Memoire Online - Diversité génétique et fréquences alléliques des gènes Pfmsp1 et Pfmsp2 des isolats provenant d'enfants asymptomatiques et symptomatiques de la région de Lastourville au sud est du Gabon

Mémoire N° EDR MR 2022 0098 de Master 2 Recherche en Infectiologie Tropicale

DIVERSITE GENETIQUE ET FREQUENCES ALLELIQUES DES GENES Pfmsp1 ET Pfmsp2 DES ISOLATS PROVENANT D' ENFANTS ASYMPTOMATIQUES ET SYMPTOMATIQUES DE LA REGION DE LASTOURVILLE

Dr. OYEGUE LIABAGUI ép. ASSANGABOUA Sandrine Lydie, Maitre- Assistant CAMES /USTM

DEDICACES

Mon défunt grand frère Daniel MORISHO KAEYO, puisse Dieu te bénir à jamais pour l'amour, la vie

A mes parents Béatrice MWAMINI et l'inspecteur Adrien NEPA MORISHO, puisse Dieu vous benir à jamais pour l'amour parental sans pareil,

A madame Esther BAMAVU, pour qui je te serai à jamais reconnaissant, pour l'amour, les sacrifices et le soutien sans faille.

A mes enfants et à toute la grande famille MORISHO, pour l'amour sans cesse renouvelé, le soutien, et surtout vos encouragements.

Je remercie sincèrement le Professeur. LEKANA-DOUKI Jean Bernard, Directeur Général du CIRMF, qui a bien voulu m'accepter comme stagiaire au sein de la structure dont il a la charge, et pour avoir accepté de diriger ce travail.

Mes remerciements vont également à l'endroit du Directeur général de l'école doctorale, le professeur Jacques LEBIBI, pour son abnégation, son humilité et ses sages conseils .

Mes remerciements vont également à l' endroit du Docteur OYEGUE LIABAGUI Sandrine Lydie,

chef de l'Unité d'Evolution, Epidémiologie, Résistance Parasitaire (UNEEREP) du CIRMF, pour avoir accepté d'encadrer ce travail.

Je voudrais exprimer toute ma gratitude à l'ingénieur Mme KOUNA Lady Charlène, pour m'avoir supervisé durant tout le stage. Merci pour ses conseils, sa disponibilité et sa rigueur scientifique.

Je remercie aussi d'une manière particulière Mme MBANI MPEGA NTIGUI Chérone, et Mr ONTOUA Steede Seinnat, PhD Students dans le service, pour leur disponibilité dans l'apprentissage des méthodes de recherche et leurs sympathies.

J'exprime ma gratitude à toute l'équipe de l'UNEEREP, Dr. IMBOUMY Karl, M. OKOUGA Alain-Prince, ,ALICE, VANESSA et LUIDE, pour l'accueil, le suivi, la convivialité, l'harmonie et la rigueur de travail.

Mes remerciements nourris à tous les enseignants de l'école doctorale et à tous les collègues compagnons de lutte.

Il s'est agi d'une étude observationnelle à visée descriptive et analytique, privilégiant une approche pluridisciplinaire qui associe l'épidémiologie et la biologie moléculaire 14

4.2. Comparaison de la Prévalence de l'infection plasmodiale entre symptomatiques et asymptomatiques 20

4.2.1. Distribution des espèces plasmodiale en fonction de la symptomatologie 20

4.2.2. Infections polyclonale des gènes Pfmsp-1 et Pfmsp-2 en fonction du statut clinique 22

4.3. Diversité allélique : polymorphisme de longueur de taille de fragments 23

ABREVIATIONS

LISTE DE FIGURES

Figure 3: Représentation schématique du gène Pfmsp 1 de P.falciparum montrant les 17 domaines [22] 17

Figure 4: Diagramme schématique du gène Pfmsp 2 illustrant les blocs 1 à 5 [22] 17

Figure 6: Représentation schématique de la réalisation d'un TDR( kit-optimal-it) 21

Figure 8: Diversité allélique, polymorphisme de longueur de taille de fragments dans l'ensemble de la population 29

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 2: Séquences des amorces utilisées pour le diagnostic moléculaire et tailles des bandes attendues 22

Le paludisme reste la maladie parasitaire la plus mortelle et la plus répandue au monde, malgré de nombreux efforts consentis pour contrôler cette endémie. En effet, plus de 241 millions de nouveaux cas dont 627000 décès ont été déclarés à travers le monde en 2020, et le plus grand nombre de cas et de décès a été enregistré en Afrique Subsaharienne ou le paludisme demeure endémique [1].

Plusieurs espèces sont capables d'infecter l'homme et de causer la maladie, cependant Plasmodium falciparum est la plus dangereuse car elle est responsable de la quasi-totalité des cas et décès liés au paludisme.

L'élimination du paludisme implique des stratégies mondiales clés, notamment une prise en charge rapide et efficace des cas, le traitement préventif intermittent (TPI) du paludisme pendant la grossesse et la gestion intégrée des vecteurs (IVM). Cependant, si les cas symptomatiques sont pris en charge et traités, les porteurs asymptomatiques restent le réservoir qui alimente la transmission du parasite. Une élimination réussie du paludisme nécessitera de ce fait, une connaissance de la variabilité génétique du parasite dans différentes zones géographiques et une meilleure compréhension des facteurs qui déterminent le flux de gènes entre les sites. Les protéines de surface du mérozoïte-1, 2 de Plasmodium falciparum (Pfmsp 1 et Pfmsp2), qui sont des antigènes de stade érythrocytaire asexué, sont considérées comme des marqueurs appropriés pour l'identification de populations parasitaires de Plasmodium falciparum génétiquement distinctes [ 3 ]. Cependant, depuis la publication du génome complet du clone de référence 3D7 de P. falciparum [ 4 ] et le séquençage d'autres isolats plasmodiaux, il y a eu quelques éclaircissements sur les variations génétiques responsables de phénotypes tels que la chimiorésistance et la virulence parasitaire [ 5 ]. Bien que dans ces études, les cas symptomatiques et asymptomatiques soient pris en compte peu de travaux sur le polymorphisme génétique et les marqueurs de virulence de P. falciparum ont été réalisés sur des infections asymptomatiques. Par ailleurs, les résultats des études réalisées entre porteurs symptomatiques et asymptomatiques sont mitigés, montrant une association de certains allèles avec la virulence et d'autres pas.

Au Gabon, le paludisme représente respectivement 45% et 71% des motifs de consultation chez les enfants et les femmes enceintes [2]. Par ailleurs, cette maladie y reste la première cause de décès et d'absentéisme au niveau scolaire et professionnel. Elle est également responsable des complications prénatales et infanto-juvéniles [2] '''''[3].

le lien entre la virulence de Plasmodium falciparum et les marqueurs de virulence étudiés n'est pas clairement établi. Cependant, des études sur le polymorphisme génétique de P. falciparum ont permis de décrire la diversité génétique de ce parasite dans différentes régions du pays, aussi bien chez des patients atteints de paludisme simple à grave que chez des enfants asymptomatiques [4-6]. Ces études basées sur l'amplification des gènes Pfmsp-1 et Pfmsp-2 visaient à caractériser le profil génétique des isolats de Plasmodium dans le but ultime d'éliminer le paludisme. L'étude du Pfmsp-1 montre une forte diversité allélique de ce gène, ce qui serait compatible avec le niveau élevé de transmission du paludisme à Libreville [5]. Cette diversité génétique de P. falciparum est très variable d'une région à une autre, comme par exemple à Franceville, une faible diversité a été décrite par rapport à Libreville [5, 6]. De plus, une prédominance de l'allèle K1 a été rapportée au Sud Est du Gabon [4, 6]. Certaines études montrent que RO33 était faiblement polymorphe au Gabon, mais une étude de William et al décrit 10 allèles différents de RO33 [4, 5, 7]. Certains auteurs ont suggéré que la diversité allélique de Mad20 augmenterait avec la gravité de la maladie [5]. Quant à la diversité allélique de Pfmsp-2, la famille allélique prédominante est 3D7 [4]. Plusieurs études ont également montré que les infections multi-clonales peuvent varier en fonction du statut clinique de l'individu (symptomatique ou asymptomatique) [5, 8]. Nous émettons l'hypothèse suivante: les populations de P. falciparum trouvées chez les sujets asymptomatiques ont des génotypes différents de ceux trouvés chez les sujets symptomatiques au Sud Est du Gabon. Il serait donc intéressant de décrire le génotype de ces souches par rapport au profil trouvé chez les patients symptomatiques et les sujets asymptomatiques à Lastoursville. Le but de cette étude était donc d'explorer la diversité génétique de P. falciparum dans les infections palustres asymptomatiques et symptomatiques à Lastoursville.

GENERALITES SUR LE PALUDISME

I.1. Définition

Le paludisme (du latin paludis c'est-à-dire marais) encore appelé malaria (de l'italien mal'aria c'est-à-dire mauvais air) est une érythrocytopathie parasitaire très répandue dans le monde, notamment en Afrique sub-saharienne où le risque de transmission est le plus élevé. Cette maladie parasitaire est causée par un protozoaire du genre Plasmodium et transmise à l'homme par la piqure infectante d'un vecteur, moustique hématophage du genre Anopheles (anophèle femelle).

I.2. Epidémiologie du paludisme.

A l'échelle mondiale, environ 241 millions de cas de paludisme ont été enregistrés en 2020 dans 85 pays d'endémie palustre contre 227 millions en 2019 et la majeure partie de cette augmentation provenait des pays de la Région africaine de l'OMS[4]. La femme enceinte et le foetus sont plus vulnérables face au paludisme. Cette vulnérabilité découle de la baisse de l'immunité maternelle, de la séquestration placentaire qui est à l'origine de la réduction du poids du nouveau-né (surtout pour les primipares)[5]. La morbidité maternelle est surtout due à l'anémie. La mort in-utero du foetus, des avortements et des accouchements prématurés sont également des conséquences fréquentes du paludisme gestationnel. Malgré les efforts considérables dans la lutte contre cette endémie, elle constitue une lourde charge pour les pays en voie de développement, car la prise en charge et la prévention de celle-ci demandent un gros investissement de la part des pouvoirs publics et même du patient [6]. La répartition géographique varie en fait d'un continent à l'autre, d'un pays à l'autre, d'une région à une autre, d'un village à un autre etc. Actuellement, près de la moitié de la population mondiale est à risque pour le paludisme [7]. L'incidence des cas de paludisme (c'est-à-dire les cas pour 1000 habitants à risque) est passée de 81 en 2000 à 59 en 2015 et 56 en 2019, avant de remonter à 59 en 2020. L'augmentation en 2020 a été associée à une interruption des services pendant la pandémie de COVID-19. Au niveau mondial, près de 96 % des décès dus au paludisme ont été enregistrés dans 29 pays. Six pays ont concentré un peu plus de la moitié des décès dus au paludisme dans le monde en 2020 : le Nigéria (27 %), la République démocratique du Congo (12 %), l'Ouganda (5 %), le Mozambique (4 %), l'Angola (3 %) et le Burkina Faso (3 %) [1]

I.3. Agents pathogènes

Le paludisme est causé par un protozoaire appartenant au genre Plasmodium. Il existe de très nombreuses espèces de Plasmodium (plus de 140), touchant diverses espèces animales, dont cinq espèces sont habituellement retrouvées en pathologie humaine : P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae et P. knowlesi qui demeure un parasite habituel des singes d'Asie qui s'est avéré être responsable d'une zoonose. Ces cinq espèces diffèrent par des critères biologiques, génétiques, cliniques, ainsi que par leur répartition géographique et leur capacité à développer des résistances aux antipaludiques.[8]

P. falciparum est un parasite hétéroxène ayant un cycle évolutif diphasique dont une phase de multiplication asexuée chez l'homme (son hôte intermédiaire) et une phase de multiplication sexuée chez l'anophèle femelle (son hôte définitif).

Au cours d'un repas sanguin chez un individu infecté, l'anophèle femelle ingère des gamétocytes à potentiels sexuels. Ces derniers, transportés dans la glande salivaire s'échappent rapidement de leur enveloppe érythrocytaire. Une fois déglutis, ils parviennent dans l'estomac de l'anophèle. Les gamétocytes mâles se différencient en microgamètes (4 à 8) rendus mobiles par un processus d'ex flagellation, tandis que les gamétocytes femelles se différencient en macro-gamètes (ovules). La rencontre de ces gamètes produit un zygote mobile: l'ookynète. Celui- ci pénètre dans la paroi intestinale et s'implante sous la paroi stomacale en formant l'oocyste. A l'intérieur de cet oocyste (brève phase diploïde) se forment plusieurs sporoblastes, dans lesquels se développent des milliers de sporozoïtes par sporogonie. Ces sporozoïtes haploïdes et mobiles perforent la coque de l'oocyste, puis passent dans l'hémolymphe pour aboutir au niveau des glandes salivaires où ils vont acquérir leur pouvoir infectieux. Cette phase dure une quinzaine de jours, suivant la température extérieure [9].

La phase humaine du cycle de développement de Plasmodium est constituée de deux parties : un cycle exo-érythrocytaire et un cycle érythrocytaire.

v Cycle exo-érythrocytaire: Cette première phase du cycle chez l'Homme se déroule au niveau hépatique. Lors d'une piqure, l'anophèle femelle portant des sporozoïtes infectieux dans sa salive les injecte dans un capillaire. En moins d'une demi-heure, ces sporozoïtes migrent rapidement vers le foie via la circulation sanguine, et envahissent les hépatocytes dans lesquels se déroule la phase hépatique. Dans les hépatocytes, les sporozoïtes se développent en trophozoïtes qui subissent une multiplication immédiate (schizogonie hépatique) pour donner des schizontes renfermant des mérozoïtes. A maturité, les schizontes hépatiques éclatent et libèrent des milliers des mérozoïtes dans la circulation sanguine, capables d'infecter les globules rouges. La phase exo-érythrocytaire est asymptomatique et dure 10 à 15 jours. Cependant, chez certaines espèces plasmodiales (P. ovale, P. vivax), on retrouve des persistances hépatiques (hypnozoïtes) qui peuvent rester cachées plusieurs mois ou années sans se multiplier pour reprendre le cycle plus tard: le stade cryptozoïte.

Cycle érythrocytaire: Les mérozoïtes issus de la phase hépatique, présents dans la circulation sanguine, envahissent les globules rouges. Dans ces derniers, les mérozoïtes se développent d'abord en anneau, puis en trophozoïte. Pendant ce stade, une intense activité métabolique (approvisionnement en acides aminées, synthèse nucléique et protéique) se réalise; le parasite peut dégrader jusqu'à 75% d'hémoglobine de la cellule hôte pour se nourrir et former le pigment malarique. Au bout d'une trentaine d'heures après l'invasion, le parasite commence sa division nucléaire: c'est la schizogonie érythrocytaire. L'éclatement des schizontes mûrs libère, dans le sang, des mérozoïtes et des déchets métaboliques (pigments et débris cellulaires pyrogènes responsables des accès de fièvre). Ceci s'accompagne également d'un relargage d'antigènes parasitaires dans le sang. Cette nouvelle génération de mérozoïtes réinfecte rapidement les érythrocytes. La phase érythrocytaire qui dure environ 48 heures induit un spectre de symptômes chez l'homme responsable de la morbidité et de la mortalité associés à l'infection. Après quelques cycles érythrocytaires, des gamétocytes se différencient en gamétocytes mâles et femelles, lesquels ne pourront poursuivre leur évolution que chez le moustique. Ils restent vivants une vingtaine de jours chez l'hôte humain puis disparaissent. Ces éléments n'évolueront plus, mais ils persisteront dans le sang de l'homme qui est alors le « réservoir du parasite ». Avec P. falciparum, et lui seul, toute la fin de la schizogonie se fait dans les capillaires

L'infection asymptomatique ou paludisme d'infestation se définit comme étant l'absence de manifestations cliniques chez un individu présentant des formes asexuées du parasite à l'examen du sang périphérique. Un tel sujet est un porteur sain et constitue un important réservoir du parasite en zone d'endémie. Ce portage asymptomatique peut évoluer à tout moment vers un paludisme clinique simple ou grave.[11].

C'est l'expression d'une infection symptomatique sans signes de gravité et/ de dysfonctionnement des organes vitaux. [12]. La période d'incubation de la maladie varie de 9 à 30 jours, selon l'espèce plasmodiale, son mode de transmission, le statut immunitaire de l'hôte, la chimio-prophylaxie antipaludique utilisée et la densité des inocula parasitaire. Une période d'incubation courte (9 à 14 jours) est typique de P. falciparum [13].

Les manifestations cliniques courantes du paludisme simple ne sont pas spécifiques, et imitent ceux d'autres maladies telles que le syndrome pseudo-grippal. Elles comprennent, fièvre, frissons, sueurs, nausées et vomissements, courbatures, myalgies, céphalées, troubles digestifs, sensation générale de faiblesse. L'hypertrophie de la rate ou du foie, l'augmentation de la fréquence cardiaque ou respiratoire, le jaunissement des yeux, peuvent s'ajouter. Le syndrome fébrile reste cependant un symptôme clé dans le diagnostic du paludisme simple.

Selon l'OMS, le paludisme grave se définit par la présence de formes asexuées de P. falciparum à l'examen microscopique du sang périphérique, associée à une ou plusieurs des manifestations cliniques telles que l'altération de l'état de conscience, les convulsions généralisées et répétées, l'anémie sévère, l'insuffissance rénale, loedème aigu du poumon, l'hypoglycémie, collapsus circulaire, etc. [14]:

Le neuropaludisme et l'anémie grave sont les complications majeures du paludisme à P. falciparum. Plusieurs théories probablement complémentaires sont actuellement retenues, notamment la séquestration d'hématies parasitées par des formes matures de Plasmodium, adhérant aux cellules endothéliales des microvaisseaux, et l'intervention de cytokines ou autres médiateurs.

Primum movens : la cytoadhérence: elle existe entre les globules rouges parasités par les stades asexués « matures » (trophozoïtes âgés, schizontes) et les cellules endothéliales vasculaires. et est responsable :

· d'un ralentissement du flux sanguin dans les capillaires (phénomène mécanique) ;

· d'une réaction inflammatoire tissulaire cytokinique (phénomène inflammatoire).

La Séquestration consiste chez les hématies parasitées par les stades trophozoïtes âgés et schizontes de P. falciparum qui ont, contrairement aux autres espèces, la capacité de se fixer aux cellules endothéliales des capillaires (cerveau, avec risque de coma par neuropaludisme, mais aussi reins, foie, poumons...). Ces formes matures sont donc absentes de la circulation sanguine périphérique. Cette séquestration est due à des phénomènes d'adhérence cellulaire (cytoadhérence)[15] entre les hématies parasitées et les cellules endothéliales de ces capillaires, sous la dépendance d'interactions entre des récepteurs moléculaires plasmodiaux présents à la surface des hématies parasitées (en particulier PfEMP1) et des récepteurs spécifiques des cellules endothéliales (en particulier ICAM1). Le blocage des hématies parasitées dans les capillaires provoque un ralentissement circulatoire, directement proportionnel au nombre d'hématies parasitées (phénomène mécanique). Cette séquestration est de plus amplifiée par une déformabilité moindre des hématies parasitées et par la formation de « rosettes » (agrégats constitués d'une hématie parasitée à laquelle adhèrent plusieurs hématies non parasitées). Le ralentissement de la circulation capillaire provoque une hypoxie tissulaire, qui active le métabolisme cellulaire de glycolyse anaérobie avec pour conséquence l'acidose lactique et des dysfonctions organiques. Une autre conséquence de cette cytoadhérence est la mort par apoptose des cellules endothéliales qui présentent à leur surface les antigènes plasmodiaux exposés après la rupture du schizonte, les restes de la membrane du globule rouge éclaté restent « collés » à la cellule endothéliale. Lorsque la parasitémie est élevée, la résultante de cette apoptose intense est la perméabilisation de la paroi des microvaisseaux avec apparition de micro-hémorragies tissulaires (visibles à l'observation du fond d'oeil). Contrairement aux étapes précédentes, ce phénomène n'est pas réversible et, dans ce cas, l'évolution est très souvent défavorable (séquelles, décès)[16]

La pénétration et le développement intraérythrocytaire de Plasmodium déterminent des modifications des cellules-hôtes, et constituent la cause principale de l'anémie palustre. Bien que non expliquées, les modifications des érythrocytes parasités ont été abondamment décrites Nous rappellerons l'existence de << knobs )) ou excroissances, localisées sur le plasmalemme des hématies parasitées Ces excroissances sont responsables de l'adhésion des érythrocytes parasités aux endothéliums capillaires et peuvent expliquer la séquestration des hématies parasitées dans les capillaires viscéraux .

:1.6 Les marqueurs de virulence de Plasmodium falciparum

La virulence d'un agent infectieux mesure sa capacité à se développer dans un organisme (pouvoir invasif) et à y sécréter des toxines (pouvoir toxique ) [17]. Dans notre cas, c'est donc la capacité du Plasmodium falciparum à infecter l'Homme et à induire ensuite une pathologie. La présentation clinique de l'infection plasmodiale causée par P.falciparum. va de l'infection asymptomatique à l'infection fébrile aiguë modérée à l'infection grave et compliquée avec insuffisance organique [18]. Bien que les facteurs contribuant à ce large spectre de symptômes n'aient pas encore été bien caractérisés, certains auteurs pensent que la virulence parasitaire est un facteur contributeur important[19], [20]. De ce fait, il serait donc nécessaire de déterminer les souches de Plasmodium responsables ou pas de la symptomatologie clinique. Pour ainsi mettre en évidence ces différentes souches et en déterminer le lien avec la virulence du parasite, plusieurs études ont été menées sur certains gènes tels que le Pfmsp1, Pfmsp2, ama1, Pfmp1 etc. Or, un lien clair entre ces gènes et la symptomatologie clinique n'a pas encore été bien établi d'où la nécessité de caractériser la virulence de Plasmodium en utilisant ces marqueurs.

Pfmsp1 et 2 sont parmi les cibles du vaccin contre le paludisme au stade sanguin jouant un rôle important dans l'identification des espèces génétiquement distinctes des sous-populations parasitaires de P. falciparum[21]. Ils sont impliqués dans l'invasion des érythrocytes et sont ciblés par les réponses immunitaires '''''''''''''''''''[22]. Pfmsp 1 est une protéine de surface de plus de 190 KDa situé sur le chromosome 9 et contient 17 blocs de séquences flanqués de régions conservées . Le bloc 2, qui est la partie la plus polymorphe de Pfmsp 1, est regroupé en trois familles alléliques à savoir K1, MDA20 et R033 . Pfmsp 2 est une glycoprotéine situé sur le chromosome 2 et composé de cinq blocs dont le bloc central est le plus polymorphe [18]. Lamsp2 les allèles sont regroupés en deux familles alléliques, F7 et 3D7/IC1 [23]

Figure 3: Représentation schématique du gène Pfmsp 1 de P.falciparum montrant les 17 domaines [24]

Figure 4: Diagramme schématique du gène Pfmsp 2 illustrant les blocs 1 à 5 [24]

Figure 4: Diagramme Schématique du gène msp-2 illustrant les bloc 1 à 5

D'autres marqueurs tels que ;Apical Membrane Antigene 1, PfEMP1, Pfmsp 3, Eba 175 pourraient jouer un rôle important dans la virulence et le polymorphisme de P .falciparum.

Le Gabon est un pays d'Afrique Centrale situé en zone équatoriale, sa population est estimée à 2119000 habitants, il est limité à l'ouest par l'Océan Atlantique, à l'est, au sud-est et au sud par la République du Congo, au nord-ouest par la Guinée équatoriale et au nord par le Cameroun.

Le climat chaud et humide que l'on retrouve au Gabon est favorable au développement de l'anophèle. C'est une zone où la transmission est encore hyper-endémique-----------[26], [27]. P. falciparum est l'espèce parasitaire prédominante au Gabon, suivie de Plasmodium malariae ------------[26]-[28]. D'après le Programme National de Lutte contre le Paludisme (PNLP), le paludisme est responsable de la consultation médicale de 45% des enfants et 71% des femmes enceintes au Gabon[29]. Mais, peu de données existent sur la géographie de cette maladie meurtrière

Le lien entre la virulence de Plasmodium et les marqueurs de virulence étudiés au Gabon n'est pas clairement établi. Cependant, des études sur le polymorphisme génétique de P. falciparum ont permis de décrire la diversité génétique de ce parasite dans différentes régions au Gabon, aussi bien chez les patients présentant un paludisme simple à sévère que chez les enfants asymptomatiques-----[30], [31].

Ces études basées sur l'amplification des gènes msp-1 et msp-2 avaient pour objectif de caractériser le profil génétique des isolats de Plasmodium dans le but ultime d'une possible élimination du paludisme. L'étude de msp-1 montre une grande diversité allélique de ce gène, qui serait compatible avec le niveau élevé de transmission du paludisme au niveau de Libreville-----[30]. Cette diversité génétique de P. falciparum est cependant très variable d'une région à une autre.-----[30], [31]. De plus une prédominance de l'allèle K1 a été signalée au niveau du Gabon[31].

L'objectif général de cette étude est de déterminer les différents allèles associés au statut clinique chez les enfants infectés vivants dans notre zone d'étude..

Ø Déterminer la prévalence de l'infection plasmodiale chez les asymptomatiques et les symptomatiques ,

Ø Déterminer la prévalence des différentes espèces plasmodiales chez les asymptomatiques et les symptomatiques

Ø Déterminer la prévalence des coïnfections plasmodiales chez les asymptomatiques et les symptomatiques

Ø Comparer la distribution de Pfmsp 1 et 2 des différentes espèces plasmodiales en fonction du statut clinique

3.1. Caractéristiques de l'étude

Il s'est agi d'une étude observationnelle à visée descriptive et analytique, privilégiant une approche pluridisciplinaire qui associe l'épidémiologie et la biologie moléculaire

.3.1.1. Type et période d'étude

Cette étude a été réalisée entre Avril 2022 et Septembre 2022 au sein de l'Unité d'Epidémiologie, d'Evolution et de Résistance Parasitaire (UNEEREP) du Centre Interdisciplinaire de Recherche Médicale de Franceville (CIRMF). Les échantillons analysés provenaient d'un recueil effectué entre 2013 et 2014, dans la région de Lastourville, incluant le centre médical de Lastourville, la ville de Lastourville, les villages de Matsatsa, Mikouyi, Malende et Mana-Mana, dans le département de Mulundu (province de l'Ogooué-Lolo, Sud-Est du Gabon).

Les prélèvements sanguins pour les patients symptomatiques ont été réalisés sur des enfants reçus en consultation au Centre Médical de Lastourville. Quant aux enfants asymptomatiques, leurs prélèvements ont été réalisés dans les écoles au sein des différents villages inclus dans l'étude.

Le diagnostic microscopique et immunochromatographique (TDR) de l'infection plasmodiale a été réalisé sur les sites de récoltes d'échantillons tandis que les analyses moléculaires ont été réalisées au Centre Interdisciplinaire de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF).

Les sujets inclus dans cette étude étaient des enfants âgés de 6 mois à 15 ans, présentant un syndrome fébrile ou non, recrutés dans les sites mentionnés ci-dessus.

Pour les patients fébriles, les critères d'inclusion étaient les suivants :avoir consulté le service de pédiatrie externe pendant la période de l'étude , avoir une température corporelle supérieure ou égale à 37,5°C ou une histoire de fièvre durant les 24 heures précédents, être âgé de 6 à 180 mois , avoir un test diagnostique rapide (TDR) positif, et présenter au moins un critère spécifique au paludisme selon les recommandations de l'OMS (notamment la fièvre). Pour les asymptomatiques, les individus ne devaient présenter aucun signe de fièvre durant les 7 jours précédant le prélèvement. Pour les mineurs le consentement éclairé a été signé par un tuteur. Les enfants dont les tuteurs n'ont pas donné leur consentement n'ont pas été inclus dans l'étude.

Le prélèvement sanguin a été réalisé au pli du coude dans un tube contenant de l'EDTA ou par piqure franche au bout du doigt (pulpe du doigt). Après réalisation des différents tests de diagnostics du paludisme, les prélèvements ont été séparés par centrifugation à 1500 tours/ minutes afin d'obtenir le culot globulaire et le plasma. Les culots globulaires ont été transférés dans des tubes Eppendorff puis conservés à -20°C, pour l'extraction de d'ADN.

Le diagnostic du paludisme a été réalisé par la technique de la Goutte épaisse, le test de diagnostic rapide du paludisme (TDR, kit optimal-It). Le diagnostic des différentes espèces plasmodiales a été réalisé par analyse moléculaire.

Le test de diagnostic rapide du paludisme (TDR), est un test immuno-chromatographique qui utilise des anticorps monoclonaux dirigés contre la lactate déshydrogénase spécifique à P. falciparum (pfLDH) et une LDH commune aux espèces de Plasmodium (pan-LDH) [22]. Ce test contient un dispositif prêt à l'emploi, constitué d'une cassette (contenant deux puits, puits lavage et puis conjugué) et d'une bandelette. La réalisation de celui-ci consiste à mettre une goutte de tampon dans le premier puits (puits conjugué), 4 gouttes dans le deuxième puits (puits lavage), qu'on laisse reposer 1 minute. Dix microlitres (10 ìl) de sang ont été ensuite prélevé à l'aide de la pipette et déposé dans le premier puits. Après homogénéisation, le produit a été laissé au repos pendant 1 minute, puis, le support de la bandelette a été retiré et l'extrémité de la bandelette été mise dans le puits conjugué. Après 10 minutes d'incubation, la bandelette a ensuite été transférée dans le puits-lavage, et a été à nouveau incubée pendant 10 minutes. Une fois le lavage terminé, la bandelette est mise dans la pièce plastique transparente pour effectuer la lecture. Le test est validé lorsque la bande contrôle apparait et l'interprétation est fonction du nombre de bande qui apparait sur la bandelette (voir Figure 6).

Figure 6: Représentation schématique de la réalisation d'un TDR( kit-optimal-it)

(1) -identification de bandelette, (2) - remplissage des puits avec le tampon de lyse, (3) -prélèvement sanguin à la pulpe du doigt, (4) - dépôt du sang dans le tampon, (5) -homogénéisation et lyse, (6) - migration chromatographique (10 minutes) (7) - lavage 10 minutes, (8) mise de la bandelette dans la pièce plastique, (9) - interprétation des résultats.

La goutte épaisse permet la mise en évidence des parasites dans le sang mais aussi leur quantification. Elle a été réalisée selon la méthode de Lambaréné qui consiste à étaler sur une lame porte-objet propre et dégraissée 10ìl de sang sur une surface de 18×10 mm². Après étalement, la lame est séchée puis colorée pendant 25 minutes au Giemsa à 20%. La lame est ensuite lue au microscope optique à l'objectif ×100 en utilisant de l'huile à immersion. La parasitémie a été déterminée en nombre de formes asexuées de Plasmodium et calculée en utilisant la formule suivante : Parasitémie = X × 500 parasites / ìl de sang. X= moyenne de parasites obtenus à partir de 10 champs microscopiques, 500= facteur correcteur (varie en fonction du microscope).

L'extraction d'ADN par le kit Blood DNA E.Z.N.A^® est basée sur la chromatographie d'affinité, elle consiste à mélanger, 250ìL du culot globulaire, 25ìL d'OB protéase (20mg/ml), 250ìL de tampon de lyse (BL) dans un tube Eppendorff. Le mélange est incubé à 65°C pendant 10 minutes au minimum (on homogénéise toutes les 3 minutes). A la fin de l'incubation, 260ìL d'éthanol absolu sont ajoutés, puis le mélange est homogénéisé. Une colonne d'extraction est ensuite équilibrée avec 100ìL de tampon d'équilibration pendant 4 minutes à température ambiante et centrifugée brièvement pendant 20 secondes. Le lysat est transféré dans la colonne puis centrifugé pendant une minute à 10000g. La colonne est transférée dans un nouveau tube collecteur et 500ìL de tampon HB sont ajoutés puis centrifugée pendant 1 minute à 10000g. Après centrifugation, la colonne est à nouveau transférée sur un tube collecteur et lavée deux fois avec 700ìL de DNA Wash buffer reconstitué avec de l'éthanol à 70%. Elle est ensuite centrifugée pendant une minute à 10000g, puis séchée par centrifugation pendant 2 minutes à 13000g. La colonne est ensuite placée dans un tube Eppendorff stérile de 1,5ml. Pour l'élution de l'ADN, 90ìL d'eau distillé préchauffée à 65°C, ont été déposé sur la colonne, que l'on laisse reposer 5 minutes à température ambiante. La colonne est ensuite centrifugée pendant une minute à 10000g, pour l'élution de l'ADN, l'élution est répétée une seconde fois. L'ADN recueilli dans le tube Eppendorff est conservé à -20°C.

Amplification pour le diagnostic moléculaire d'espèces

La PCR est une technique de réplication in vitro qui permet à l'aide d'amorces spécifiques d'amplifier un fragment d'ADN extrait. Pour le diagnostic moléculaire, nous avons utilisé la méthode de Snounou [33]. Les différentes étapes de la PCR, ainsi que les différents couples d'amorces sont consignées dans les tableaux 2 et 3 ci-dessous :

Tableau 2: Séquences des amorces utilisées pour le diagnostic moléculaire et tailles des bandes attendues

Espèces	Amorces	Séquences des amorces (5'-3')	Tailles attendues (pb)
Plasmodium spp.	rPLU5	CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC	1100
	rPLU6	TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG
P. falciparum	rFAL1	TTAAACTGGTTTGGGAAAACC AAATATATT	205
	rFAL2	ACACAATGAACTCAATCATGA CTACCCGTC
P. vivax	rVIV1	CGCTTCTAGCTTAATCCACAT AACTGATAC	120
	rVIV2	ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGA AAGTCCTTA
P. ovale	rOVA1	ATCTCTTTTGCTATTTTTTAG TATTGGAGA	800
	rOVA	GGAAAAGGACACATTAATTGT ATCCTAGTG
P. malariae	rMAL1	ATAACATAGTTGTACGTTAAG AATAACCGC	144
	rMAL2	AAAATTCCCATGCATAAAAAA TTATACAAA

Réaction	Conditions de PCR
PCR1 (P. falciparum, P. vivax, et P. malariae)	Dénaturation : 95°C pendant 5minutes, et 94°C pendant1 min, hybridation à 60°C pendant 2 min, et extension à 72°C pendant 2 min (30 cycles)
PCR1 (P. ovale)	Dénaturation : 95°C pendant 5minuteset 94°C pendant 30 s, hybridation à 45°C pendant 30 s, et extension à 72°C pendant 1 min 30 s (30 cycles)
Nested -PCR (P. falciparum, P. vivax, et P. malariae)	Dénaturation : 95°C pendant 5minutes et 94°C pendant 1 min, hybridation à 55°C pendant 2 min, et extension à 72°C pendant 2 min (30 cycles)
Nested- PCR (P. ovale)	Dénaturation : 95°C pendant 5minutes et 94°C pendant 30 s, hybridation à 45°C pendant 30 s, et extension à 72°C pendant 1 min 30 s (45 cycles)

Le milieu réactionnel contient : 0,024U de Taq polymérase, du tampon1X (composition en annexe), 1,5mM de Mgcl2, 0,2mM de dNTPs 0,8mM d'amorce direct et 0,8mM d'amorce reverse. Dix microlitres (10ìL) d'ADN extrait ont été rajoutés au milieu réactionnel pour la PCR1. Pour la deuxième PCR, le même milieu réactionnel est utilisé, mais l'on rajoute 2ìl d'amplicons de la première PCR. La réaction est effectuée dans un thermocycler Bio Rad® (Mercure de coanette, France). Les fragments d'ADN amplifiés sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2%.

Electrophorèse

C'est une méthode qui permet de séparer différents fragments d'ADN en fonction de leurs poids moléculaires. Du gel d'agarose à 2 % a été préparé dans un volume de 150mL de TAE 1X (voir annexe) puis chauffé dans un four à micro-onde, pendant 3 minutes. Le GelRed (15uL) y est ajouté comme colorant nucléaire. Ce mélange est mis dans la cuve à électrophorèse avec un peigne et laissé à polymériser environ 20 minutes à température ambiante. Après polymérisation le gel est déposé dans l'appareil à électrophorèse. Les échantillons y sont ensuite déposés après homogénéisation avec du bleu de charge et la migration se fait dans du tampon TAE 1X pendant 2h à 100V. La révélation est faite sur une table à UV (560nM).

3.2.2 Analyse des données

les résultats des analyses moléculaires ont été saisis sur un fichier Excel et analysés par le logiciel R version 3.4.0 (2017-04-21). La fréquence allélique de Pfmsp1 et Pfmsp2 a été calculé comme la proportion de l'allèle détecté pour chaque famille allélique sur le total des allèles détectés. La fréquence d'infection polyclonale a été calculée en utilisant le nombre d'échantillons avec plus d'un fragment amplifié sur le total des échantillons. Le MOI moyen a été déterminé en divisant le nombre total d'allèles détectés dans les deux Pfmsp1 et Pfmsp2 par le nombre total d'échantillons positifs pour les deux marqueurs .Le test du Chicarré a été utilisé pour comparer les proportions. La signification statistique a été définie comme p <0,05.

4.1 Caractéristiques de la population d'étude

4.1.1. Description de la population d'étude

Au total, 876 enfants dont 401 fébriles et 475 non fébriles ont été inclus dans cette étude.,. La moyenne d'âge des enfants infectés asymptomatiques était plus élevée (59#177;2 mois) par rapport à celle des enfants infectés symptomatiques (34,01#177;2 mois) (p= 0,03). Par ailleurs aucune différence significative au niveau du sexe ratio n'a été observée entre les infectés symptomatiques (sex-ratio= 1) et les asymptomatiques (Sex-ratio= 0,7 ; p =0,3).

La prévalence globale de l'infection plasmodiale était de 51,2% (N = 449). Dans cette localité, la prévalence de l'infection asymptomatique était de 42,3% (n = 201/449) et celle de l'infection symptomatique était de 61,9% (n = 248/449). Ces deux fréquences étaient statistiquement différentes, p = 0,002 (Tableau 7).

Le diagnostic moléculaire a permis d'identifier les différentes espèces plasmodiales circulants dans la région d'étude et de les répartir suivant le statut clinique. Dans l'ensemble de nos échantillons, P. falciparum était l'espèce plasmodiale majoritaire avec des prévalences de 99,1% (n = 119) et de 75,12% (n=151) chez les symptomatiques et asymptomatiques, respectivement. Cette prévalence était significativement plus élevée chez les symptomatiques par comparaison aux asymptomatiques (p=0,002). Pour ce qui est de P. malariae les cas de mono infections n'ont été identifiés que chez les asymptomatiques, avec une prévalence de 6,02% (n=10). Par contre chez les patients symptomatiques, P. malariae n'a été retrouvé qu'en coinfection avec P.falciparum. La prévalence de la coinfection P. falciparum + P. malariae était significativement différente entre les deux groupes (p< 0,05).

4.2.2. Caractérisation de la virulence

Sur les 186 échantillons génotypés pour les deux gènes d'interêt; 97,9% (182/186) et 96,2% (179/186) d'amplicons ont été obtenus pour les gènes Pfmsp-1 et Pfmsp-2, respectivement.

Les fréquences globales des familles alléliques du gène Pfmsp-1 n'étaient pas significativement différentes (80%, 146/182 ; 90%, 164/182 et 78%, 142/182, pour K1, Mad20 et RO33 respectivement; p>0,05). Cependant, la famille allélique RO33 s'est avérée plus fréquente dans les isolats symptomatiques (93%; 120/129) comparés aux asymptomatiques (38% ; 22/57), p=0,001. Par contre aucune différence significative de fréquence pour les familles alléliques K1 et Mad20 n'a été observée entre symptomatiques (K1=82% ,107/129 ; Mad20=91%,118/129) et asymptomatiques (K1=68%, 39/57 ; Mad20=80% ,46/57) (p > 004 ; Tableau 3)

Pour ce qui est des familles alléliques du gène Pfmsp-2, la fréquenc de 3D7 (91%, 163/179) était significativement plus élevée que celle de F7 (55%, 99/179) (p=0,002). Cependant, la fréquence de la famille allélique n'était pas significativement différente en fonction du statut clinique.. La famille allélique F7 quant à elle n'a été observée que dans les isolats asymptomatiques avec une fréquence de 78%. (Tableau 3).

*Pfmsp1*	Familles alléliques	Global % (n/N)	p	Symptomatiques	Asymptomatiques	p*
	K1 %	80 (146/182)	0,6	82 (107/129)	68 (39/57)	0,4
	Mad20 %	90 (164/182)		91 (118/129)	80 (46/57)	0,6
	RO33 %	78 (142/182)		93 (120/129)	38 (22/57)	0,001
*Pfmsp2*	3D7 %	91 (163/179)	0,002	88 (114/129)	85 (49/57)	0,9
	F7 % (N/T)	55 (99/179)		0%	78 (45/57)	<0,05

Des coinfections des familles alléliques K1, Mad20 et RO33 du gène Pfmsp1ont été détectées dans 87% (158/182) des cas. Dans l'ensemble, la triple infection K1_Mad20_RO33 était la plus fréquente avec une fréquence de 69% (109/158), P<0,05, Les doubles infections RO33-Mad20, K1_Mad20 et K1_Ro33 avaient des fréquences inférieures à 20%.

Dans l'ensemble, la proportion d'infection polyclonale était significativement plus importante dans les isolats d'enfants symptomatiques (121/158 soit 76%) comparés aux asymptomatiques (37/158 soit 24%), P<0,005. Par ailleurs, la proportion des combinaisons K1_Mad20 était significativement plus importante dans les isolats asymptomatiques comparés aux symptomatiques. Mais aucune différence significative de fréquence des autres combinaison alléliques (R033 et K1-RO33) n'a été mise en évidence entre symptomatiques et asymptolatiques.

S'agissant du gène Pfmsp2, des combinaisons des familles alléliques 3D7 et F7 ont été mis en évidence dans 45% d'échantillons analysés (80/179). La fréquence d'infections polyclonales n'était pas significativement différente entre symptomatiques (52,5%) et asymptomatiques (47,5%) pour cette combinaison allélique , p=0,7.

Les allèles identifiés ont été classés selon leurs tailles. Un total de 31 allèles individuels des deux gènes ont été identifiés chez l'ensemble de sujets. Vingt trois (23) allèles différents du gène Pfmsp-1 ont été observés (15 pour K1, 6 pour Mad20, et 1 pour RO33) avec des tailles de fragments allant de 200, 210, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 380, 400, 460, 500, 580, à 600 paires de bases. De plus 8 allèles du gène Pfmsp-2 différents, avec des tailles de fragments allant également de 200 ,210, 300, 320, 380, 400, 500, à 600 paires de bases ont été trouvés, dont 2 appartenant à la famille allélique 3D7 et 6 appartenant à la famille allélique F7. Le gène msp-2 (24%, 8/31) était moins polymorphe que Pfmsp-1 (74%, 23/31), La famille allélique RO33 s'est avérée monomorphe (avec une taille de fragment amplifiée de 200 Pb) et représentait 4,4% (1/23) de tous les génotypes Pfmsp-1. Les allèles de types K1 et Mad20 prédominaient avec des fréquences de 65% (15/23) et 26% ( 6/23) respectivement, P<0,05. Parmi les 23 allèles de K1, les allèles K1_200, et K1_300 , étaient les plus fréquents avec de fréquences respectives de 57% et 22% . Les autres allèles avaient des fréquences inférieures à 10%. Pour les allèles de type Mad20, Mad20_200 (52% ) et Mad20_300 ( 21%) étaient les plus fréquents. Dans les familles alléliques du gène Pfmsp-2, F7_200 (91,8%), 3D7_200 (97,5%) étaient les plus fréquemment rencontrés. La fréquence des autres allèles était inférieure à 10%.

Figure 8: Diversité allélique, polymorphisme de longueur de taille de fragments dans l'ensemble de la population

Figure 9. Diversité allélique, polymorphisme de longueur de taille de fragments dans l'ensemble de la population

Les différents profils alléliques variaient en fonction de la symptomatologie clinique. Pour le gène Pfmsp-2, 5 allèles différents ont été repéré dans les isolats d'enfants asymptomatiques ( 2 de type 3D7 et 3 de type F7) et 3 allèles ont été mis en évidence dans les isolats symptomatiques (1 de type F7 et 2 de type 3D7). Deux (2) allèles de type F7 (F7_ 400 et F7_480) ont uniquement été observés dans les isolat d'enfants asymptomatiques bien qu'ayant des fréquences inférieures à 20%. Cependant, pour les allèles identifiés à la fois dans les isolats symptomatiques et asymptomatiques, la fréquence de l'allèle F7_200 était significativement plus élevée dans les isolats symptotamiques comparés aux asymptomatiques P<0,05. Aucune différence significative de fréquences entre les deux statut pour les autres allèles n'a été observée, P>0,05.

En ce qui concerne le gène Pfmsp-1, 7 allèles différents ont été mis en évidence dans les isolats asymptomatiques ( 4 de type Mad20 et 3 de type K1) et 22 allèles différents ont été observés dans les isolats symptomatiques (K1=15, Mad20=7). Les allèles Mad20_400, Mad20_280, Mad20_260, K1_210, K1_ 220, K1_ 260, K1_ 280, K1_320, K1_ 340, K1_ 380, K1_ 400, K1_460, K1_ 500, K1_ 580, K1_600 ont été uniquement observés dans les isolats symptomatiques. Certains allèles étaient communs aux deux groupes sans aucune différence significative de fréquence, P>0,05. (Figure 15)

V. DISCUSSIONS

Le paludisme reste un fardeau dans diverses régions du monde. Si les infections symptomatiques sont diagnostiquées et traitées, le portage asymptomatique reste mal connu et constitue un frein pour les stratégies d'élimination du paludisme. Aussi, cette étude sur l'épidemiologie du paludisme et la virulence parasitaire chez les enfants gabonais vivants à Lastoursville (milieu Rural) est la première qui évalue d'une part la prévelance de l'infection plasmodiale asymptomatique et symptomatiques et d'autre part le polymorphisme génétique des gènes Pfmsp1 et Pfmsp2 dans cette localité.

La moyenne d'âge des enfants asymptomatiques plus élevée que celle des enfants symptomatiques observée dans cette étude pourrait s'expliquer par le fait que l'étude a été réalisée au sein d'une zone d'endémicité palustre, et l'âge est considéré comme étant l'un des facteurs en corrélation avec la prémunition dans les zones d'endémie palustre. En effet les jeunes enfants sont plus vulnérables, mais les adultes et les jeunes adolescents ayant acquis une forme d'immunité après plusieurs expostion au parasite sont plus susceptibles d'avoir présenté des infections asymptomatiques-'--[34]. Ils peuvent servir de réservoir de transmission car l'immunité anti palustre acquise conduit à une persistance de l'infection asymptomatique ou à des infections symptomatiques faibles qui sont souvent moins prises en charge par rapport aux infections aigues qui apparaissent chez des jeunes enfants [35] De plus, nos résultats corroborent ceux d'études antérieures ayant montrés que les enfants asymptomatiques sont souvent plus âgés que les enfants symptomatiques [35] -'--[34]

Une prévalence d'infection plasmodiale élevée a été observée dans l'ensemble de la population, cette observation est comparable à celles déjà décrites dans notre région d'étude - [36] [37]. Ceci pourrait être dû au niveau socio économique bas et de connaissance sur le paludisme des personnes vivant en zone rurale conduisant à une utilisation moins effective des moyens de prévention, lesquels ont un impact significatif sur la circulation de Plasmodium et la réduction de la prévalence de l'infection plasmodiale. De plus La proportion d'enfants fébriles portant une infection à plasmodiums falciparum. était significativement plus élevée que celle des enfants non fébriles. Cette observation Pourrait également s'expliquer par l'acquisition d'une prémunition avec l'âge chez les jeunes adolescents et les adultes vivants en zone endémique contrairement aux enfants de moins de cinq ans qui sont plus susceptibles de développer un paludisme [38]. Ces résultats diffèrent de ceux obtenus dans une étude réalisées au Cameroun en milieu rural qui énonce une prévalence significativement élevée chez les enfants asymptomatiques (30,7%) comparés aux symptomatiques (17,8%), aussi cela pouvait être du à un faible échantillon des asymptomatiques par rapport aux enfants symptomatiques pour notre étude. [39]. Les prévalences des infections asymptomatiques enregistrées dans cette localité restent néanmoins non négligeables, car les personnes atteintes d'infections plasmodiales asymptomatiques sont des réservoirs silencieux du parasite et posent un sérieux défi aux efforts de lutte contre la maladie en raison de leur capacité à maintenir la transmission au sein de la population à un faible niveau.

L'analyse du profil génétique de Plasmodium falciparum., obtenu après PCR, en fonction du type d'infection, peut fournir des informations utiles sur les caractéristiques de certains clones parasitaires spécifiques afin de concevoir des stratégies d'intervention ciblant les facteurs de virulence [40].

De façon globale, les résultats de notre étude ont montré que les trois familles alléliques K1, Mad20 et Ro33 du gène Pfmsp-1 et les deux familles alléliques 3D7 et F7 du gène Pfmsp-2 étaient présentes dans les échantillons analysés. La famille allélique 3D7 étant la plus fréquemment rencontrée. Des études réalisées au Gabon, au Burkina Faso et en Côte d'Ivoire ont décrit une fréquence élevée des familles alléliques K1 et 3D7[41] [42]. Aussi une étude menée à Libreville a montré que la diversité allélique de la famille Mad20 augmente avec la sévérité de la maladie [43] La famille allélique RO33 était la plus fréquente dans les isolats d'enfants symptomatiques par rapport aux asymptomatiques,. Cette famille allélique pourrait jouer un rôle important dans la survenue du paludisme, du moins au Gabon. Ceci est différent des données décrites dans la littérature car les familles allélique K1 et 3D7 ont souvent été associées à l'infection symptomatique [44] que RO33. La fréquence des familles alléliques F7 et 3D7 n'était pas différente entre symptomatiques et asymptomatiques, ce qui prouve qu'il n'existerait pas des variant spécifiques de Pfmsp2 qui pourraient être associés au statut clinique. Ces résultats sont appuyés par des études qui ont montré qu'il n'y avait pas d'association entre les familles alléliques F7 ou 3D7 et le type d'infection [45] . A l'inverse, une autre étude a rapporté une fréquence de la famille 'allélique F7 deux fois plus élevée dans les isolats symptomatiques par rapport aux asymptomatiques [46]. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour clarifier l'interprétation de ces résultats.

Un polymorphisme génétique élevé à modéré au sein des familles alléliques des gènes Pfmsp1et 2 a été observé dans les isolats de Lastoursville (23 allèles) pour Pfmsp-1 et 8 allèles pour Pfmsp-2). Nos résultats sont inférieurs à ceux décrits à Libreville (30 allèles), à Dielmo au Sénégal (33 allèles) en 1995 et au Burkina Faso en 2009 (41 allèles) mais identiques à ceux de Bakoumba près Franceville (25 allèles) en 1999 [47] [12] --[48]. Cette diversité allélique pourrait s'expliquée par le fait que la diversité génétique de P. falciparum varie aussi bien d'une région à une autre et au sein d'une même population [47]. Certains génotypes étaient communs entre symptomatiques et asymptomatiques, parmi ceux-ci l'allèle F7_200 était en proportion plus importante dans les isolats symptomatiques, contrairement aux autres allèles qui n'ont présenté aucune différence significative entre les deux groupes. Cela suggère que cet allèle pourrait avoir un lien avec la survenue de symptômes et donc la virulence. Par ailleurs, certains génotypes F7, différents ont été uniquement retrouvés dans les isolats asymptomatiques et d'autres génotypes différents de K1 et Mad20 ont été mis en évidence dans les isolats symptomatiques uniquement. Ces résultats confortent l'idée selon laquelle, certains clones parasitaires pourraient être responsables de l'état clinique d'un individu. Cependant, le lien entre l'état clinique et un génotype quelconque de P. falciparum reste un sujet à controverse. Car, de nombreuses études ont montré que la présence d'épisodes palustres subséquents pourrait être due à de nouveaux parasites infectieux [49].

VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Notre étude a montré une grande diversité génétique et des fréquences alléliques de Pfmsp1 et Pfmsp2 de P.falciparum dans les isolats provenant d'enfants asymptomatiques et symptomatiques de Lastourville et ses environs. La proportion d'enfants fébriles portant une infection à P.falciparum. était significativement plus élevée que celle des enfants non fébriles. K1 et 3D7 sont les familles alléliques les plus répandues. La famille allélique RO33 était la plus fréquente dans les isolats d'enfants symptomatiques par rapport aux asymptomatiques. La fréquence des familles alléliques F7 et 3D7 n'était pas différente entre symptomatiques et asymptomatiques, Plus de 50 % des infections sont classées comme infections polyclonales pour msp1contre 1/3 pour msp2. La grande diversité signalée peut renforcer l'utilisation de Pfmsp1et Pfmsp2 pour distinguer les infections recrudescentes des nouvelles infections dans les essais d'efficacité antipaludique au Gabon. Cependant, des investigations supplémentaires avec des techniques plus puissantes telles que l'électrophorèse capillaire, le microsatellite et le séquençage de l'ADN sont nécessaires pour mieux caractériser les parasites responsables du paludisme dans le pays.

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Notre étude portait sur la diversité génétique et la fréquence allélique des gènes Pfmsp 1 et 2 des isolats provenant d'enfants asymptomatiques et symptomatiques de la région de Lastourville. Nous avons utilisé deux marqueurs pour vérifier si une famille allélique de Pfmsp-1 ou 2 pouvait être spécifiquement associée aux symptômes du paludisme. L'objectif de cette étude était de déterminer les différents allèles associés au statut clinique chez les enfants infectés vivant dans notre zone d'étude. Nous avons mené une chez des enfants âgés de 6 mois à 15 ans fébriles et non fébriles à travers leurs isolats et un prélèvement sanguin a été effectué pour la réalisation d'une GE / FM et /ou TDR , L'extraction de l'ADN a été réalisé ensuite les espèces ont été identifiées à l'aide de la PCR nichée.,les gènes de Pfmsp1 et 2 ont été amplifiés par réaction en PCR nichée et les produits de la PCR ont été analysés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2 %. Les allèles ont été classés en fonction de leur poids moléculaire.

La caractérisation de la virulence avec les marqueurs Pfmsp1 et 2, a permis de mettre en évidence un important polymorphisme génétique au sein de ces deux gènes .

Notre étude a donc montré une grande diversité génétique et des fréquences alléliques de Pfmsp1et Pfmsp2. Cependant, des investigations supplémentaires avec des techniques plus puissantes sont nécessaires pour mieux caractériser les parasites responsables du paludisme dans le pays.

Our study focused on the genetic diversity and allelic frequency of the Pfmsp 1 and 2 genes of isolates from asymptomatic and symptomatic children in the Lastourville region. We used two markers to test whether a Pfmsp-1 or 2 allelic family could be specifically associated with malaria symptoms. The objective of this study was to determine the different alleles associated with clinical status in infected children living in our study area. We conducted a study in febrile and non-febrile children aged 6 months to 15 years through their isolates and a blood sample was taken for the realization of a GE / FM and / or TDR, DNA extraction was performed then the species were identified using nested PCR., the Pfmsp1 and 2 genes were amplified by nested PCR reaction and the PCR products were analyzed by electrophoresis on a 2% agarose gel. The alleles were classified according to their molecular weight.

The characterization of the virulence with the markers Pfmsp1 and 2, made it possible to highlight an important genetic polymorphism within these two genes.

Our study therefore showed a great genetic diversity and allele frequencies of Pfmsp1 and Pfmsp2. However, further investigations with more powerful techniques are needed to better characterize the parasites responsible for malaria in the country.