité à rivaliser pour la formation des nodules (POSTMA et al., 1989 ; HEIJNEN et VAN VEEN, 1991). Ainsi, les deux groupes génétiques les plus représentés au sein de la population rhizobienne étudiée pourraient être ceux des souches symbiotiques les plus performantes dans la nodulation du champ de pois d'Angole étudié, notamment en termes d'infectivité. D'autre part, ces résultats peuvent s'expliquer par une densité de population saprophytique inégale entre les différentes souches rhizobiennes présentes dans la rhizosphère du pois d'Angole. En effet, certaines souches maintiennent dans le sol une faible densité de population en absence de la légumineuse hôte (HIRSCH, 1996 ; ZEZE et al., 2001), alors que le succès de celles-ci dans la symbiose est aussi influencé par cette taille initiale (POSTMA et al., 1989 ; HEIJNEN et VAN VEEN, 1991). Les souches ayant une plus forte densité de population initiale ont naturellement plus de candidats potentiels à la nodulation et leur abondance au sein de la population symbiotique peut par conséquent être plus élevée.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Notre étude qui s'inscrit dans le cadre de l'amélioration de la productivité des légumineuses par l'optimisation de la fixation azotée, a consisté à initier l'évaluation de la diversité des rhizobia nodulant le pois cajan en Côte d'Ivoire. L'objectif principal était de déterminer le niveau de variabilité génétique entre des souches rhizobiennes isolées d'un champ de ce pois cultivé à Yamoussoukro. Cette diversité a été évaluée par l'amplification de l'ADNr 16S des rhizobia suivie d'une digestion des amplifiats par une enzyme de restriction.

Au terme de cette étude, on retiendra que :

- les souches isolées présentent une diversité physiologique sur le milieu de culture TY. Deux groupes ont été identifiés avec une domination des souches développant des colonies denses et bien identifiables en 24 heures d'incubation ;

- le nombre de profils (trois) obtenus après digestion des souches amplifiées met en évidence une diversité génétique au sein des bactéries symbiotes du pois cajan ;

- une hétérogénéité dans les fréquences relatives des trois types de profils a été aussi observée.

Ces résultats nous donnent une grande satisfaction et permettent d'affirmer que nos objectifs ont été atteints. Toutefois, au delà de la variabilité génétique révélée, la PCR-RFLP de l'ADNr 16S ne permet pas une connaissance taxonomique de ces isolats symbiotiques. Ainsi, le recourt à des techniques plus avancées comme le séquençage de l'ADNr 16S des souches est nécessaire pour révéler l'identité des groupes constitués par le polymorphisme de la longueur des fragments de restriction. Par ailleurs, cette approche moléculaire (séquençage) est souvent utilisée comme une méthode complémentaire à la PCR-RFLP dans les études de diversité des rhizobia. Le couplage des deux techniques permet en effet d'établir des liens phylogénétiques entre les isolats d'une part et d'autre part entre les isolats et des souches de références déjà identifiées comme symbiotes de la légumineuse étudiée (NDOYE, 1998 ; SYLLA, 1998).

Le renforcement de notre collection initiale des souches symbiotiques, à travers une étude multilocale, s'avère également nécessaire pour avoir une vision globale de la diversité des populations locales de rhizobia symbiotes du pois d'Angole. Enfin, l'évaluation des caractéristiques symbiotiques des isolats (infectivité, efficience, aptitude à la compétition etc.) serait à considérer dans ces études. Cette évaluation apparaît en effet très déterminante dans tout processus d'exploitation de la fixation biologique de l'azote à des fins pratiques.

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ANNEXES