Fractionnement des protéines sériques par électrophorèse sur gel polyacrylamide

C. LE GROUPE DES BETA-GLOBULINES

Cette groupe constitue 8.5 à 15 % (6 à 10 g/l) des protéines sériques. 1) Transferrine (Tf) ou Sidérophiline:

La transferrine est une protéine soluble qui assure le transport du fer dans le sang. Les cellules de l'organisme dont la teneur en fer est trop basse synthétisent et expriment à leur surface des récepteurs à la transferrine. Elles assurent ainsi leur

réapprovisionnement en fer, en internalisant la transferrine par endocytose.

a) Propriétés: > Physico-chimiques:

La transferrine sérique ou sidérophiline est une glycoprotéine, sa masse moléculaire 76 kDa, contenant 6% de glucides. Leur PHi varie entre 5.5 et 5.9.

> Métaboliques:

Synthétisée dans le foie et sa concentration sérique est influencée par le contenu du fer dans l'organisme, et présente une variabilité génétique : 03 phénotypes principaux B.C.D.Sa demi-vie est de 7 jours.

> Biologiques:

Transport du Fe³⁺, régule l'absorption du fer suivant sa saturation, mais possède des propriétés inhibitrices de la multiplication virale.

b) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

On sépare la transferrine aisément par électrophorèse en gel d'amidon. > Valeurs normales et variations physiologiques: Valeurs normales généralement admises : 02 à 03,8 g/litre.

Variations physiologiques : chez la femme enceinte, en fin de grossesse, la concentration s'élève autour de 04,4g/l, en raison de l'anémie ferriprive, habituelle à cette période.

> Variations pathologiques:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	44

-Diminution : dans la néphrose, syndromes inflammatoires, infectieux et néoplasiques, fuites protéiques, états de dénutrition ou malnutrition, insuffisances hépatocellulaires sévères, surcharges en fer.

-Augmentation : dans la sidéropenie et en fin de la grossesse, anémies ferriprives, hémorragies aigues ou chroniques et occultes.

2) C-reactive protein (CRP) ou protéine C réactive:

La c reactive protein a été ainsi nommée pour ses capacités à précipiter le polysaccharide C de Streptococcus pneu moniae.

C'est une protéine de la phase aigue et un marqueur systémique sensible de l'inflammation et des lésions tissulaires.

a) Propriétés: > Physico-chimiques:

La CRP est une holoprotéine de 120 KDa, elle est constituée d'un pentamère cyclique de 5 protomères de206 aminoacides chacun.

> Métaboliques:

La CRP plasmatique est essentiellement produite par les hépatocytes.sa transcription est sous le contrôle de cytokines comme IL-6, TNF-alpha, et IL-1â. Sa demi-vie est de 6 à 8 heurs.

La sécrétion de CRP débute 4a6 heures après le stimulus, double ensuit toutes les 8eures et atteint son pic vers 36-50 heures .la demi-vie plasmatique de la CRP est de 19 heures, mais la demi-vie clinique des concentrations de CRP après un seul stimulus comme la chirurgie ou un traumatisme demande plusieurs jours avant de revenir a sa valeur de base.

> Biologiques:

La CRP est reconnue pour jouer un rôle dans l'élimination des bactéries .les souris transgéniques pour la CRP montrent une résistance accrue contre l'infection létale a Salmonella typhimurium (bactérie Gram-négative).

Elle a par ailleurs un rôle d'activation du complément, de facilitation de la phagocytose des bactéries et de modulation de la multiplication des lymphocytes T.

b) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	45

Pas visible sur électrophorèse, dosage spécifique.

> Valeurs normales et variations physiologiques:

chez l'adulte sain ,le taux de CRP est inferieur a 3 mg/l et croit en réponse a un stimulus inflammatoire .les taux plasmatiques de CRP sont déterminés par le taux de synthèse, un marqueur de l'intensité du processus pathologique stimulant la production de CRP. L'hémodialyse n'affecte pas le taux de CRP.

> Variations pathologiques:

CRP Ultra sensible au risque cardiovasculaire hors inflammation (tableau 2).

<1mg/l Pas de risque.

1 à 5 mg/l Risque modéré.

>5 mg/l Risque élevé.

Tableau 2: niveau de risque lié à la variation du CRP.

Toujours dans le sens d'une augmentation: Etats inflammatoires aigus, quelle que soit leur étiologie, états infectieux, lésions traumatiques, Néoplasies.

Grand intérêt en pratique médicale courante.

3) Fibrinogène (FIB):

Le Fibrinogène est une glycoprotéine circulante soluble. Lorsque sa molécule est scindée par la thrombine au cours d'une réaction enzymatique, le fibrinogène est transformé en une protéine plasmatique insoluble : la fibrine. La conversion du fibrinogène en fibrine est la dernière et plus importante étape dans la formation du caillot hémostatique primaire dont le rôle est d'empêcher les pertes liquidiennes consécutives à un traumatisme.

a) Propriétés:

> Physico-chimiques:

La structure moléculaire du fibrinogène se compose de trois chaînes polypeptidiques reliées entre elles par des ponts disulfures pour former un dimère, sa masse moléculaire 330 KDa.

Lors de la conversion du fibrinogène en fibrine, deux paires de peptides (fibrinopeptide A et fibrinopeptide B) se libèrent des segments N-terminaux des chaînes á et ß pour former un monomère, la fibrine, qui est la protéine structurale prédominante dans la formation du caillot.1-4 Comme presque toutes les autres protéines responsables de la coagulation.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	46

> Métaboliques:

Le fibrinogène est synthétisé par le foie, avec demi-vie de 3 à 5 jours. Les anomalies relatives à la production du fibrinogène peuvent être congénitales ou acquises et se traduisent généralement soit par une diminution de la production de fibrinogène (afibrinogénémie/hyperfibrinogènémie) ou par une production de molécules de fibrinogène anormales (dysfibrinogénémie).

> Biologiques:

Le fibrinogène est le précurseur protéique plasmatique de la fibrine, qui polymérisé, devient le principal composant du caillot de fibrine. Sous l'action de la thrombine, le fibrinogène est clivé et forme un monomère de fibrine. Les monomères de fibrine sont polymérisés en un réseau de fibrine insoluble.

c) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

On peut doser le niveau de fibrinogène dans le sang par un prélèvement sanguin. > Valeurs normales et variations physiologiques:

Le taux normal du fibrinogène dans le sang est de 2 à 4 g/l.

> Variations pathologiques:

-L'afibrinogénémie: (absence de fibrinogène):

Dans cette forme de déficit en fibrinogène on note une absence complète du fibrinogène. Le taux du fibrinogène est < 0,2 g/l de plasma. Environ cinq personnes sur dix millions en sont atteintes. Des trois types de déficit, c'est celui qui provoque les saignements les plus graves.

L'afibrinogénémie se traduit par des tendances hémorragiques modérées à graves. -Diminution : L'hypofibrinogénémie: (taux inférieur à la normale):

En présence de cette anomalie, le fibrinogène est présent, mais à un taux inférieur à la normale : il se situe entre 0,2 g/l et 0,8 g/l. Cette anomalie est moins fréquente que l'afibrinogénémie. Les problèmes de saignements peuvent être légers, modérés ou graves.

Les taux de fibrinogène sont nettement diminués dans l'afibrinogénémie héréditaire, la coagulation intravasculaire, la fibrinolyse primaire et secondaire ainsi que dans les maladies hépatiques.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	47

Un taux de fibrinogène bas est retrouvé dans l'afibrinogénémie congénitale, dans l'hypofibrinogénémie et dans certains cas de dysfibrinogénémie, mais aussi dans différentes pathologies comme la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD), la fibrinolyse, la pancréatite et les insuffisances hépatiques sévères. Le fibrinogène est une protéine réactive de la phase aiguë dont la concentration augmente en réponse à différents stimuli physiologiques.

-Augmentation : (6 à 8 g/l) dans les processus inflammatoires:

Il peut être augmenté au cours d'une inflammation, d'une infection, au cours de la grossesse et après un traumatisme. Le fibrinogène est augmenté chez les fumeurs.

Un taux plasmatique élevé de fibrinogène a été associé à des états pré-thrombotiques. La concentration en fibrinogène est corrélée positivement au développement de l'athérosclérose, de l'infarctus du myocarde et des accidents vasculaires cérébraux.

- La dysfibrinogénémie: (mauvais fonctionnement)

En présence de dysfibrinogénémie, le taux de fibrinogène est normal, c'est-à-dire entre 2 et 4 g/l, mais le fibrinogène ne fonctionne pas adéquatement. Environ une personne sur un million en est affectée. En fait, on a répertorié plus de 100 types différents de dysfibrinogénémie.Les gens atteints souffrent rarement de problèmes hémorragiques. Ils peuvent même présenter la situation contraire : une thrombose (le sang coagule dans la circulation sanguine).

AF I B RI NOG É N ÉMIE HYPO FI B RI N OG É N ÉMIE DYSF I B RI NOG É N ÉMIE

TRANSMISSION Autosomal récessif Autosomal dominant Autosomal dominant et

(les deux parents et récessif un seul récessif un seul parent

sont porteurs). parent est porteur les est porteur les deux

deux parents le sont parents le sont

INCIDENCE 5 sur 10 millions moins que 1 sur 1 million

l'afibrinogénémie

TAUX DEFIBRINOGENE < 0,2 g/l plasma entre 0,2 -0,8 g/l entre 2 et 4 g/l plasma plasma
SYMPTOMS - saignement cordon ombilical - saignement cutanéo- muqueux -hémorragie gastro- intestinale - saignement intracrânien - saignement articulaire (chez 20 % des sujets)	- saignement cordon ombilical - saignement cutanéo muqueux - hémorragie gastro- intestinale - saignement intracrânien (peu fréquent) - saignement articulaire (chez 20 % des sujets)	-sans symptôme -hémorragie - thrombose
TRAITEMENT FIBRINOGÈNE FIBRINOGÈNE FIBRINOGÈNE OU ANTICOAGULANT

Tableau 3: tableau comparatif de déficience en fibrinogène congénital.

48

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques D. LE GROUPE DES GAMMA-GLOBULINES:

La réponse humorale se fait à travers un groupe de protéines ayant des propriétés semblables, mais des fonctions différentes = les Immunoglobulines.

Les gammaglobulines présentent 9.2 à 18 % (6.4 à 13 g/l).

1) Définition:

Ce sont des protéines animales glycosylée (glycoprotéines). Elles migrent à l'électrophorèse dans la zone ã.

Elles sont présentes dans le plasma, les autres liquides biologiques et les sécrétions. Ce sont les agents de l'immunité humorale, ce sont des protéines douées d'activité anticorps.

· Ac : globuline apparaissant dans le sérum d'un sujet, soumis à un Ag qu'il ne possède pas et capable de se lier spécifiquement à cet Ag.

2) Propriétés:

a. Physico-chimiques:

> Les Ig sont des molécules bipolaires : 2 pôles fonctionnels :

· Régions variables : impliquées dans les fonctions de reconnaissance de l'Ag.

· Région constante : responsable des fonctions effectrices.

>A côté de cette dualité fonctionnelle, on a :

· Dualité structurelle : constitution par 2 types de chaînes : légères et lourdes.

· Dualité génétique : 2 types de gènes codant chacun pour un type de chaînes.

> On en a 5 classes : IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, synthétisés par le lymphocyte B et surtout plasmocyte et peuvent être : intracellulaires - membranaires (=récepteurs d'Ag du lymphocyte) - sécrétées.

> Leur migration dans la zone ã de l'EPPS est à l'origine de l'appellation = gammaglobulines.

b. Métaboliques:

Elles sont synthétisées par des cellules spécifiques qui sont dans la moelle osseuse : les plasmocytes, dérivant des lymphocytes B activés. Cette synthèse est secondaire au contact de l'organisme avec une substance étrangère: antigène ou immunogène. Ces anticorps sont produits et sécrétés dans la circulation générale.

c. Biologiques:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	49

La réponse immunitaire est spécifique; une immunoglobuline (Ig) est spécifique de l'antigène (Ag) qui a déclenché sa synthèse. La spécificité est le plus souvent absolue.

3) Structure générale des immunoglobulines: On remarque l'extraordinaire hétérogénéité des Ig. a. chaînes polypeptidiques:

L'unité de base d'un Ac (monogène d'Ig) comprend 4 chaînes polypeptidiques: - 2 chaînes lourdes identiques (chaînes « H » pour Heavy).

- 2 chaînes légères identiques (chaînes « L » pour Light).

La structure générale est du type H2L2.

Cet édifice moléculaire a une masse moléculaire d'environ 150 KDa. Au microscope électronique, ces Ig se présentent sous la forme d'un Y avec un axe de symétrie entre les 2 chaînes lourdes (donc la molécule est symétrique).

> Les chaînes lourdes:

Leur nature varie selon la classe et la sous classe d'Ig. Chaque chaîne lourde est constituée de 450 acides aminés, ce qui correspond à une masse moléculaire de 50KDa.

Les deux chaînes lourdes sont reliées entre-elles:

- par des liaisons covalentes: un ou plusieurs ponts disulfures. Cette liaison est située dans la zone charnière.

- par de nombreuses interactions non covalentes qui stabilisent aussi l'ensemble (liaisons ioniques, hydrogène...).

> Les chaînes légères:

Comme pour les deux chaînes lourdes, les deux chaînes légères sont identiques entrent-elles. Elles sont du type ê ou ë, commun à toutes les classes d'Ig: Ig G, Ig M, Ig A, Ig D, Ig E. Leur masse moléculaire est d'environ 25 KDa chacune.

Chaque chaîne légère est reliée à une chaîne lourde:

- par un pont disulfure inter caténaire (entre l'extrémité carboxylique de la chaîne légère et la région charnière de la chaîne lourde).

- par de nombreuses liaisons non covalentes.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques

>>On distingue deux caractéristiques principales à cette structure de base: - la grande stabilité de la molécule H2L2.

- la grande flexibilité des chaînes lourdes (au niveau de la zone charnière). En effet, l'Y a un angle d'ouverture très variable, de 0 à 180°. Cette flexibilité permet l'adaptation de l'Ac à l'Ag qui a suscité sa production.

Figure 1: Structure biochimique d'une immunoglobuline.

Figure2 : Les différents types des immunoglobulines.

Belaouar Hamza/Lamri Adlène

50

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	51

b. Autres composants:

· Les chaînes oligosaccharidiques

Les Ig sont des glycoprotéines.

Les chaînes lourdes contiennent sur leur partie carboxy terminale des chaînes oligosaccharidiques (glycanniques) en nombre variable (1 à 7) selon la classe.

· Les chaines de Jonction ou chaînes J.

On les trouve dans la classe des Ig A et M. Elles permettent la polymérisation de l'unité de base. On a donc le motif (H2L2) n. Le degré de polymérisation est: n=2 pour les Ig A et n=5 pour les Ig M.

· La pièce sécrétoire S

Elle se rencontre dans les Ig A sécrétoires qui sont dimériques.

c. Les domaines d'Ig:

Au sein de chaque chaîne lourde et chaque chaîne légère, il existe des ponts disulfures intra caténaires qui obligent la séquence d'acide aminé à se replier sur elle-même en des boucles peptidiques de 60 à 70 résidus d'acide aminé. Chaque boucle représente la partie centrale d'une région globulaire comprenant 110 acides aminés; cette région est appelée domaine.

Le nombre de domaines varie selon la classe et le type d'Ig: > sur chaque chaîne lourde: 4 à 5 domaines.

>sur chaque chaîne légère: 2 domaines.

Au cours de l'évolution, on a constaté la duplication d'un gène ancestral commun. Quand on compare la composition en acides aminés de deux domaines différents, on remarque l'existence d'un haut degré d'homologie des séquences.

Figure3 : Organisation en domaines.

Belaouar Hamza/Lamri Adlène

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	53

d. Variabilité des chaînes:

Quand on compare les chaînes lourdes entre-elles ou les chaînes légères entre-elles, les séquences en acide aminé sont partiellement différentes.

Les différences sont localisées dans la région N terminale de ces chaînes; ces régions sont en conséquence dénommées régions variables ou V.

Les régions C terminales ont une structure relativement conservée : elles sont de ce fait appelées régions constantes ou C.

- Cas des chaînes légères:

On constate deux domaines de longueur équivalente:

- 1 domaine variable N terminal appelé VL (pour Variable Light) -1 domaine constant C terminal appelé CL (pour Constant Light).

- Cas des chaînes lourdes:

On constate 4 à 5 domaines de longueur équivalente:

- 1 domaine variable N terminal appelé VH (pour Variable Heavy)

- 3 à 4 domaines constants C terminaux appelés CH (pour Constant Heavy).

Il existe des appariements des domaines entre les chaînes lourdes et légères ; dans tous les cas, un domaine V s'associe à un V et un domaine C avec un C.

Ainsi, bien qu'ayant une structure de base commune, les Ig ont un certain degré de variabilité.

e. Dualité structurale et fonctionnelle des Ig:

Les Ig peuvent faire l'objet d'un clivage sous l'action d'enzymes protéolytiques (comme la papaïne d'origine végétale et la pepsine d'origine animale).

Les principaux résultats sont obtenus avec la papaïne; on assiste à une scission de l'Ig en 3 fragments de 50 KDa environ:

- 2 fragments Fab identiques. -1 fragment Fc.

*Les fragments Fab (ab pour "Ag-Binding") correspondent à la moitié N terminale d'une chaîne lourde reliée par un pont disulfure à une chaîne légère.

Ils ont la propriété de se lier à l'Ag mais sont univalents c'est à dire ils ne possèdent qu'un seul site de fixation antigénique.

Le site de liaison à l'Ag Fab est constitué:

- du domaine variable d'une chaîne légère (VL)

- du domaine variable d'une chaîne lourde (VH).

· Le fragment Fc : cristallise facilement et correspond à deux moitiés C terminales de chaînes lourdes reliées entre-elles par au moins un pont disulfure.

Le fragment Fc (constitué des domaines constants des chaînes lourdes, principalement CH2 et CH3) ne s'associe pas a l'Ag mais est le support des autres propriétés biologiques des Ig (comme leur capacité à s'associer au complément...).

f. Structure tridimensionnelle des Ig:

A l'aide de méthodes résolutives physiques (diffraction, RMN, Microscope Electronique), on a confirmé l'organisation spatiale des Ig en domaines.

-Figure ci-dessous: exemple de la conformation d'une Ig. Ce schéma indique l'organisation des chaînes entre elles et notamment la forme en Y induite par les chaînes lourdes.

Figure 4: structure tridimensionnel d'une immunoglobuline

4) Structure particulière des immunoglobulines:

a. Les IgG : 75% des Ig sériques, concentration = 12g!l.

- Elle a une structure de base en Y, constituée de 2 chaînes légères K ou ë et 2 chaînes lourdes ã.

- 4 sous classes décrites : IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4 (ã1 - ã2 + ã3 - ã4 = chaînes lourdes).

- Leur déploiement dans l'espace est variable d'une sous classe à une autre.

- L'IgG est bivalent car elle possède 2 sites Ac (2 paratopes).

b. Les IgA : 10 à 15%. 3.5g!l.

- 2 formes :

* Monomérique : IgA sérique : prédominante dans le sérum, structure semblable à l'IgG.

* Dimérique : IgA sécrétoire : très dominante au niveau des sécrétions : salive, larmes, sécrétions nasales, trachéobronchiques, intestinales, colostrum...etc.

Formée de 2 monomères d'IgA, réunis par une pièce J (de jonction) et une pièce S (sécrétoire) et opposés par leur fragment Fc.

- Chaque molécule comporte : 2 chaînes légères K ou ë et 2 chaînes lourdes á.

c. Les IgM : 1.5 g!l.

- Elle est pentamérique. Chaque unité a une structure semblable à celle de l'IgG.

- Les 5 unités sont réunies au niveau de l'extrémité COOH terminale, par les ponts disulfures d'une pièce J.

- Chaque unité comporte : 2 chaînes légères ë ou K et 2 chaînes lourdes ì (chaque chaine lourde comporte un domaine variable VH mais 4 domaines constants CH.

- La structure pentamérique explique la grande affinité de l'IgM pour les Ag et ses propriétés agglutinantes.

- 2 sous classes : IgM1 et IgM2.

d. Les IgE :

- Chaque molécule comprend 2 chaînes lourdes å et 2 chaînes légères K ou ë. - Les chaînes lourdes sont formées de 5 domaines chacune (idem IgM).

- Concentrations faibles dans le sérum, localisation essentiellement tissulaire.

e. Les IgD :

- 2 chaînes légères K ou ë et 2 chaînes lourdes ä.

- concentration sérique faible, joue un rôle en tant que récepteur de membrane des lymphocytes B.

IgA	IgM	IgD	IgE
á	u	ä	å
Ê ou ë	Ê ou ë	Ê ou ë	Ê ou ë
IgA 1 à 2
H2L2 ou (H2L2)2JS	(H2L2)5J	H2L2	H2L2
160KDa ou 400KDa	950KDa	185KDa	190KDa
6 J	5 J	4 J	2 à 3 J
2 à 4	0.5 à 2	0.05 à 0.4	0.1 à 1
10	0.4 ou 06	02	02

Fonction -Réponse

secondaire. -Anticorps; protection à long terme.

-Réponse primaire. -Anticorps des secrétions.

-Protection des muqueuses. -Protection à cours terme.

-Protection contre les parasites. -rôle plutôt mineur.

- Anticorps de la réaction allergique.

Structure en Y

Classes IgG

Chaine H ã

Chaine L Ê ou ë

Sous classe IgG 1 à 4

Structure H₂L₂

Masse Moléculaire 150KDa

Demi-vie moyenne 24 J

[g/l] 8 à 16

Valence 02

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques

	56

5) Classes et sous -classes:

C'est la nature de la chaîne lourde d'une immunoglobuline qui détermine sa classe et éventuellement sa sous classe.

L'Isotypie de classe ou de sous classe est la propriété liée à la présence chez tous les individus de la même espèce, des mêmes marqueurs antigéniques spécifiques.

Chez les mammifères par exemple existe 5 classes d'Ig (immunoglobulines) qui

correspondent à un type différent de chaîne lourde :

- Ig G: chaîne lourde de type ã (Gamma). - Ig A : chaîne lourde de type á (Alpha). - Ig M : chaîne lourde de type u (Mu).

- Ig D : chaîne lourde de type ä (Delta).

- Ig E : chaîne lourde de type î (Epsilon).

En ce qui concerne les Ig A et les Ig D la nature de la chaîne lourde peut faire l'objet d'une variabilité définissant une sous classe :

- Il existe 4 sous classes d'Ig G: Ig G1, Ig G2, Ig G3, Ig G4 car il existe 4 sortes différentes de chaînes lourdes gamma.

- Il existe 2 sous classes d'Ig A: Ig A1, Ig A2 car il existe 2 types de chaînes lourdes alpha.

Le tableau ci-dessus indique les principales propriétés physiques et biologiques des classes et des sous-classes.

Tableau 4: Classes et sous classes des immunoglobulines.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	57

Quelques précisions :

. Dans la catégorie « association moléculaires possibles », le symbole « J» signifie qu'il existe une chaîne de jonction, et le symbole « S» signifie qu'il existe une pièce sécrétoire.

. La valence de l'anticorps correspond au nombre de segments Fab (nombre de sites de liaison à l'antigène).

. Ig D est plus lourde Que Ig G ou Ig A car elle est plus glycosylée.

. Ig E est lourde car il existe un 5ème domaine et Ig M est encore plus lourde car c'est un pentamère. La masse d'Ig A est de 400 000 quand il existe une chaîne de

jonction et une pièce sécrétoire.

.Ig G et Ig A sont les plus synthétisées par jour par un individu.

.Ig M sédimente plus vite car c'est un pentamère. 6) Exploration des immunoglobulines sériques:

L'exploration des immunoglobulines est de règle quand:

- il existe des infections répétées, inexpliquées, surtout bactériennes,

- on évoque un déficit immunitaire compliqué de manifestations infectieuses, auto- immunes ou lymphoprolifératives,

- il existe des éléments en faveur d'une prolifération lymphoplasmocytaire susceptible de sécréter une IM (cf. exploration d'une gammapathie monoclonale),

- la VS est accélérée avec ou sans syndrome inflammatoire. > Méthodes d'exploration des Ig :

Elle comporte une électrophorèse des protéines sériques complétée par un dosage pondéral des Ig sériques : IgG, IgA et IgM, éventuellement des sous-classes d'IgG.

* Electrophorèse des protéines sériques;

La séparation électrophorétique du sérum humain donne 5 (ou 6) fractions. A l'état normal, un grand nombre de molécules d'Ig d'isotypes, d'allotypes et d'idiotypes différents provenant d'une multitude de clones lymphoplasmocytaires circulent dans le sang : ce sont les Ig polyclonales. Les Ig migrent essentiellement dans la zone des ãglobulines. La concentration en ã-globulines estimée à l'EP varie selon l'âge, physiologiquement elle est de 6 à 13 g/l chez l'adulte.

* Dosage pondéral des Ig (IgG, IgA, IgM):

Le dosage pondéral (quantitatif) des Ig (néphélémétrie) donne plus de précisions.

Les concentrations en Ig varient en fonction de l'âge. Chez l'adulte sain, les concentrations sériques sont les suivantes :

IgG : 7,20 -14,70 g/l, IgA : 1,10 - 3,60 g/l, IgM : 0,48 - 3,10 g/l. *Dosage des sous-classes d'IgG (IgG1, G2, G3, G4).

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	58

Il s'effectue essentiellement par néphélémétrie. Les concentrations varient en fonction de l'âge. L'interprétation des résultats est délicate lorsque les concentrations sont à la limite inférieure de la normale et chez l'enfant de moins de 18 mois.

a. Dosage: á) Prélèvement de sang du foetus dans les derniers mois de grossesse:

- La teneur en augmente jusqu'à la naissance où elle atteint son point culminant. Mais ce stock d'Ig G à la naissance provient essentiellement de la mère car les Ig G sont les seuls capables de passer la barrière placentaire.

- Les IgM qui sont moins nombreuses sont elles d'origine foetale.

- On ne trouve ni Ig A ni Ig D ni Ig E.

â) Prélèvement à la naissance:

- Il y a diminution des Ig C} d'origine maternelle (1/2 vie d'environ 3 semaines) mais la production d'Ig G démarre dès la naissance et compense cette chute.

- La production des Ig M se poursuit jusqu'à atteindre un plateau vers le sixième mois. - La production des autres Ig augmente progressivement.

· Réponses immunitaires primaires et secondaires.

Lors du premier contact entre l'organisme et l'antigène: pendant quelques jours rien ne se passe (temps de latence) puis au bout d'une semaine apparaissent dans le sang des anticorps spécifiques de l'antigène puis le taux d'anticorps se stabilise avant de diminuer.

Lors du second contact entre l'anticorps et l'antigène: la réaction immunitaire secondaire est très rapide (pas de latence) et beaucoup plus ample. Elle traduit l'existence chez un individu d'une mémoire antigénique portée par les lymphocytes B mémoires.

b. Typage par immunofixation d'une gammapathie monoclonale: + Le principe de l'immune fixation repose sur 2 propriétés:

-Mobilité électrophorétique dans un champ électrique.

-Caractère antigénique des protéines. C'est une propriété inhérente à toutes les protéines.

Ex: si on injecte une protéine purifie (ex albumine humaine) à un mouton, il ne reconnaît pas cette albumine et donc fabrique des anticorps anti-albumine. Le mouton est alors immunisé contre l'albumine humaine et il est possible d'isoler ses anticorps anti-albumine humaine. D.

+ Technique de l'immunofixation (lors de cette expérience):

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	59

- On dispose d'un support plastifié sur lequel on coule un gel hydraté et tamponné par un Ph de 8,6.

- A l'aide d'un applicateur on dépose sur ce support quelques microlitres de sérum sur les 6 pistes correspondantes.

- On applique alors un courant électrique entre les électrodes (200 V).

- Les protéines migrent alors en fonction de leur taille.

- Sur la piste de gauche on applique un colorant des protéines (électrophorèse normale).

- Sur les 3 pistes suivantes on dépose un anticorps spécifique d'une Ig (G, A, M). - Sur les 2 dernières pistes on dépose un anticorps anti-chaîne légère (K et L).

Anticorps et antigène forment un complexe et donnent une réaction colorée. + Analyse de cette immunofixation:

- Sur la première piste on repère une zone intense qui correspond à une production anormale d'une catégorie d'Ig.

- On détermine cette classe d'Ig en étudiant les complexes antigène/anticorps. - La chaîne lourde correspondante est de type G et la chaîne légère de type L.

- Il y a donc une synthèse trop importante d'Ig de type ë2ê2.

7) FONCTIONS DES IMMUNOGLOBULINES :

Ils assurent plusieurs fonctions dans le déroulement de la réaction immunitaire :

a) Reconnaissance de l'Ag :

- La principale fonction d'une Ig est de reconnaître et de se lier spécifiquement à un Ag.

- Cette fonction est assurée par une région appelée : site Ac ou paratope, située sur le fragment Fab, et constituée de 6-10 acides aminés, qui ne sont pas voisins, et qui appartient aux régions « hypervariable » de la chaine lourde et de la chaine légère.

- Ainsi, se forment des complexes Ag-Ac= complexe immuns (lorsque l'Ag est soluble).

- Lorsque les Ac se fixent aux cellules cibles, leur forme se modifie faisant apparaître des sites de 4 fixation du complément, sur le fragment Fc.

b) Fixation et activation du complément :

- En fonction de leurs classes et sous-classes les Ig peuvent activer le complément par les deux voies : Classique et alterne.

Ce qui déclenche la fixation de certains facteurs du complément sur la surface de la cellule antigénique et par conséquent sa lyse.

c) Propriétés cytophylitiques :

- Le fragment Fc présente également des sites de fixation de nombreuses cellules immunitaires : macrophage, PNN, lymphocytes et mastocytes...

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	60

- Les Ig en reliant l'Ag ou la cellule aux PNN et macrophages ou monocytes jouent le rôle d'opsonines (facilitent la phagocytose).

d) La neutralisation :

- L'Ig peut bloquer des sites spécifiques sur les exotoxines bactériennes et les virus. Ce qui les empêche d'endommager les cellules normales de l'organisme = neutralisation.

e) Agglutination et précipitation :

- Agglutination : lorsque plusieurs cellules étrangères, en l'occurrence, sont réunies par des Ig, formant un amas.

- Précipitation : lorsqu'il s'agit de molécules solubles réunies, pour former de grands complexes immuns.

- Ce qui facilite la phagocytose de ces bactéries ou molécules d'Ag précipités.

Neutralisation, agglutination et précipitation découlent de la fonction de fixation et de connaissance des Ac et donc du fragment Fab.

f) Passage transplacentaire des IgG :

- Le site qui permet ce passage est situé sur le fragment Fc des IgG : les seules à pouvoir traverser le placenta.

g) Propriétés particulières :

· IgM :

- Les premières à apparaître au cours de l'ontogénie et de la réponse immune.

- Puissants agents agglutinants et dans la fixation du complément et son activation. - Récepteurs antigéniques à la surface des lymphocytes B.

· IgG : - Principal Ac des réactions primaires et secondaires.

· IgA :

- Interviennent dans les réponses immunitaires locales au niveau de la sécrétion des muqueuses :

* En empêchant l'adhérence des germes aux cellules épithéliales. * En neutralisant certaines toxines.

* En agglutinant les bactéries ou champignons.

· IgE :

- Se lient au mastocytes et basophiles, lorsque associés aux Ag, déclenchent la libération de médiateurs : histamine.... (Dégranulation) qui participe à des réactions allergiques et à la défense antiparasitaire.

· IgD : Belaouar Hamza/Lamri Adlène

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		61

- Leur rôle n'est pas bien connu : probablement = rôle de récepteur à la surface des lymphocytes B5 immunocompétents.

- Bipolarité fonctionnelle :

* Le fragment Fab reconnaît et se fixe à l'Ag.

* Le fragment Fc est responsable des propriétés biologiques. N.B= Niveaux d'hétérogénéité des immunoglobulines :

- Isotypie : les isotypies : déterminants antigéniques identiques chez les individus d'une même espèce. Ils sont portés par la partie constante des chaînes lourdes et légères.

L'Isotypie définit les classes et les sous classes d'Ig.

- Allotypie : les allotypies sont des déterminants antigéniques provenant des variations génétiques interindividuelles au sein d'une même espèce de structure des chaînes lourdes á, ã et des chaînes légères kappa K.

_ Ils sont portés par les parties constantes de ces chaînes.

_ Il existe 28 allotypes pour les chaînes lourdes gamma appelés Gm. _ Il existe 2 allotypes pour les chaînes lourdes alpha appelés Am.

- Idiotype :

* Sont des déterminants antigéniques (ou Epitopes) localisés sur le fragment Fv formé par l'association des domaines variables des chaînes lourdes et légères= VL et VH. La spécificité idiotypique = étroite individuelle, produit d'un clone cellule.

* La cascade d'auto-anticorps anti-idiotypes = le réseau idiotypique, a pour rôle de réguler la réponse humorale.

8) Principales anomalies des immunoglobulines: a. Les hypogammaglobulinémies:

> Hypogammaglobulinémies physiologiques:

Les déficits de l'immunité humorale se caractérisent par un trouble de la production globale des anticorps par les lymphocytes B responsable d'une hypogammaglobulinémie plus ou moins sévère selon l'étiologie. Quatre cas cliniques illustrent les principales causes hypogammaglobulinémies de l'enfant, la maladie de Bruton - dans sa forme typique et dans sa forme atypique -, l'hypogammaglobulinémie transitoire de l'enfance et de la déficience immunitaire commune variable.

Les manifestations cliniques que partagent ces diverses pathologies sont les infections bactériennes à répétition touchant principalement le tractus respiratoire.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		62

Les infections opportunistes et les manifestations auto-immunes sont plus fréquentes dans la déficience immunitaire commune variable et dans l'hypogammaglobulinémie avec hyper IgM qui, en raison de sa rareté, n'est que brièvement abordée.

Les récents progrès de la génétique et de la biologie moléculaire ont partiellement révélé l'origine et la physiopathologie de ces affections. L'administration intraveineuse d'immunoglobulines améliore considérablement la qualité de vie des patients et le pronostic de leur affection.

> Hypogammaglobulinémies pathologiques:

Dites globales lorsque la concentration de toutes les classes d'Ig est diminuée, sélectives lorsqu'elle ne touche qu'une ou deux classes d'Ig, les hypogammaglobulinémies relèvent de différentes étiologies. On distingue :

>Les déficits immunitaires acquis (étiologie la plus fréquente) :

- maladies infectieuses, syndromes lymphoprolifératifs (LLC, myélome), - atteinte médullaire néoplasique, toxique, post-radique,

- médicaments : immunosuppresseurs, APS, ...

- pertes excessives : fuites rénales, cutanées, digestives.

-Hémopathies malignes.

-Causes iatrogènes.

-Pertes Protéiques.

-Certaines maladies virales.

> Les déficits immunitaires primitifs : Le dosage des différents isotypes des Ig permet de détecter les déficits en IgA, déficits immunitaires humoraux les plus fréquents (1/700 sujets), les déficits immunitaires communs variables, les déficits avec hyper-IgM. L'agammaglobulinémie ou maladie de Bruton (absence d'Ig et de lymphocytes B) est exceptionnelle.

Déficits congénital en IgA (<50mg/l).

Déficits immunitaires combinés sévères(DICS).

>>Les déficits en sous-classes d'Ig

Les déficits en IgG2 sont les mieux caractérisés (infections des voies aériennes supérieures à germes encapsulés). Parfois il existe des déficits combinés IgG2 et IgA, IgG2-IgG4. L'existence du déficit en IgG4 est controversée : 20 % des sujets sains ont des concentrations en IgG4 à la limite des possibilités de détection.

b. Les hypergammaglobulinémies polyclonales:

> Caractéristiques:

Une hypergammaglobulinémie (augmentation des gammaglobulines) inférieure à 30 g/l a rarement une valeur d'orientation diagnostique décisive car elle s'observe dans de nombreuses circonstances inflammatoires ou infectieuses chroniques mais également dans certaines MAI (S. de GougerotSjögren+++, lupus systémique [on le revoie dans la partie

expérimental], ...). Une hypergammaglobulinémie supérieure à 30 g/l oriente vers une infection VIH, une parasitose ou une hépatite auto- immune.

> Situation pathologique:

+ Maladies infectieuses:

· infections aiguës: Ig monoclonale transitoire.

· infections chroniques.

· virus: VIH, EBV, CMV, VHB, VHC.

· bactéries: salmonelles, leptospires, EI.

· parasites: paludisme, toxoplasmose.

+ Maladies auto-immunes:

· syndrome de Gougerot-Sjögren essentiellement

· autres maladies auto-immunes (PR, LED...): fréquence peu élevée
d 'Ig monoclonale posant la question d'une association fortuite.

+ Hépatopathies:

· capacité de synthèse hépatique diminuée: o Diminution de l'albumine et d'autres protéines.

· autres perturbations biochimiques: o Augmentation des enzymes hépatiques (transaminases, PAL, ...) (cytolyse).

o Augmentation de la bilirubine (ictère).

· hypergammaglobulinémie polyclonale (IgA): o compensation de synthèse par les plasmocytes. o bloc â / ã.

o diagnostic différentiel des autres hypergammapolyclonales.

c. Les dysglobulinémies monoclonales:

> Caractéristiques:

Anomalie des globulines qui constituent, avec l'albumine, les protéines du sang. En pratique on réserve ce mot à des modifications des gammaglobulines ou anticorps. On regroupe ainsi sous le nom de dysglobulinémies, ou gammapathies monoclonales, des maladies dans lesquelles existe, dans le sang ou dans les urines, une immunoglobuline monoclonale en excès. Elle peut être mise en évidence dans le sérum par des réactifs qui identifient la classe de chaînes lourdes et le type de chaînes légères.

Chez un sujet normal, les différentes classes d'immunoglobulines sont présentes à des taux stables, leur production étant soumise à une régulation. Les dysglobulinémies monoclonales sont caractérisées par une rupture de cette régulation et par la prolifération excessive et maligne d'un clone qui entraîne une synthèse importante d'une espèce moléculaire dite monoclonale.

La présence d'une immunoglobuline monoclonale anormale a été longtemps synonyme de myélome ou de macroglobulinémie de Waldenström. On sait maintenant qu'il existe d'autres gammapathies monoclonales, au cours d'autres cancers, d'états inflammatoires chroniques et de certaines maladies auto-immunes. Il

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		64

y a aussi des modifications modérées et bénignes qui régressent sans traitement (Tableau 5).

DYSGLOBULINÉMIES MONOCLONALES

Malignes :Myélome

Macroglobulinémie de Waldenström

Lymphomes malins (leucémie lymphoïde chronique, lymphomes) non-hodgkiniens

Maladies des chaînes lourdes

Non malignes : Associées à une autre affection

· Cancers

· Cirrhoses

· Inflammation chronique · Maladies auto-immunes Formes dites« essentielles bénignes »

· Formes sporadiques

· Formes familiales (prédisposition génétique).

Tableau 5: Dysglobulinémies monoclonales.

Le diagnostic est assez souvent évoqué par un examen biologique sanguin fait pour une autre raison, s'il révèle une ou plusieurs anomalies : une augmentation de la vitesse de sédimentation, une précipitation du sérum ou du plasma au froid, des «rouleaux» de globules rouges sur un frottis sanguin, une pseudo-agglutination lors de la détermination d'un groupe sanguin, une anémie isolée, une augmentation des lymphocytes dans le sang. Ces modifications amènent à analyser les protéines par électrophorèse du sang et des urines. L'immunoglobuline monoclonale recherchée peut exister sous forme de molécules entières d'anticorps ou de chaînes isolées. On identifie de façon précise l'anomalie et l'anticorps concerné et on constate que les autres immunoglobulines sont diminuées.

Les anomalies les plus fréquentes portent sur les immunoglobulines et en cas de myélome. L'augmentation des immunoglobulines monoclonales correspond à la maladie de Waldenström.

Remarque:

Dans les cas de gammapathie bénigne, sans signe clinique, les immunoglobulines normales ne sont pas abaissées. Il n'y a pas de cellules anormales dans le sang ni dans la moelle osseuse. Il faut cependant surveiller ces formes bénignes car elles peuvent évoluer vers un myélome.

> Situations pathologiques:

+ Maladie de Kahler: (myélome multiple classique):

· Prolifération maligne monoclonale des plasmocytes dans la moelle osseuse- Maladie de Kahler-

· 20 % des Ig monoclonales; IgG (53 %), IgA (25 %), chaînes légères isolées (20 %),

IgD (1 %), IgE exceptionnelle.

· Manifestations: - Signes osseux:

Douleurs lombaires, costales, des membres; fracture pathologique; tuméfaction osseuse.

- Signes radiologiques:

Lacunes à l'emporte-pièce des os du crâne, des côtes, du bassin; déminéralisation osseuse ; tassements vertébraux.

- Signes rénaux :

Tubulopathie chronique, insuffisance rénale. - Signes neurologiques:

Paraplégie par compression épidurale; neuropathie périphérique.

Amylose.

· Manifestations hémorragiques:

Infection bactérienne.

· Manifestations cutanées:

nodules de coloration rose-chamois.

· Critères diagnostiques du myélome multiple:

· Critères majeurs:

1- Tumeur plasmocytaire sur une biopsie.

2- Plasmocytose médullaire > 30 %.

3- Pic monoclonal sérique: IgG >30 g/l, IgA > 20 g/l, excrétion urinaire de chaînes légères Kappa ou Lambda > 1 g/24heures.

· Critères mineurs:

a- Plasmocytose médullaire comprise entre 10 et 30 %.

b- Composant monoclonal sérique ou urinaire à un taux inférieur à ceux cités dans 3.

c- Lésions osseuses lytiques.

d- Baisse des Ig résiduelles: IgM < 0,5 g/l, IgA< 1 g/l, IgG < 6 g/l.

Chez des malades symptomatiques: anémiques et/ou hypercalcémiques et/ou hyperazotémiques et/ou hypoalbuminémiques et/ou présentant une déminéralisation osseuse et des fractures compressives.

Le diagnostic de myélome multiple est retenu si: á) 1 + b ou c ou d;

â) 2+ b ou c ou d;

ã) 3;

ä) a + b + c ou a+ b + d.

· Variant du myélome multiple:

-3 % des Ig monoclonales. - Smoldering myeloma:

· 3 % des Ig monoclonales

· Critères de définition:

-Malade asymptomatique.

-Taux de l'Ig monoclonale sérique > 30 g/l. -Plasmocytose médullaire entre 10 et 30 %. -stabilité de l'Ig monoclonale au cours de l'évolution.

· Surveillance à vie en raison du risque d'évolution vers un myélome multiple.

Figure 5: Profile électrophoritique d'un patient atteint le myélome multiple classique.

+ Macroglobulinémie de Waldenström:

· Macroglobulinémie de Waldenström:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		67

2 % des Ig monoclonales.

· prolifération de cellules lymphoïdes B de maturation intermédiaire entre le petit lymphocyte et le plasmocyte, excrétant une IgM monoclonale dite

macroglobuline.

· manifestation cliniques: fièvre, sueurs nocturnes, adénopathies,

hépatosplénomégalie, neuropathie périphérique, syndrome d'hyperviscosité.

· diagnostic:

· Ig monoclonal IgM > 5 g/l.

· myélogramme et BOM: prolifération lymphoïde polymorphe comportant

lymphocytes, lymphoplasmocytes et plasmocytes.

+ Maladies des chaînes lourdes:

· syndromes immunoprolifératifs caractérisés par la production d 'Ig monoclonales incomplètes sous forme de chaînes lourdes délétées sans chaines légères.

· électrophorèse le plus souvent normale (Ig < 1g/l).

· diagnostic sur l'immunoélectrophorèse ou l'immunofixation.

· trois types:

-Maladie des chaînes lourdes alpha: la plus fréquente; sujets jeunes du pourtour méditerranéen; tableau de malabsorption intestinale sévère.

-Maladie des chaînes lourdes gamma: présentation de type lymphome. -Maladie des chaînes lourdes mues: très rares.

+ MGUS:

· Gammapathies monoclonales de signification indéterminée (MGUS):

· 60 % des Ig monoclonales; IgG (70 %), IgA (15 %), ou IgM (15 %).

· découverte d'une Ig monoclonale de manière fortuite.

· examens para cliniques:

Électrophorèse des protéines sériques.

Immunoélectrophorèse ou immunofixation des protéines sériques. NFP, calcémie, créatininémie.

Myélogramme.

Radiographies osseuses: crâne, bassin, colonne dorsale et lombaire, humérus, fémur, thorax; éventuellement.

IRM du squelette axial.

Électrophorèse et immunoélectrophorèse ou immunofixation des protéines urinaires.

· Critères de définition des MGUS:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		68

Malade asymptomatique ne présentant pas de: lésion lytique osseuse, anémie, hypercalcémie, insuffisance rénale.

Taux de l'Ig monoclonale sérique < 30 g/l.

Pas d'excrétion urinaire de chaînes légères (ou taux très faible). Plasmocytose médullaire < 10 %.

Stabilité de l'Ig monoclonale au cours de l'évolution. ? Evolution des M GUS:

Évolution possible vers un myélome multiple (IgG et IgA) ou une lymphopathie maligne (IgM) après parfois de très nombreuses années: risque actuariel de transformation maligne de 15 % à 10 ans et 30 % à 20 ans.

Surveillance:

Après 3 mois puis tous les 6 mois.

Clinique et biologique: électrophorèse des protéines sériques, NFP, calcémie, créatininémie, excrétion urinaire de chaînes légères.

Figure 6 : Profile électrophoritique d'un patient atteint le syndrome MOUS.

d. Profils immunitaires oligoclonaux: > Immunodéficience sévère.

> Certains types de cancers.

> Maladies auto-immunes.