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Fractionnement des protéines sériques par électrophorèse sur gel polyacrylamide( Télécharger le fichier original )par Hamza Belaouar Université Montouri Constantine - Licence 2008 |
Conclusion:® VS = marqueur classique du SI. ® CRP = meilleur marqueur /cinétique rapide. ® Recherche de la cause fonction des tableaux cliniques et biologiques. ® Principales causes : infections ++, maladies de système, cancers. ® Traitement du SI = celui de sa cause.
Matériels et Méthodes
Il s'agit d'une étude qui concerne le fractionnement des protéines sériques de deux groupes des sujets ; malades et sains, basée sur la technique d'électrophorèse sur gel polyacrylamide. Ce travail a été réalisé sur 04 échantillons présentant une maladie auto- immune ; Lupus (la Lupus est une maladie généralement cutanée). Et 2 témoins (des sujets sains). Les échantillons présentant la maladie auto-immune appartiennent aux patients admis au service de médecine interne du CHU Constantine. Ce coté expérimental du mémoire a été réalisé au laboratoire de Biochimie Génétique-Centre de biotechnologie-Université Mentouri Constantine. Les protéines sériques extraites de ces échantillons ont été fractionnées par 3 méthodes d'électrophorèse ; PAGE, SDS-PAGE, Acide-PAGE.
2-1 L'électrophorèse: C'est un procédé biochimique qui permet le fractionnement des molécules biologiques (protéines, acides nucléiques) par le passage du courant électrique sur support poreux en fonction de leur charge nette ou de leur poids moléculaire. La vitesse de migration dépend non seulement de la charge des protéines, de leur taille et de leur forme mais aussi des conditions expérimentales de tels que le pH, la composition des solutions et le support électrophorétique. La révélation se fait après coloration des protéines avec du bleu d'Aniline ou du bleu de Coomassie en présence d'un fixateur acide le TCA (acide trichloracétique) ou par la coloration d'un composé chimique associé à la protéine comme dans
le cas des glycoprotéines (réaction de SHIFF) et des lipoprotéines (réaction au noir de sodium) ou, dans le cas des enzymes, avec leur substrat en présence du coenzyme. Le dispositif d'électrophorèse est constitué d'un gel dans lequel sont déposés des échantillons et dont deux extrémités opposées sont en contacte avec une solution tampon dans laquelle baignent les électrodes. On distingue différents types d'électrophorèse ; en milieu acide (Acide-PAGE), l'électrophorèse en présence du Sodium-Dodecyl-Sulfate (SDS-PAGE), l'isoélectrofocalisation... 4La technique SDS-PAGE: Cette technique a été mise au point par LAEMMLI (1970) où la séparation des molécules se fait en milieu basique à pH=8.8 en présence d'un détergent, le Sodium-Dodecyl-Sulfate qui masque la charge des protéines par sa propre charge négative et permet donc de faire migrer les protéines selon leurs poids moléculaires et leurs conformations uniquement. 2-2 Caractérisation des protéines sériques: 2-2-1 Extraction des protéines sériques: Elle a été réalisée à partir du sérum des patients malades (lupus) obtenu après centrifugation et recueilli dans des eppendorfs de 1.5 ml. En premier lieu, on rajoute aux sérums 100ul de la solution d'extraction composée de la solution stock à base de SDS à 10% (voir annexe) et d'un réducteur de Dithiothréitol (DTT) à 1% pour extraire et réduire nos protéines. En second lieu, le contenu de chaque tube est vortexé puis incubé à 60°C pendant 30min. 2-2-2 Réalisation de l'électrophorèse: Il s'agit d'une électrophorèse monodimensionnelle en présence du SodiumDodécyl-Sulfate sur gel polyacrylamide (SDS-PAGE) selon la méthode de LAEMMLI (1970) modifiée par SINH et al. (1991) et par AMIOUR et al. (2002). a. Préparation des gels: Dans la méthode de séparation par SDS-PAGE nous devons préparer deux types de gels : Un gel de séparation qui permet de fractionner les différentes protéines et les sous-unités protéiques selon leurs poids moléculaires et un gel de concentration permettant de retenir les impuretés et de tasser les protéines.
Avant de préparer les gels on doit procéder au montage des plaques, après les avoir nettoyées à l'éthanol. On les place l'une contre l'autre en les séparant avec deux éspaceurs dont la largeur est choisie, (voire annexe 2). ? Le gel de séparation (running gel): Le gel est à T=12.8% et C=0.97%.Ces dimensions sont de 180x160x1.5 mm. Il est constitué d'acrylamide à 35% (p/v), de N-N'-Méthylen-Bisacrylamide à 2% (p/v), de Tris HCL à pH=8.8, de SDS à 10% (p/v) et d'eau distillée. La réaction de polyacrylamide est catalysée par l'ammonium persulfate (APS) à 1% (p/v) et le TEMED. Une fois tous les constituants mélangés (les catalyseurs sont ajoutés en dernier lieu), il est coulé entre les plaques (montées auparavant) doucement pour ne pas faire de bulles jusqu'à un niveau délimité sur la plaque pour laisser la place au gel de concentration (à 4 cm de l'encoche). Ensuite, on coule une fine couche de butanol pour égaliser la surface du gel et pour éviter son contact avec l'air (pour faciliter la polymérisation). Au bout de 30 à 45 minutes le gel prend, on se débarrasse du butanol et on rince à l'eau distillée. ? Le gel de concentration (stacking gel): Le gel est à T=2.8% et C=1.4%. Il a les dimensions de 180x40x1.5 mm. Il est constitué de la même façon que le gel de séparation avec une seule différence au niveau du Tris HCL qui a un pH de 6.8.Le gel est coulé sur le gel de séparation, les peignes sont posés bien centrés entre les plaques et sans faire de bulles. Le gel prend après 45 à 60 minutes, les peignes sont retirés soigneusement pour ne pas casser les puits. Enfin, on verse du tampon dans les puits est on fait les dépôts.
Après le dépôt des différents échantillons ; la cuve d'électrophorèse (bac inférieur) est remplie à un niveau suffisant avec le tampon d'électrophorèse. Ensuite, le bac supérieur situé entre les deux plaques (bien serré contre les joints pour éviter les fuites) est rempli lui aussi avec le même tampon jusqu'à ce que les faces supérieures des gels soient immergées. Ensuite, ce dernier est placé dans la cuve d'électrophorèse pour que les faces inférieures des gels plongent dans le tampon. Enfin, la cuve est fermée et est reliée à un générateur 102 Matériels et Méthodes qui va assurer le passage du courant électrique. La migration est menée à une intensité constante de 40mA/gel. d. Fixation et coloration: Après la sortie du front de migration (coloré en bleu), la migration est arrêtée. Les gels sont démoulés et récupérés dans des bacs en plastique puis recouverts avec une solution de coloration est constituée d'un fixateur des protéines, le TCA (acide trichloracétique) à 60% et d'un colorant, le bleu de Coomassie R250. Les gels doivent être maintenus en agitation pendant 24 heures pour éviter le dépôt du colorant. Après ils sont décolorés dans de l'eau. 4La technique PAGE: Dans cette technique, la séparation des molécules se fait en milieu basique à pH=8.8 en absence d'un détergent, le Sodium-Dodecyl-Sulfate. Donc la migration des protéines se fait selon leurs poids moléculaires, leurs conformations et leur charge électriques. 2-3 Caractérisation des protéines sériques: 2-3-1 Extraction des protéines sériques: Elle a été réalisée à partir des mêmes échantillons utilisés dans la technique SDS-PAGE. En premier lieu, on rajoute aux sérums 100ul de la solution d'extraction composée de l'urée, le glycérol, triton x100 et d'un réducteur de Dithiothréitol (DTT) à 1% pour extraire et réduire nos protéines. En second lieu, le contenu de chaque tube est vortexé puis incubé à 60°C pendant 30min. 2-3-2 Réalisation de l'électrophorèse: Il s'agit d'une électrophorèse monodimensionnelle, cette méthode de séparation, par rapport à la méthode SDS-PAGE est une méthode non dénaturante en raison de l'absence de Sodium-Dodécyl-Sulfate (SDS). a. Préparation des gels: Dans la méthode de séparation par PAGE nous devons aussi préparer deux types de gels : Un gel de séparation et un gel de concentration ressemblant à celle la méthode SDS-PAGE, mais dans cette méthode on élimine le SDS dans les deux gels (voir annexe 3).
Avant de préparer les gels on doit procéder au montage des plaques, après les avoir nettoyées à l'éthanol. On les place l'une contre l'autre en les séparant avec deux éspaceurs dont la largeur est choisie.
Après la sortie du front de migration (coloré en bleu), la migration est arrêtée. Les gels sont démoulés et récupérés dans des bacs en plastique puis recouverts avec une solution de coloration est constituée d'un fixateur des protéines, le TCA (acide trichloracétique) à 60% et d'un colorant, le bleu de Coomassie R250. Les gels doivent être maintenus en agitation pendant 24 heures pour éviter le dépôt du colorant. Après ils sont décolorés dans de l'eau. 4La technique Acide-PAGE: La séparation des molécules se fait en milieu acide à pH=3.2 en présence de l'acide ascorbique, ce dernier accélère la réaction entre l'acrylamide et bis acrylamide, donc une polymérisation rapide. 2-4 Caractérisation des protéines sériques: 2-4-1 Extraction des protéines sériques: Toujours réalisée à partir du même sérum des patients malades (lupus) obtenu après centrifugation et recueilli dans des eppendorfs de 1.5 ml. En premier lieu, on rajoute aux sérums 100ul de la solution d'extraction composée de la N N' méthyle Formamid, saccharose (voir annexe 4).
En second lieu, le contenu de chaque tube est vortexé. 2-4-2 Réalisation de l'électrophorèse: Il s'agit d'une électrophorèse monodimensionnelle, en présence de l'acide ascorbique.
Après le dépôt des différents échantillons ; la cuve d'électrophorèse (bac inférieur) est remplie à un niveau suffisant avec le tampon d'électrophorèse. Ensuite, le bac supérieur situé entre les deux plaques (bien serré contre les joints pour éviter les fuites) est rempli lui aussi avec le même tampon jusqu'à ce que les faces supérieures des gels soient immergées. Ensuite, ce dernier est placé dans la cuve d'électrophorèse pour que les faces inférieures des gels plongent dans le tampon. Enfin, la cuve est fermée et est reliée à un générateur qui va assurer le passage du courant électrique. La migration est menée à une intensité de 400mA/gel et d'un voltage de 505v/gel. La migration est achevée en 1heur 45 minutes.
d. Fixation et coloration: Après la sortie du front de migration (coloré en bleu), la migration est arrêtée. Les gels sont démoulés et récupérés dans des bacs en plastique puis recouverts avec une solution de coloration est constituée d'un fixateur des protéines, le TCA (acide trichloracétique) à 60% et d'un colorant, le bleu de Coomassie R250. Les gels doivent être maintenus en agitation pendant 24 heures pour éviter le dépôt du colorant. Après ils sont décolorés dans de l'eau. Résultats et Discussion
«PAGE» « SDS-PAGE» «Acide PAGE» Résultats et Discussion
Après la réalisation de différentes techniques électrophorétique (Acide PAGE, PAGE 8.8, SDS-PAGE) pour le fractionnement des protéines sériques de 6 échantillons dont 4 ayant une maladie auto-immune (LUPUS) et 2 témoins ; les résultats obtenus montrent que la séparation au gel de polyacrylamide est satisfaisante par rapport au gel Acétate cellulose.
«Gel de polyacrylamide» «Gel d'Acétate cellulose» Figure 16 : comparaison entre le résultat de
fractionnement sur gel d'acétate cellulose et sur gel
de D'après les figures ci-dessus on peut facilement constate une différence dans la séparation entre les deux gels qui réside dans le nombre des bandes protéiques et la qualité de celles-ci. En plus une nette différence a été observée dans la séparation protéique sur gel de polyacrylamide lui-même en allant d'Acide PAGE, PAGE 8.8, SDS-PAGE qui est présent dans la localisation, l'intensité et la qualité des bandes. (Voir figures ci-dessous). Figure 17: Comparaison entre les résultats de fractionnement sur gel Acide PAGE, SDS-PAGE, PAGE.
Bande claire : taux de protéine réduit. Bande foncé : taux de protéine élevé. Les deux bandes identiques : même taux de protéine. Figure 18: variation des bandes protéiques; malade-malade. Taux élevé de cette protéine chez le malade. Taux réduit de la même protéine chez le témoin. Même taux de cette protéine chez le malade et le témoin. Résultats et Discussion
Quant aux profils protéiques, on peut dire qu'il existe une variation entre les bandes protéiques des patients malades entre eux d'une part et entre les patients malades et les témoins d'autre part (voir figures ci-dessous). Figure 19: variation des bandes protéiques; malades-témoins.
Cette variation est due à l'élevation du taux des protéines sériques qui caractérisent la maladie du lupus plus particulièrement les protéines du fractionnement ã par rapport aux témoins (gens non malades) et qui sont traduit par l'intensité et/ou l'absence de la bande protéique ã (voir figure ci- dessous).
26 H 25 A Figure 20: comparaison entre deux profils; malade-témoin. Aussi une différence a été observée entre les malades eux même et qui peut être probablement due à la différence de ; l'âge, le stade de la maladie et/ou la pathologie elle-même (voir figure ci-dessous).
Figure 21: comparaison entre les profils des malades. De même les profils protéiques des témoins présent aussi des faibles variations qui sont probablement en relation avec ; l'âge et l'état physiologique de la personne (voir figure). Figure 22: comparaison entre les profils des témoins. Belaouar Hamza/Lamri Adlène 25 AS 16 26 Résultats et Discussion 110 H A
Cela implique que l'électrophorèse est un bon moyen qui permet la séparation des protéines sériques et de détecté les différences entre celle-ci qualitativement et quantitativement.
Notre travail a été divisé en deux parties; Une partie bibliographique portant d'une part sur des généralités sur les protéines sériques voir l'hétérogénéité structurale, fonctionnelle et sur l'échelle de concentration ; aussi sur les valeurs sémiologiques de ces protéines dans le sang qui varient selon l'état physiologique et pathologique. D'autre part, sur l'étude descriptive des principales protéines sériques et de quelques syndromes. La partie expérimentale nous a permis de conclure que la séparation des protéines sur gel de polyacrylamide donne une meilleure résolution par rapport au gel acétate de cellulose quantitativement et qualitativement. Aussi, elle permet de visualiser le profil général des protéines et ainsi elle permet d'orienter le diagnostic et de déceler les maladies liées à ces protéines qu'il conviendra d'explorer par la suite. Références bibliographiques
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Tampon d'électrophorèse: Glycine 70.55 g Tris (hydroxyméthyl aminomethan) 15 g SDS 5 g Eau distillée QSP 5000 ml Acide trichloracétique (TCA) 60 % 100 ml Solution mère de Bleu de Coomassie R250 25 ml Eau distillée QSP 500 ml Solution mère de Bleu de Coomassie R250: Bleu de Coomassie R250 10 g Ethanol 95° QSP 1000 ml L'éthanol doit être mis en agitation dans l'éprouvette, avec un barreau aimanté. Le bleu de Coomassie est ensuite ajouté (sinon le bleu prend en masse au fond du contenant).Laisser en agitation au moins deux heurs, puis filtrer la solution.
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