Memoire Online - Les éléments transposables: le cas du transposon mariner une approche expérimentale

Université de Tébessa
Faculté de sciences : Institut de la science de la nature/vie
Département de Biologie

Je dédis ce travail à mon très cher père qui nous a quitté très tôt. Que dieu lui garde dans ses vastes paradis. Je le dédis spécifiquement à ma mère qui m'a beaucoup soutenu et à mes frères, mes soeurs, mes beaux frères, mes belles soeurs, mes cousins et cousines surtout Hasna, je vous apprécie beaucoup.

Je dédis ce travail à tout mes amis, ceux de BirMokadem surtout Rabab et Rawia, et ceux de Tébessa surtout Fatima, Hassina, Zina, Dalel et Meriem, Je vous respecte beaucoup, et je vous souhaite le meilleur.

Je remercie l'université de Tébessa surtout le département de Biologie qui nous a ouvert les portes pour l'obtention du diplôme des études supérieures en Biochimie.

Un remerciement très chaleureux est dirigé vers Docteur Halaimia-Toumi Nassima pour son encadrement, sa grande patience et sa gentillesse, merci également pour le temps que vous avez consacré pour la correction de ce manuscrit.

Figure 1.1 : L'organisation génomique des différentes familles des rétrotransposons à LTR.

Figure 2 : Organisation structurelle des rétroposons. Figure 2.1 : Modèle de rétrotransposition de l'élément L1. Figure 3 : La structure d'une séquence d'insertion (IS1).

Figure 3.1 : La duplication du site cible lors de l'insertion d'un élément transposable par la coupure cohésive effectuée par la transposase.

Figure 3.2: La structure du transposon Tn10, les IS sont orientées en sens inverse et forme des ITR.

Figure 3.4: Le mécanisme général de la transposition conservative. Figure 4: structure de l'élément Ac.

Figure 4.1 : La structure et l'épissage somatique et germinale de l'élément P. Figure 4.2: Structure de l'élément Helitron du maïs.

Figure 5: Effet de l'insertion du rétrotransposon à LTR, Tnt1, sur les transcrits du gène nia2 codant la nitrate réductase chez Nicotiana tabacum.

Figure 5.1 : Origine du système immunitaire des mammifères par coaptation de l`activité transposase d`un élément transposable.

Figure 6 : Résumé des expériences conduisant à la découverte du transposon mariner. Figure 6.1: La structure générale des TLEs et des MLEs.

Figure 6.3 : Structure générale de la transposase des MLEs (ici la transposase de Mos1). Figure 6.4 : Structure de la transposase des TLEs (ici la transposase de Sleeping Beauty). Figure 6.5: Schéma du mécanisme de transposition des MLEs.

Figure 6.6: Représentation schématique des différents complexes transposase/ITR. Figure 6.7 : Les étapes de l'excision d'un élément de type mariner.

Figure 6.8 : Les différentes étapes de la transgénèse à l'aide de mariner chez la souris. Figure 7 : Les différentes étapes de la technique PCR.

Figure 11 : Localisation des différents motifs et zones conservées sur la séquence consensus des éléments Alvcmar. Lettres en gras : ITR, lettres en bleu : UTR, lettres surlignes en gris : hélices á et HTH.

Figure 12 : Expression de la transposase fusionnée à la MBP par le plasmide pMAL.

Figure 13 : Le clonage du gène de la transposase mariner ligué avec le plasmide pMAL dans une bactérie.

Figure 18 : Analyse de la spécificité de la fixation de la transposase Bytmar avec leurs ITRs (Conditions expérimentales 30°C-2h).

Figure 20 : Analyse en test de coupure de la transposase Alvcmar avec la construction 5T5.

Figure 22 : Les différents étapes permettant la construction de vecteur porteur de gène da la transposase.

Figure 23 : Les différentes étapes de construction du vecteur pBC KC (+) porteur du pseudotransposon.

Figure 24 : Les différentes constructions de pBC porteur de pseudo-transposon réalisées.

Figure 25 : Une représentation schématique de la transposition inter-plasmidique obtenue avec la transposase Mos1 au cours des tests de transposition in vivo.

Tableau 2 : Les différences nucléiques entre les MLEs et les TLEs. Tableau 3: les différences protéiques entre les MLEs et les TLEs. Tableau 4 : Quelques éléments mariner potentiellement actifs.

I.2.2.8. Le groupe des éléments de la super famille IS630/Tc1/maT/mariner : 40

III.1.5.1. La Co-suppression transcriptionnelle: 51

Partie II : Caractérisations et fonctionnalité des transposons de type

III. Fonctionnalité des MLEs : 62

III.3.1. Recherche des éléments mariner à partir de l'ADN génomique par PCR : 70

III.2.1.4.1.1. Analyse de la liaison des transposase de type mariner aux ITRs : 81

III.2.1.4.1.2. Test de spécificité de liaison des transposases de type transposase mariner aux ITRs : 83

III.2.1.4.1.3. Test de coupure des transposases de type mariner : 84

III.2.1.4.2.1. Construction des vecteurs permettant l'expression de la transposase mariner : 87

III.2.1.4.2.2. La construction de plasmide pBC KS(+) contenant le pseudo transposon : 88

III.2.1.4.2.3. Réalisation des tests de transposition in vivo : 90

Résumé

« L'ADN » est la structure de base de toute être vivant. Il était considéré comme une structure figée, hors la découverte des gènes sauteurs par Barbara McClintock (1953) a révolutionné le trajet de la génétique et la biologie moléculaire. Les gènes sauteurs ou les éléments transposables sont des séquences répétées dispersées dans les chromosomes. Ils codent pour des protéines spécifiques, ces dernières assurent son déplacement par un phénomène appelé transposition. Les éléments transposables sont subdivisés en deux classes ; les éléments de la classe I ou les rétrotransposons qui utilisent un intermédiaire ARN et les éléments de la classe II qui se transposent directement par un intermédiaire ADN en utilisant une enzyme spécifique appelée transposase. Ils affectent leurs génomes hôtes selon plusieurs façons et ils subissent des systèmes de régulation très particuliers. Le transposon mariner est un transposon de classe II qui appartient à la super famille Tc1/mariner. Il est le transposon le plus simple connu chez les eucaryotes. Cette simplicité à fait l'objet de plusieurs travaux pour définir toutes ses propriétés et les particularités de son mécanisme de transposition. La caractérisation d'un élément mariner à partir d'un organisme fait appel aux techniques connues de biologie moléculaire et l'activité de la transposase peut être testé in vivo ainsi qu'in vitro.

En effet, les résultats de ces études ont montré d'une part que mariner est bel et bien un bon candidat en vectorologie. Et en d'autre part, elles ont ouvert des perspectives promotrices pour son utilisation large dans le monde de transfert de gènes.

Introduction et Historique

Les génomes ont été considérés comme des structures fixes qui obéissent aux règles simples de transmission des caractères proposées par Mendel (in Rivière, 2000), cependant, dès les années 1950s, Barbara McClintock qui étudiait le maïs mettait en évidence la présence de séquences mobiles, responsables de la création de nouvelles mutations (Renault et al, 1997).

McClintock a analysé les cassures des chromosomes du maïs (il possède 10 chromosomes numérotés de 1 à 10 du plus long au plus court respectivement) et a attiré l'attention sur le clivage très fréquent du chromosome 9 dans un locus très particulier. Elle a constaté que ce clivage était dû au comportement de 2 facteurs: un facteur appelé Ds (pour dissociation) qui est situé dans le site de clivage, et un autre facteur qui est indispensable pour l'induction de la cassure du chromosome 9 où se localise le Ds, ce deuxième facteur est appelé Ac (In Griffths et al., 2004). Ces deux facteurs ont été nommés les éléments de contrôle suite à leur pouvoir d'activer des gènes dormants à leurs cotés après excision de ces éléments. Pendant plusieurs années, le maïs a été le seul système génétique dans lequel il a été observé des éléments mobiles. Or à la fin des années 1960, certaines mutations pléiotropes (affectant plusieurs fonctions) chez E.coli ont résulté de la présence de grands fragments d'ADN (appelés IS pour insertion sequence ou séquence d'insertion) qui s'étaient intégrés dans le génome (In Watson et al., 1994)

Des noms très variés désignaient ces éléments comme: les éléments de contrôle, les gènes sauteurs, les gènes mobiles, mais les noms les plus courants actuellement sont: les transposons et les éléments transposables (In Griffiths et al., 2004).

Les éléments transposables sont des séquences d'ADN moyennement répétées, capables de se déplacer le long des chromosomes. Ils codent pour les protéines nécessaires à leur déplacement (le phénomène est appelé transposition), ils sont présents chez tous les organismes dès la bactérie jusqu'à l'homme. Ils se répartissent en deux principales classes sur la base de leur mécanisme de transposition:

Actuellement, de nombreux chercheurs ont étudiés les éléments transposables de point de vue structural et fonctionnel, ainsi que leurs effets sur les génomes hôtes car ils se révèlent de plus en plus comme des composés fondamentaux des génomes (In Amara 2008). Plusieurs éléments transposables ont été caractérisés et démontrée actifs et d'autres restent potentiellement actifs. Des procédures bien adaptées sont actuellement utilisées pour caractériser un élément et démontré son activité. Ceci est rendu possible à l'aide de plusieurs expériences comme les tests de transposition in vivo et les tests de transposition in vitro.

Dans ce travail, une première partie va mettre la lumière sur les éléments transposables, en citant ses différentes classes, leurs impacts sur les hôtes ainsi que les niveaux de régulation de leur transmission. Une seconde partie détaillera les transposons Mariner et donnera une approche expérimentale qui permet la caractérisation d'un transposon et le test d'activité.

I- Classification générale des éléments transposables:

Les éléments transposables sont divisés selon leur mécanisme de transposition en deux grandes classes :

I.1. Les éléments de la Classe I : Les rétrotransposons

Les rétrotransposons ou les éléments de la classe 1 ont la particularité de transposer par une copie intermédiaire d'ARN. Ils utilisent pour ceci une reverse transcriptase, cet ARN possède une double fonction :

La classification de ces éléments est fondée sur un critère structural qui est la présence ou non de longues répétitions terminales « les LTR (Long Terminal Repeat) ». De ce fait, les rétreotransposons sont rangés en deux classes

I.1.1.a. Caractères généraux :

Un élément à LTR est généralement une portion d'ADN centrale longue de plusieurs Kpb « constituée d'un seul ou de plusieurs cadre de lecture ouvert ORF (pour Open Reading Frame) » et flanquée par des LTR longs de plusieurs centaines à un millier de pb. Ces LTR portent les promoteurs et les signaux de régulation de la transcription de l'élément, et ils sont parfois bordés par de courtes répétitions inversées de quelques pb. (In Singer et Berg, 1992). L'insertion de la majorité de ces éléments produit une duplication au niveau de leur site cible, dont quelques uns présentent une spécificité pour sa séquence. (Malik et Eickbush ; 1999). Les rétrovirus et les rétrotransposons sont

structurellement, fonctionnellement et évolutivement très proches. Ils se diffèrent seulement dans la capacité des rétrovirus à infecter les cellules adjacentes, parce qu'ils sont porteurs d'une fonction additionnelle env permettant une étape extracellulaire (où le virus infecte d'autres cellules). D'une manière générale les rétrotransposons à LTR sont caractérisés par :

> A chaque extrémité, des LTR identiques, dont leurs transcrits portent le motif 5'-R-U5-PBS et PPT-U3-3', sont retrouvés en orientation directe, PBS (Primer Binding Site) et PPT (PolyPurine Tract) sont impliqués dans la réplication de ces éléments.

> Ils portent au moins de 1 à 2 ORF, appelé gag, pol, le gène gag code pour les protéines de la capside, et pol code une polyprotéine donnant naissance la reverse transcriptase (RT) et la ribonucléase H (RH) qui sont requises pour la réplication du rétrotransposon, l'intégrase (INT) qui permet à la molécule de l'ADN fille de s'intégrer dans un nouvel site, et la protéase (PR) qui clive la polyprotéine aux protéines correspondantes. Etant donné que la plupart des rétrotransposons sont dépourvus du gène env qui code pour les protéines de l'enveloppe virale, toutefois la frontière entre le monde des rétrovirus et celui des rétrotransposons est parfois très floue, car quelques éléments comme les éléments gypsy, 297 et tom de la Drosophile sont porteurs d'ORF additionnels de type env (figure1) (in Griffiths et al., 2004 ;Mhiri et Grandbastien, 2004 ; Renault et al., 1997 ; Pelsy et Merdinoglu, 2002 ; In Rivière, 2000).

I.1.1.b. La classification :

Comme tous les cadres taxonomiques, la classification au sein de ces éléments est actuellement soumise à de fréquentes révisions en raison de l'identification de nouvelles familles (Havecker et al., 2004). En fonction de l'ordre des domaines dans leurs séquences Pol, les rétrotransposons à LTR sont essentiellement divisés en deux grandes super familles, dont la mobilité est autonome, la première est ty1/copia (Pseudoviridae) et la deuxième est ty3/gypsy (Métaviridae) (in Luchetta et al., 2005). Cependant, Witte et al. (2001) ont pu découvrir une nouvelle catégorie appelée TRIM (Terminal Repeat Retrotransposon In Miniature) (Mhiri et Grandbastien, 2004), aussi un autre groupe de chercheur a identifié des éléments regroupé sous le terme de LARDs (pour Large Retrotransposon Derivatives). (Havecker et al., 2004) la mobilité des éléments au sein de ces dernières familles est supposée d'être en trans c'est-à-dire qu'elle nécessite la présence des protéines d'un autre élément autonome (ces éléments sont décrits ultérieurement) (Schulman et Kalendar, 2005).

I.1.1.b1. Les éléments autonomes :

I.1.1.b1.1. La super famille ty1/copia : Pseudoviridae

La taille des éléments de cette super famille est comprise entre 3925pb12088pb, les LTRs sont entre 156pb-1929pb, et présentent un TSD (pour Target Site Duplication) de 5pb. L'ordre des domaines des gènes Pol est : PR-INT-RT-RH (Figure1.1) dont les protéines sont caractérisées par des motifs hautement conservés (Pelsy et merdinoglu , 2002). Cette super famille est rangée en trois familles : les Hémivirus, les Pseudovirus, et enfin les Sirevirus (la nomenclature n'indique pas qu'ils sont vraiment des virus). Les Sirevirus se distinguent par leur abondance dans les génomes végétaux et aussi par la séquence protéique de leur RT. Les Hémivirus et les Pseudovirus sont caractérisés par les amorces utilisées pour la transcription inverse qui sont un ARNt complet et un demi-ARNt respectivement (Havecker et al., 2004). Dans cette Super Famille il existe entre autres les rétrotransposons Ty1, Ty2 et Ty4 de la levure Saccharomyces cerevisiae, les copia -like (copia, mdg1, mdg3) et 1731 de la drosophile (In Halaimia Toumi, 2006).

I.1.1.b1.2. La super famille ty3/gypsy : Métaviridae

L'ordre des domaines des gènes Pol est : PR-RT-RH-INT, qui est semblable à celui des rétrovirus (Figure 1.1). Les membres de la super famille ty3/gypsy sont d'intérêt, parce que, contrairement à leurs voisins les rétrovirus, ils possèdent parfois une spécificité remarquable pour leur site d'insertion, par exemple, l'élément ty3 de la levure S. cerevisiae s'insère exactement aux environs 5pb du site de début du gène codant pour l'ARN polymérase Ø, cela s'avère un excellent choix car ce gène possède des promoteurs internes, de sorte que l'insertion ait un effet minime sur l'expression génétique (Malik et Eikbush, 1999). Certains éléments de cette super famille peuvent acquérir un ORF additionnel codant le gène env des rétrovirus, c'est le cas des éléments gypsy et ZAM de la drosophile. Il a été démontré que l'élément gypsy posséde une capacité infectieuse. Les analyses phylogénétiques des séquences de la Reverse Transcriptase montrent que la super famille ty3/gypsy est généralement divisée en trois familles : les Métavirus dont l'élément Boudicca de l'homme et Athlia d'Arabidopsis, les Errantivirus dont l'élément gypsy et les Sémotivirus qui sont présents aussi chez les nématodes (Havecker et al., 2004).

I.1.1.b2. Les éléments non autonomes : I.1.1.b2.1. La famille des TRIMs :

Les TRIMs (pour Terminal Repeat Retrotransposon In Miniature) ont été décrits pour la première fois dans les génomes du pomme de terre (Havecker et al., 2004), ils présentent la plupart des caractéristiques structurales des rétrotransposons à LTR, mais sont beaucoup plus petits (300 à 800 pb) composés de petites LTR encadrant un court domaine central non codant (Figure1.1). L'origine des TRIM est encore peu claire et il est probable que leur amplification nécessite une trans-activation par un autre rétrotransposon (Mhiri et Grandbastien, 2004), un des éléments connu de ce groupe est appelé Cassandra, il est une séquence de 565-860 pb, avec des LTR qui varient selon les espèces, leur taille est comprise entre 240-350pb. Les LTR d'un élément Cassandra

Figure 1.1: L'organisation génomique des différentes familles des rétrotransposons
à LTR. (D'après Havecker et al., 2004).

totalement séquencé présentent un motif très conservé : 5'-TG.....CA3'et des ITRs de 6- 12 pb (Kalendar et al., 2008).

I.1.1.b2.2. La famille des LARDs :

Les LARDs identifiés dans l'orge et d'autre membre de Triticaeae ont des LTRs de 4.5kb et un domaine interne non-codant de 3.5kb. Le mécanisme de déplacement de ces éléments est mal-connu, mais en se basant sur les similitudes des séquences, il semble que ces éléments se mobilisent sous l'action d'autres éléments tels que les métavirus Erika-1 de Triticum monococcum et RIRE3 du riz (Figure1.1) (Havecker et al., 2004).

I.1.1.c. Cycle de vie d'un rétrotransposon :

Les rétrotransposons à LTR suivent un cycle de vie analogue à celui des rétrovirus décrit par Echalier en 1989 (In Rivière, 2000), la transcription de l'élément en ARNm débute dans la région 5'-R à la région R-3'des LTR, de sorte que l'ARN bicistronique (génère deux protéines) soit une version tronquée de l'ADN en raison de l'absence des régions U3 en 5 `et U5 en 3'. Par la suite, cet ARN est traduit aux différentes protéines des gènes pol et gag (plus des protéines env dans le cas des Errantivirus), la polyprotéine pol est clivée par la protéase « PR », en INT, RH, PR et RT, les protéines gag se polymérisent pour former les particules viraux, ensuite l'ARN est assemblé dans ces particules où commence la transcription inverse par le couple RT-RH, la reverse transcriptase synthétise l'ADN en utilisant l'ARN comme matrice avec un taux d'erreur de (2.5×10^-5 erreurs/nucléotide/cycle) et la Ribonucléase H lyse l'ARN matricielle après l'achèvement de la transcription inverse. Enfin, l'ADN double brin synthétisé est couplé à l'intégrase INT (Sabot et Schulman, 2006) (qui est caractérisée par un motif catalytique de type DDE analogue à celui des enzymes des éléments mariner) sur les LTRs, ce complexe migre dans le noyau dont INT assure l'intégration du rétrotransposon dans un nouvel site hôte (Figure1.2) (Kapitonov et Jurka, 2006 ; Sabot et Shl 2006)

Figure 1.2: Cycle de vie d'un rétrotransposon. (D'après Sabot et Schulman, 2006)

I.1.2. Les rétrotransposons sans LTR : ou rétroposons

Ces éléments ont également une phase ARN dans leur cycle de rétrotransposition, ils ne possèdent pas des LTR et sont subdivisés en deux familles selon leur autonomité, les éléments autonomes « LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) », et les éléments non autonomes « SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) », actuellement une nouvelle famille appelée RTEs (RetroTransposable Elements) est connue (Figure 2) (In Tempel, 2007).

Figure 2 : Organisation structurelle des rétroposons. (In Tempel, 2007 ; Huchon et
al., 2002)

Les éléments autonomes de type LINEs sont représentés majoritairement dans les génomes des mammifères y compris l'homme, ils constituent 40% du génome

humain, et il existe plusieurs éléments LINEs : L1, L2, L3 le premier étant le seul élément actif décrit dans le génome humain. Un élément L1 complet est une séquence d'environ 6kpb, les éléments incomplets présentent des troncations en 5', de réarrangement interne ou de mutations. Un TSD de 9-19pb soit présent, ou non selon les espèces, à chaque extrémité de l'élément. L1 possède en 3' une séquence riche en A (poly A), il se trouve des séquences allant de séries d'A presque ininterrompues jusqu'à une répétition en tandem de la séquence TAAA ou de séquences similaires (Gilbert, non publié ; in Singer et Berg, 1992), il existe aussi deux ORF, l'ORF1 code une protéine de liaison à l'ARN de 40kDa, qui se lie avec l'ARN du L1 dans le cytoplasme pour former un complexe ribonucléoprotéine « RNPs (RiboNucleoprotein Particles) >>, tandis que l'ORF2 code une protéine multifonctionnelle présentant des activités Endonucléase et Reverse Transcriptase (RT), l'endonucléase génère des trous dans l'ADN chromosomique, et la RT transcrit inversement l'ARNm en ADN en utilisant le résidu 3' hydroxyle libéré comme amorce, il semble que la transposition d'un élément L1 s'effectue par un processus appelé « TPRT (Target-Primed Reverse Transcription) >> (In Zhan, 2007) c'està-dire que l'endonucléase réalise une coupure simple brin dans l'ADN de l'hôte, et la queue poly A de l'ARN de rétroposon se fixe à une région poly T. D'une façon plus générale la rétrotransposition du L1 peut se résumer dans deux étapes. La première est la transcription et la traduction d'un élément L1 actif pour former le RNP. La deuxième est la transcription inverse et l'intégration qui sont concomitantes à un nouveau site chromosomique (Figue2.1) (Gilbert, non publié).

Figure 2.1 : Modèle de rétrotransposition de l'élément L1 (d'après Gilbert,
non publié)

I.1.2.2. Les éléments SINEs :

Ils sont des rétroposons non autonomes dérivés principalement des ARN de transfert ou de l'ARN cytoplasmique 7SL (Figure 2), le SINE le plus abondant chez l'homme est appelé Alu, parce qu'il contient un site de clivage pour l'enzyme de restriction Alu1. Un élément Alu complet est d'environ 200 nucléotides, et contient deux répétitions d'environ 120pb encadrant une séquence de 60pb. Le mécanisme de déplacement des SINEs, n'est pas encore élucidé : dans la mesure où ils ne codent pas pour les fonctions nécessaires à leur rétrotransposition, les SINEs pourraient utiliser la Reverse Transcriptase des éléments LINEs. Ces « ADN égoïstes » sont avérés des outils très efficaces en systématique moléculaire : en effet, l'insertion d'un SINE à un site donné est un événement unique et non réversible à l'échelle des génomes (Huchon et al., 2002 ; Renault et al., 1997 ; in Griffiths et al., 2004).

I.1.2.3. Les RTEs :

Ils sont des rétroposons autonomes d'environ 3,3 kb et possèdent de larges répétitions d'une centaine de paires de bases. Contrairement aux autres rétroposons, l'élément RTE ne code que pour l'ORF2 (Figure 2), ce qui en fait le plus petit rétroposon autonome connu actuellement (In Tempel, 2007).

I.2. Les éléments de la Classe II: Les Transposons

Ces éléments transposent d'un site chromosomique à un autre grâce à l'activité d'une transposase, une enzyme codée par l'élément sur un ou plusieurs ORF (Anxolabéhère et al, 2000). Ils sont Essentiellement caractérisés par la présence des ITR (Inverted Terminal Repeat ou répétition terminal inversé) en orientation inverse qui flanquent les transposons à chaque extrémité. (Renault et al, 1997).

Au cours des 30 dernières années, le nombre des transposons chez les procaryotes et les eucaryotes identifiés n'a cessé à croître, avec une grande diversité dans leur structure et une remarquable conservation des mécanismes qui assurent leur mobilité (Merlin et Toussaint, 1999).

La classification des transposons procaryotes se repose sur des critères fonctionnels et structuraux. De ce fait, ils sont regroupés en deux classes principales:

La première séquence d'insertion était découverte chez E-coli pendant les années 60 à l'occasion d'une mutation qui apparaissait dans les gènes constituant l'opéron lactose grâce à l'insertion de cette séquence.

Les séquences d'insertions sont les éléments transposables les plus simples, de petite taille (généralement inférieure à 2500pb) (Merlin et Toussaint, 1999) et bordées à

chaque extrémité par des ITR (< 50pb) (In Griffiths et al., 2004) indispensables pour le phénomène de transposition et qui sont reconnus spécifiquement par la transposase ( figure 3) (In Singer, Berg, 1992).

Figure 3 : La structure d'une séquence d'insertion (IS1) (d'après Singer, Berg.,
1992).

Selon les différences dans leurs séquences, les IS ont été cataloguées en 17 familles dont les membres des 12 entre elles contiennent un seul ORF qui code pour la transposase, à partir de ce même cadre ouvert de lecture, les IS de certaines familles codent pour une autre protéine, une version tronquée de la transposase mais douée d'une activité régulatrice pour la transposition. Pour les membres de la famille IS3, la synthèse de la transposase (ORF AB) résulte d'un déphasage programmé de la traduction entre deux cadres de lecture ouvert qui codent pour une protéine régulatrice de la transposition (ORF A) et une protéine de fonction inconnue (ORF B) (Merlin et Toussaint., 1999). La séquence du site d'insertion varie pour une même IS mais pas sa longueur, aussi, certains éléments manifestent une spécificité pour une séquence en palindrome (par exemple elle est 5'-CTAG pour IS5), lors de l'intégration d'une IS une duplication du site cible se produit, ce qui conduit à en trouver une copie à chaque extrémité de l'élément (Merlin et Toussaint., 1999; In Singer et Berg., 1992; Renault et al., 1997) ( figure 3.1).

duplication du site cible lors de l'insertion d'un élément transposable par la coupure cohésive effectuée par la transposase. (d'après Griffiths et al., 2004)

I.2.1.2. les transposons composites: "Tn"

Ils sont des entités avec des structures complexes (peuvent compter jusqu'à plusieurs milliers de pair de base), ils contiennent une variété des gènes encadrés par deux IS en direction directe ou inverse (figure 3.2) (In Watson et al., 1994; In Singer et Berg, 1992), très souvent seule une des deux séquences d'insertion code une transposase fonctionnelle, tandis que l'autre code majoritairement pour un régulateur de la transposition, le choix de transposition d'un Tn entier ou d'une seul IS se fait en fonction de la taille de la séquence située entre les deux IS c'est-à-dire que plus un Tn est court plus qu'il a tendance à être mobilisé en entier (Merlin et Toussaint, 1999; Renault et al., 1997). Le segment d'ADN bordé par les deux IS peut coder pour n'importe quelle fonction comme la résistance aux antibiotiques (kanamycine chez Tn5, tétracycline chez

Tn10), ou une fonction métabolique (catabolisme du citrate chez Tn3411) (Tableau 1) (Merlin et Toussaint, 1999).

Figure 3.2: La structure du transposon Tn10, les IS sont orientées en sens inverse et
forme des ITR (d'après GRIFFITHS et al., 2004).

Tableau 1: Transposons caractéristiques d'E.coli (Tableau d'après Singer et Berg,
1992)

Transposon	Taille (pb)	Extrémités IS	Orientation des IS	Réplique terminale inverse (pb)	Duplication du site cible	Gènes portés
Tn3	4957	Aucun		38	5	Amp^r
Tn9	2638	IS1	Identique	23	9	Cam^r
Tn10	9300	IS10	Inverse	1329	9	tet^r

Ces transposons peuvent passer du chromosome bactérien au génome d'un phage ou dans un plasmide conjugatif. Pour ces raisons, ces transposons peuvent être transmis à d'autres bactéries. Ce type de transposon est une cause naturelle d'acquisition de résistance aux antibiotiques pour les bactéries (in Halaimia Toumi, 2006).

I.2.1.3. Les mécanismes de transposition: Deux modèles de transposition des IS et donc des Tn ont été observés

v' La transposition réplicative: (appelé aussi la co-intégration ou copier-coller)

Ce processus implique la formation d'une structure moléculaire de type "crossing-over" appelée co-intégrat. Cette structure résulte de la fusion entre un réplicon (molécule circulaire capable de se répliquer) donneur et un réplicon récepteur avec une copie du transposon à chacune des deux jonctions entre ces deux molécules (In Singer et Berg, 1992; Renault et al., 1997), généralement cette structure ne persiste pas et une recombinaison entre les deux copies du transposons résout le co-intégrat. La transposase produit une coupure à un site bien précis de chaque côté du transposon ainsi qu'au site d'insertion, ensuite ces extrémités sont liées et une réplication se produit en utilisant les fonctions réplicative de la cellule hôte pour former le co-intégrat qui est détaché par une résolvase codée par le transposon et qui agit au niveau du site res également porté par le transposon. Dans certains cas, une intégrase achève la résolution du co-intégrat en agissant sur un site appelé att (figure 3.3) (Merlin et Toussaint, 1999; In Singer et Berg, 1992; Renault et al., 1997).

v' La transposition conservative: "non réplicative" "couper-coller" cut-paste":

Ce modèle correspond à la simple insertion, la transposase se fixe aux ITRs pour former une structure compacte appelée complexe synaptique ou transpososome, qui rapproche les ITRs, ensuite une coupure double brin est effectuée par la transposase conduisant à la formation de l'intermédiaire de transposition (une molécule de transposase fortement associée au transposon). En présence d'ions calcium ou magnésium, la transposase coupe au site cible d'une façon décalée et une structure branchée de type crossing-over est formée entre les brins d'ADN du transposons donneur et la séquence cible. La réparation des extrémités décalées conduit à la duplication de la séquence cible. Cette transposition se distingue de la précédente par le fait que l'intégration du transposon dans le site cible se fait sans le passage par une étape de réplication (Figure 3.4) (In Singer et Berg, 1992; Renault et al., 1997; In Watson et al., 2004).

Figure 3.4: Le mécanisme général de la transposition conservative: 1: la transposase, 2: l'ADN donneur, 3: le transposon, 4: liaison de la Tnp(pour transposase) aux ITR du transposon, 5: l'ADN récepteur, 6: rapprochement des ITRs pour former le transpososome, 7: détachement du transposon de son hôte en se liant à la transposase et la formation de l'intérmédiaire de transposition, 8: liaison de la transposase à la séquence cible de la molécule réceptrice, 9: intégration du transposon dans son nouveau hôte.

Les transposases sont peu conservées dans leur structure primaire, mais contiennent très souvent un motif conservé D,DxE/D où le résidu glutamate (E) ou aspartate (D) est généralement séparé des deux premiers résidus aspartate par un nombre connu d'acide aminé fréquemment conservé pour les membres d'une même famille, ce motif est impliqué dans la liaison de deux ions métalliques bivalents (magnésium ou

calcium) et fait partie du site catalytique de l'enzyme, le mode d'action de la transposase est généralement comme suit:

1' Les ions bivalents piégés par le motif D,D-E/D, interagit avec les extrémités de l'élément et fragilise un pont phosphodiester qui devient plus sensible à une attaque nucléophile par une molécule d'eau qui libère des extrémités 3'-OH .

1' Une seconde attaque se lance contre les ponts phosphodiester de l'ADN cible y libérant des extrémités 5'-P sortantes.

1' Selon que la transposase a clivé ou non l'extrémité 5' du transposon, la transposition sera conservative ou réplicative. Dans le premier cas, les deux brins du transposon se désolidarisent simultanément du site donneur et la synthèse d'ADN s'arrête au niveau du transposon qui n'est pas répliqué, en revanche lorsque la transposition est réplicative, le second brin du transposon n'est pas clivé, la synthèse à l'extrémité 3'-OH de la cible se poursuit à travers le transposon et le duplique, en engendrant un co-intégrat (Shao et Tu, 2001; Merlin et Toussaint, 1999).

Après la découverte des éléments de contrôle par Barbara McClintock, plusieurs transposons eucaryotes ont été identifiés chez divers organismes comme la drosophile, les levures, les nématodes et divers vertébrés y compris l'homme. Comme le cas des séquences d'insertion bactériennes, les transposons eucaryotes contiennent des ITRs qui flanquent la région codante pour la transposase qui catalyse la transposition d'une manière réplicative ou conservative. Ils sont divisés en plusieurs familles individualisées par des similarités de séquence ainsi que dans la séquence du site cible d'insertion (In Lodish et al., 2004). Ils sont également divisés en éléments autonomes pour leur transposition et nonautonomes qui se déplacent via une transposase d'un élément autonome qui appartient à la même famille, les familles les plus connues sont:

I.2.2.1. Le groupe des éléments hat:

Ils sont des transposons endogènes mobiles (In Léonard, 2005), ces éléments contiennent un seul ORF qui code la transposase, leurs ITRs sont généralement courts (11-17pb), l'insertion de l'un de ces éléments dans le site cible conduit à une duplication

Halaimia-Toumi, 2006). Les éléments de
ce groupe représentent entre eux un
domaine très conservé constitué de 50aa

situé sur la région C-terminal de la
transposase, ce domaine est impliqué
dans le phénomène de dimérisation de

deux molécules de transposase pendant le processus de transposition (In Halaimia Toumi, 2006).

Chez le maïs, les éléments Ac (pour activateur) ont une longueur de 4563, l'ARNm de 3500 pb transcrit à partir de ces éléments comprend 5 exons, il code une transposase de 807aa (figure 4) (Renault et al., 1997). La présence de l'élément Ac au sein du gène de la synthèse de l'anthocyane conduit à l'apparition de nouvelles mutations susceptibles d'être reversée suite au déplacement d'Ac, ces mutations sont exprimées par une couleur tacheté des grains (où Ac est inseré) avec la présence des grains de couleur normale (là où la mutation est reversée). L'élément Ds est un dérivé de l'élément Ac par délétion du gène de la transposase, donc cet élément ne peut jamais être transposé qu'à la présence d'Ac c'est-à-dire qu'en absence d'Ac, Ds reste en place et on n'observe pas de réversion de la mutation induite. En revanche, lorsque Ac est présent l'élément Ds se transpose en trans via le transposase d'Ac ce qui permet l'évacuation du Ds sous forme d'un transposon complexe permettant au gène de l'anthocyane de retrouver sa fonction (In Watson et al., 1994 ).

I.2.2.2. Le groupe des éléments PiggyBac:

Le premier élément de cette famille a été découvert chez le baculovirus qui a infecté des cultures des cellules du lépidoptère Trichoplusiani, ils sont d'une longueur comprise entre 2.3-6.3 kb, avec des ITRs d'une taille 12-19 pb, leur site d'insertion est caractérisé par la séquence conservée TTAA (In Halaimia Toumi, 2006). Le seul élément autonome de cette famille est appelé PiggyBac, le séquençage moléculaire a montré qu'il est un transposon de 2500pb et porte des ITRs parfaites de 13pb, en outre ils existent des ITRs internes asymétriquement localisées aux extrémités de l'élément, la transposase (64kDa) est codée par deux ORFs traduits comme un seul ORF, son motif catalytique est estimé d'être DDE?. Les éléments PiggyBac ont été caractérisés dans le génome d'espèces diverses, depuis les insectes jusqu'aux mammifères (Feschotte et Pritham, 2007; in Halaimia Toumi, 2006).

I.2.2.3. Le groupe des éléments P:

La dysgénésie hybride est une singularité génétique à certains souches de Drosophila melanogaster, ses propriétés s'expliquent par l'activité d'éléments

transposables, plusieurs syndromes sont connus chez cette espèce. La dysgénésie

de type P, est bien comprise aux plans génétiques et moléculaires (In Singer et Berg, 1992), le croisement des mâles de cytotype (type cellulaire) P ( Paternel ayant de 30-50 copies du transposon P) avec des femelles de type M (maternel dépourvu de P) produit une descendance F1 stérile caractérisée par des gonades atrophiées, le croisement réciproque produit une descendance fertiles ( Renault et al., 1997) étant donnée que la cause principale de cette mutation ou dysgénésie est la transposition de l'élément P dans la lignée germinale de la

mouche (Koslovski Sassi et al., 2005). Comme dans le cas du système Ac/Ds, cette famille comporte des éléments autonomes et d'autres nonautonomes qui


L'élément P ARNm1 ARNm2
	L'intron 3 reste
L'ARNm
somatique Cadre de Represseur		lecture de 66kDa
L'ARNm
germinal Cadre de lecture transposase		de 88kDa
Figure 4.1 : La structure et l'épissage somatique et germinale de l'élément P (D'après www.scribd.com)

Les éléments P les plus longs sont des séquences de 0.5-2.9kb, ils présentent des répétitions terminales inversées de 31pb. L'élément P autonome porte 4 exons, il est transcrit dans les cellules somatiques et germinales, mais ne transpose que dans la lignée germinale parce que la transposase active de 88KDa n'est synthétisée que dans cette catégorie cellulaire, dans la lignée somatique la protéine synthétisée résulte des 3

premiers exons et sert de répresseur de la transposition de 66KDa (figure 4.1). La transposition des éléments P est conservative et se produit par un mécanisme proche de celui des IS non réplicatifs (Renault et al., 1997; In Watson et al., 1994).

I.2.2.4. Le groupe des MITEs/PIF/Harbinger:

I.2.2.4.1. Les MITEs : Pour "Miniature Inverted Repeats Transposable Elements" sont initialement considérés parmi les éléments non-classés mais par son homologie avec les éléments de la famille Tc1/mariner, ils sont désormais intégrés aux éléments de la classe 2 (in Rivière, 2001). Ils sont des petites séquences d'une taille (100-500pb) et avec un TSD (pour Target Site Duplication, ou la duplication du site cible) de 3pb riche en A et T, et ne possèdent aucune capacité codante, ces éléments sont donc non autonomes, et semble transposé en trans. Les MITEs sont décrites dans une variété d'espèces animales et végétales. Dans les plantes ces éléments peuvent être divisés selon les similarités qui existent dans leurs ITRs et TSD en deux groupes principaux:

I.2.2.4.2. Les PIFs (pour P Iinstability Factor) : ils ont été caractérisés par des insertions dans le gène R de régulation de la production des anthocyanes dans divers tissus du maïs. L'insertion de ces PIFs dans le second intron bloque la production qui est rétablie après excision, révélant un système de transposition par couper-coller. PIF-12 a été séquencé, mais les ORFs présentes ne ressemblent à rien de connu. PIF-12 et PIF-5.2 transposent activement, mais sont cependant non autonomes. Ceci laisse donc perplexe. La solution est apparue quand l'équipe de Wessler a séquencé un nouvel élément actif de la famille, PIFa. C'est un élément de 3728 pb qui participe à la mobilisation d'autres éléments de la famille. Il code, en effet, une ORF de 331 acides aminés codant potentiellement une transposase qui ressemble à celles présentes dans beaucoup d'autres eucaryotes très disparates. Cette transposase ressemble également de loin à celle d'IS5. Un fait curieux est que cet élément est plus court que PIF-5.2. Une version miniature de PIF d'une taille de 364 pb est présente à environ 6 000 exemplaires dans la garniture

haploïde du maïs, mais elle est absente dans les génomes du riz et du sorgho. . Elle a les caractéristiques des MITEs de type Tourist. Cet élément est donc très probablement un élément dérivant des éléments plus grands et fortement simplifié par délétion. Il est donc obligatoire de réunir biologiquement ces éléments de taille pourtant très différentes. Leur site d'insertion est une séquence de 9 pb (dont seul leTTA1 central est dupliqué lors d'une insertion) qui est un palindrome imparfait, Il en existe environ 10 000 dans le génome du maïs. Il reste donc des places libres dans le génome pour une mobilité. Les PIFs sont probablement à l'origine et contribuent à la mobilisation des MITEs de type Tourist.

I.2.2.4.3. Harbinger : il est un transposon de 5 382 pb découvert lors du séquençage total d'Arabidopsis. Il possède des répétitions terminales de 25 pb, crée une répétition de 3pb au site d'insertion et contient deux phases de lecture potentielles (ORFs) dont l'une code une transposase ressemblant à celle de la séquence d'insertion bactérienne IS5. Cet élément est donc probablement autonome. Les éléments PIF/Harbinger code pour une transposase caractérisée par une triade catalytique DD(35-37/47-48)E et constitué par 350-550aa (Feschotte et Pritham, 2007).

I.2.2.5. Le groupe En/Spm:

L'élément En/Spm (Enhancer/Supressor-Mutator) a été découvert par Barbara McClintock et Peterson en 1953, il a une longueur de 8.3kb avec une capacité de coder au moins deux transcrits alternativement épissés de 5.8kb et 2.5kb à partir de deux ORFs, le dernier est appelé TnpA, il contient 11 exons du gène TnpA dont il tire son nom et il est 100 fois plus fréquent que le premier. Le transcrit de 5.8kb est nommé TnpD, outre les 11 exons il comporte aussi un large ORF dans sa région 5'. Le TnpA code une protéine nécessaire pour le phénomène excision/intégration tandis que le transcrit TnpD code pour une protéine de 67kDa qui fonctionne comme une protéine de liaison à l'ADN (DNA binding protein). La séquence de l'ITR de cet élément est hautement conservée (5'- CACTACAAGAAAA) et une duplication du site cible résulte au cours de l'intégration de cet élément dans son nouveau site hôte (In Halaimia Toumi, 2006).

*I.2.2.6. L'élément Helitron* :**
Il a été identifié par Kapitonov et Jurka (2001) dans les génomes d'Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans et Oryza sativa. Les analyses << in silico »

ont montré représente	que 2%	cet du	élément génome	Figure 4.2: Structure de l'élément Helitron du maïs. (D'après www.plantcell.org)

d'Arabidopsis et caenorhabditis. Helitron est un transposon de 500-15000 pb ne possédant pas des ITRs mais porte des motifs 5'-TC et 3'-CTRR, des structure palindromique peuvent former une structure de type << hairpin loop » (épingle à cheveux) de 16-20pb proche de la région 3' (figure 4.2). Les Helitrons autonomes codent une hélicase et une ou deux copies d'une nucléase/ligase, ils s'insèrent précisément entre les deux nucléotides A et T de l'hôte et sont supposés de transposer selon un mode de réplication en cercle roulant semblable à celui décrit chez des transposons bactériens (IS91, IS801, IS1294) (in Halaimia Toumi, 2006).

I.2.2.7. Les éléments Mutator (Mu)

Les éléments transposables de type Mutator ont été connus par Robertson parce qu'ils ont élevé la fréquence de mutation chez le maïs Zea mays, les analyses moléculaires de ces éléments ont révélé la présence d'au moins 8 classes de Mutator (Mu1 à Mu8) autonomes et nonautonomes, ils présentent des ITRs de 210pb extrêmement conservées et un TSD de 9pb, leur taille et comprise entre 1000-2200pb. MuDR est le premier élément Mu autonome qui a été identifié. Il est de 4.9Kb et peut être transcrit en deux ARNm différentiellement épissés, ils sont appelée mudrA et mudrB, le premier code un polypeptide de 823 aa appelé MURA et qui fonctionne comme une transposase, le deuxième code la MURB indispensable pour l'excision de MuDR mais son rôle dans le phénomène de la transposition reste encore inconnu (Bénito et Walbot, 1997).

I.2.2.8. Le groupe des éléments de la super famille IS630/Tc1/maT/mariner :

La taille des éléments de cette super famille peut atteindre des milliers de paires de bases, les ITRs sont de 19 à 69pb, la transposase est codée par un gène généralement sans intron, leur site d'insertion est le dinucléotide TA (.Halaimia.Toumi et al., 2004). Les éléments de la famille IS630 qui existent chez les bactéries code une transposase qui contient une triade catalytique de type DDXE (X indique une distance variable). Les TLEs (Tc1 Like-Elements) identifiés dans les champignons, les vertébrés et les invertébrés portent le motif D, D34E. Les MLEs (mariner like-elements) présente la triade D, D34D à l'exception de Soymar1 qui est identifié dans le soja ainsi que dans le riz et les nématodes et qui est caractérisé par le motif D, D39D (Shao et Tu, 2001). La famille des maTs est une famille intermédiaire entre les MLEs et TLEs (<< ma >> pour mariner et << T >> pour Tc1) et qui a été définie par Claudianos et al. (2002) possède le motif D,D37D (In Halaimia Toumi, 2006). D'après les analyses des domaines catalytiques un autre élément appelé pogo décrit chez Drosophila melanogaster et contient le motif D,D30D peut être classé parmi les membres de la famille IS630/Tc1/maT/mariner (Shao et Tu, 2001).

I.2.2.9. La famille Polintons(Mavericks) :

Les éléments de cette famille ont été découverts plus récemment (2006), ils sont les transposons les plus complexes identifiés jusqu'ici. Les polintons, ou aussi les mavericks, sont des géants éléments d'environ 10-20 kb qui peuvent coder au moins pour 10 protéines différentes dont une ADN polymérase B (POLB), une intégrase rétrovirale (Int), une protéase adénovirale (PR), et une ATPase. Ils ont un TSD de 6pb qui flanque des ITRs longs contenant des terminaisons 5'-AG et TC-3' (Figure 4.5). Kapitonov et Jurka (2006), Pritham et al. (2006) ont développé un modèle de transposition unique à ces éléments, selon ces auteurs la molécule d'ADN de polinton/mavericks excisée par l'intégrase, au cours de la réplication du génome de son hôte, sert comme une matrice pour une synthèse extra-chromosomique du brin d'ADN complémentaire par l'ADN polymérase B, la molécule d'ADN double brin s'insère dans le génome sous l'action de l'intégrase. Ces éléments sont largement répandus dans les génomes eucaryotes comme les génomes des insectes, des poissons et aussi des oiseaux (Kapitonov et Jurka, 2006 ; Pritham et al., 2006)

I.2.2.10. La famille des éléments Merlins :

Ces éléments sont des homologues des séquences d'insertion IS1016, le premier élément Merlin était identifié en octobre 2001 dans le nématode Caenorhabditis briggsae, il est une séquence d'environ 1914pb et possède un TSD de 8pb (Feschotte, 2004). Les éléments merlin décrits sont des séquences de 1.4-3.5 kb, avec des ITRs entre 21 et 462 pb flanqués par des TSD de 8-9 pb, leurs ORFs codent pour une transposase de

270-330 aa caractérisées par le motif DD(36-38)E. Ils sont présents dans les génomes de divers invertébrés et vertébrés (Feschotte et Pritham, 2007)

I.2.2.11. La Super famille des Transib :

Cette super Famille a été reconstituée in silico à partir des éléments dégénérés dans les génomes de Drosophila melanogaster et Anopheles gambiae (Chen et Li, 2007), ils sont des éléments d'une longueur comprise entre 3 et 4kb bordés par des ITRs de 9- 60pb, ils produisent lors de son insertion un TSD de 5pb. Un élément Transib code pour une transposase de 650-700aa avec une triade catalytique de type DD(206-214)E (Feshotte et Pritham, 2007). Kapitonov et Jurka (2005) ont démontré que les protéines RAG1/2 impliquées dans la recombinaison V(D)J sont des dérivés de ces éléments (Kapitonov et Jurka, 2005). Les transposons Transib sont aussi présents dans le génome de l'Hydre, de l'oursin et du moustique de la fièvre jaune (Chen et Li, 2007).

II. L'impact des éléments transposables sur le génome :

L'intérêt porté aux éléments transposables se focalise sur deux points principaux : l'évolution des éléments transposables eux-mêmes et leur effet sur les génomes des hôtes. Au cours des dernières années, les auteurs ont orienté leurs recherches sur ce deuxième point, c'est-à-dire sur le rôle des éléments transposables dans l'évolution de la structure et du fonctionnement du génome de l'hôte (Anxolabéhère et al., 2000). Ce ne sont cependant pas des éléments génétiques purement égoïstes dans la mesure où l'acquisition de nouveaux gènes sous la forme d'élément transposable est une voie majeure d'adaptation des organismes qui les hébergent (Merlin et Toussaint, 1999), d'une manière générale les éléments transposables influencent le trajet évolutionnaire de leurs hôtes selon 3 façons principales :

/ La modification de la structure et la fonction des gènes par le processus excision/intégration.

v' Ils constituent une source importante du matériel codon et non-codon qui permettent l'émergence de nouveauté génétique (néogène et des régions régulatrices) (Feschotte et Pritham, 2007).

II.1. La modification de la structure et la fonction des gènes :

L'intégration d'un élément transposable à proximité d'un gène a un effet modeste voire novateur au sens de l'évolution. Dans certains cas, l'intégration conduit à un changement de la séquence du gène hôte et à la production d'une protéine modifiée, par exemple chez le maïs l'insertion d'un élément au début d'un exon génère un nouvel site de reconnaissance qui produit l'excision du début de cet exon avec l'intron adjacent. La protéine codée est ainsi plus courte de 30 acides aminé mais reste fonctionnelle et produit une modification de la couleur des grains (Renault et al., 1997). Un autre exemple bien étudié est le cas du gène nia2 du Tabac, ce gène code l'apoenzyme de la nitrate réductase (NR), l'analyse des mutants instables de phénotype [NR^-] permet de mettre en évidence l'insertion du rétrotransposons à LTR Tnt1, dans une région codante de ce gène. Le phénotype [NR^-] est dû à des modifications qui dépendent de l'orientation de l'élément par rapport au sens de transcription du gène : (figure 5)

v' Lorsque l'élément Tnt1 est inséré en orientation directe par rapport au sens de transcription, des transcrits tronqués sont obtenus correspondant à l'arrêt de la transcription dans les LTR 3' et 5'.(figure 5 A).

v' Par contre quand l'élément est inséré en orientation inverse par rapport au sens de transcription, un transcrit composite est obtenu correspondant au transcrit classique du gène plus la séquence de rétrotransposon. Ce transcrit donnera, après traduction, une protéine tronquée s'arrêtant au niveau da la LTR3'. (Figure 5 B).

v' Outre que la production d'un transcrit composite, l'excision d'un intron soit perturbé par la présence de l'élément, là encore une protéine tronquée est obtenue (Figure 5 C) (In Luchetta et al., 2005).

Figure 5: Effet de l'insertion du rétrotransposon à LTR, Tnt1, sur les transcrits du gène
nia2 codant la nitrate réductase chez Nicotiana tabacum

Dans des cas plus graves, l'intégration de l'élément induit une mutation caractérisée par l'acquisition d'une nouvelle fonction, chez E-coli le gène sauvage Eco DXXI code pour une enzyme de restriction de type I qui reconnait spécifiquement les séquences de type TCA(N7)RTTC, une mutation provoquée par l'insertion du Tn5 dans le gène correspondant, conduit à une modification sévère de la fonction enzymatique : l'ancien site n'est plus identifié et la nouvelle enzyme reconnait les séquences de type TCA(N8)TGA (Renault et al., 1997).

II.2. Les réarrangements chromosomiques :

Les mécanismes de transposition des éléments transposables impliquent des processus de coupures double brin et de réparation. Ce qui induit différents types de réarrangements chromosomiques, soit en liaison avec leur mobilité, soit parce qu'ils

fournissent des séquences répétées favorisant des recombinaisons intra-génomiques voire intra-chromosomiques. L'excision imprécise de certains éléments génère ainsi de nombreuses délétions ou translocations dans le génome hôte adjacent. Chez la drosophile plus de 50kb du génome hôte peuvent ainsi être transporté lorsqu'ils sont pris en sandwich entre des éléments transposables. D'autre part, les recombinaisons entres séquences répétées produisent des délétions ou des inversions selon le sens direct ou inversé des motifs répétés. Ces réarrangements peuvent n'avoir aucune incidence sur le phénotype externe du porteur, ou au contraire provoquer une mutation visible lorsque les séquences d'un gène sont déplacées et mises sous le contrôle d'un autre promoteur (Anxolabéhère et al., 2000 ; Feschotte et Pritham, 2007 ; Renault et al., 1997).

Les éléments transposables peuvent participer à l'évolution des gènes non seulement par la création de systèmes de régulation mais aussi en fournissant de nouvel types de gènes ainsi que de nouvelles fonctions cellulaires. La transition moléculaire d'une séquence codante apparentée à un ancien élément transposable vers un gène immobile a été présentée comme une « domestication moléculaire ». Elle correspond au recrutement d'élément transposable par génome, deux types de recrutement peuvent être

observés : le recrutement de fonction structurelle et recrutement de fonction enzymatique (Anxolabéhère et al., 2000 ; in Luchetta et al., 2005).

II.4.1. Recrutement de fonctions structurelles :

Le cas le plus étudié est l'intégrité des extrémités chromosomiques chez la drosophile. A l'inverse de la plupart des organismes, cette intégrité n'est pas assurée par la télomérase qui catalyse la synthèse des courtes répétitions terminales, elle est assurée par deux rétrotransposons de types non rétroviral (sans LTR), les LINEs TART (pour Telomerase Associated RetroTransposon) et Het-A, ils sont d'environ 7kpb, les TART codent pour leur propre transcriptase inverse (TI), ils sont donc autonomes tandis que les Het-A doivent être transposés en trans par une TI fournit par un TART ou d'autres rétrotransposons. Après chaque cycle de réplication, les extrémités chromosomiques sont érodées par une réplication incomplète, ensuite elles sont régénérées grâce à la rétrotransposition des TART et Het-A. De façon tout à fait remarquable, un équilibre dynamique s'est installé dans ce système où le taux moyen d'érosion est égal au taux moyen de transposition. Par ailleurs, structurellement le domaine transcriptase inverse de la télomérase présente des similarités avec les transcriptases inverses des rétrotransposons ce qui soulève la question de l'ancêtre commun : était-ce la RT d'un rétrotransposon ou celle d'une télomérase ? (Anxolabéhère et al., 2000 ; in Luchetta et al., 2005 ; Renault et al., 1997).

II.4.1. Recrutement de fonctions enzymatiques :

L'exemple le plus frappant d'un tel recrutement est probablement apporté par le système immunitaire des vertébrés. Ce système doit être capable de reconnaître des millions d'antigènes différents, cette diversité est générée au niveau des lymphocytes au cours de leur développement, suite à des remaniements de l'ADN au niveau des gènes codants les immunoglobulines et les récepteurs des cellules T, le processus conduisant à ces remaniements a été appelé Recombinaison V(D)J (In Luchetta et al., 2005 ; in Watson et al., 1994). Dans ce système, deux protéines RAG1 et RAG2, sont essentielles pour la recombinaison, elles possèdent en effet à la fois la propriété de reconnaître des séquences nucléotidiques spécifiques correspondant à des signaux de recombinaison

placés au voisinage des segments V, D et J, et celle de cliver de l'ADN immédiatement à proximité de ces signaux, ces derniers, composés d'héptamères et de nonamères très conservés et séparés les uns des autres par des séquences relativement homogènes de 12 ou 23 nucléotides, évoquent les répétitions terminales inversées de nombreux éléments transposables. Donc RAG1 et RAG2 se comportent exactement comme des transposases c'est-à-dire reconnaissance de sites de coupures et activité endonucléase. Par ailleurs le mécanisme de réparation de la coupure double brin de l'ADN après excision de fragments V(D) ou (D)J est similaire à celui observé pour la réparation chez les transposons Ac/Ds de Zea mays . L'ensemble de ces observations suggèrent que les gènes rag1 et rag2 dérivent d'un ancien élément transposable (l'élément Transib) de classe 2 possèdant des ITR semblables aux actuels signaux de recombinaison entre les séquences V, D et J. L'élément à l'origine de rag1 et rag2 serait devenu immobile par la perte de ses ITR (Figure 5.1) (Anxolabéhère et al., 2000 ; in Luchetta et al., 2005).

Figure 5.1 : Origine du système immunitaire des mammifères par coaptation de l`activité transposase d`un élément transposable : Les éléments transposables à l'origine de la recombinaison V(D)J devaient posséder des répétitions terminales inversées (RTI) comme ceux des transposons de type II, et deux gènes (rag1 et rag2) codant les deux propriétés essentielles d'une transposase : la reconnaissance des sites de coupures et l'activité endonucléasique. Selon le modèle, les recombinases RAG1 et RAG2 et les motifs répétés du système V(D)J dérivent de ces anciens éléments transposables (Anxolabéhère et al., 2000).

III. La régulation de la transposition :

Il est possible de constater que le nombre d'élément transposable est régulé et ce à différents niveaux. En effet, des analyses populationnelles intraspécifiques ainsi que des analyses interspécifiques montrent que le nombre d'éléments transposables dépend de l'espèce voire de la population considérée, et de type de l'élément lui-même. L'étude de la transposition a permis de mettre en évidence différents mécanismes expliquant la

régulation du nombre de copies, ceux assurés par l'élément et d'autre par le génome hôte (In Luchetta et al., 2005).

III.1. L'autorégulation de la transposition :

Les éléments transposables utilisent différents modèles pour effectuer une telle régulation pour leur transposition, soit par la titration de la transposase, ou par des régions régulatrices, la synthèse de répresseurs ou aussi l'inhibition par surproduction et enfin la Co-suppression (In Luchetta et al., 2005)

III.1.1. Titration de la transposase par les séquences délétées:

Ce premier modèle a été évoqué pour les éléments de la classe II, en effet, la transposase issue directement et seulement des éléments complets autonomes assure le déplacement des éléments complets en cis et les éléments délétés (nonautonomes) en trans. Alors s'il existe un plus grand nombre d'élément délétés que les éléments complets, la protéine sera alors insuffisante car titrée par les éléments délétés, la quantité par élément sera alors limitée pour assurer la transposition, d'une façon générale ce modèle n'a jusqu'à présent jamais pu être confirmé ou infirmer (in Luchetta et al.; 2005).

III.1.2. Les régions régulatrices :

Chez les rétrotransposons à LTR, les séquences nécessaires à une transcription basale sont localisées dans les LTR où une transcription bidirectionnelle (transcription du brin sens et du brin antisens) peut se faire, ceci aboutit à la production des messagers antisens pouvant créer des hybrides ARN-ARN avec les messagers sens et induire une répression. Néanmoins, la transcription du brin sens est majoritaire, dans un rapport 20:1 (In Rivière, 2000),

III.1.3. Synthèse de répresseurs :

Le cas le plus argumenté d'un tel modèle est le cas de l'élément P responsable de la dysgénésie des hybrides chez Drosophila melanogaster , le croisement entre des femelles M dépourvus de P et des mâles P qui en possèdent aboutit à une génération F1 stérile (les gonades sont atrophiés), le croisement réciproque ne produit aucune mutation

ce qui montre clairement l'existence d'une régulation à effet maternel liée à la présence de l'élément P dans la lignée germinale. Ainsi, l'enzyme principale de la transposition de l'élément P est une transposase de 87KDa obtenue depuis l'ARN complets après épissage de tous les introns, IVS1, 2 et 3. Cette protéine est spécifique de la lignée germinale car le dernier intron IVS3 n'est pas épissé dans la lignée somatique. De ce fait, pour la lignée somatique, la traduction produit une protéine tronquée de 66KDa en raison de la présence d'un codon stop dans ce dernier intron. Cette protéine joue le rôle d'un répresseur de la transposition en agissant sur le même site nucléotidique de la transposase (in Luchetta et al.; 2005).

III.1.4. Inhibition par surproduction:

Appelé aussi OPI (pour Over Production Inhibition), ce mécanisme de régulation a été mis en évidence avec les transposons mariner de la drosophile. Selon ce modèle la transposase de l'élément agirait sous forme d'un monomère. Cependant quand, la production de la transposase augmente, des multimères pourraient se former, l'activité transposase serait quant à elle inversement proportionnelle au niveau de polymérisation. Dans un tel schéma, plus il y a production de transposase, plus il y a polymérisation et moins la transposase est efficace (in Luchetta et al.; 2005).

III.1.5. La Co-suppression:

Elle était mise en évidence vers les années 1995 par son importance dans la transgénèse du fait que le nombre de séquences transgéniques insérées est inversement proportionnel avec leur expression. Il semble que la Co-suppression puisse être transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle:

III.1.5.1. La Co-suppression transcriptionnelle :

La diminution de la transcription se fait par des interactions entre les copies homologues des éléments transposables qui existent sur le même génome. Ainsi, ces copies pourraient se rapprocher et créer des régions hétérochromatiques (où la compaction de la chromatine est importante) inaccessibles à la machinerie de la transcription ou favoriser la méthylation des séquences.

III.1.5.2. La Co-suppression post-transcriptionnelle:

Dans ce cas, la transcription n'est pas affectée, mais les messagers synthétisés sont ainsi susceptibles de former des duplex, sensibles à une dégradation par les RNaseH (In Rivière, 2000).

III.2. Régulation de la transposition par les facteurs de l'hôte :

Le génome hôte peut aussi contribuer à la régulation de la transposition et c'est par différents mécanismes, les plus importants sont mentionnés ci-dessous :

III.2.1. L'effet de position :

Il est connu depuis longtemps que la position des gènes eucaryotes peut constituer un facteur capable de modifier leur expression. En ce qui concerne les éléments transposables, l'expression d'une séquence peut être modifiée du fait de la proximité d'une séquence << enhancer >> ou << silencer >>, celle-ci ayant la particularité de pouvoir agir à une grande distance, et dans les deux orientations. Ainsi il est probable que lorsqu'un élément soit inséré à l'intérieur d'un gène, il peut être transcrit avec le gène dans lequel il est inséré par un mécanisme de << readthrough » (l'ARNpolymérase continue la synthèse au-delà du stop de transcription de l'élément) ensuite l'élément est épissé du messager, comme s'il s'agissait d'un intron (In Rivière, 2000).

III.2.2. La régulation épigénétique :

La régulation épigénétique est un phénomène qui ne modifie pas la séquence du gène mais touche principalement la conformation de la chromatine et la méthylation des séquences. Toutefois, il est aussi possible que cette régulation fasse intervenir des facteurs cytoplasmiques. La notion d'hétérochromatinisation observée chez la drosophile correspond à un état très condensé du matériel génétique. L'hétérochromatine est constituée essentiellement de séquences hautement et moyennement répétées. Du fait de son importance compaction, elle constitue un cimetière pour les éléments transposables, ce phénomène n'est pas remarqué chez les plantes et les vertébrés. Un autre mécanisme de régulation est utilisé par ces organismes, la méthylation des séquences. La méthylation est un processus qui concerne la cytosine suivie d'une guanine (se sont les îlots CpG),

plus ces séquences sont méthylées moins le gène porteur est exprimé, le cas le bien connu est le cas de l'élément IAP de la souris, ces éléments sont exprimés principalement dans les testicules parce qu'ils sont hypométhylés dans ce tissu, en revanche, ils sont hyperméthylés dans les autres tissus et donc inactivés (In Rivière, 2000).

IV. La transmission des éléments transposables :

Dans la plupart des analyses détaillées des éléments transposables, il est montré que leur phylogénie ne suit pas toujours la phylogénie des espèces hôtes. En effet, deux mécanismes illustrent la manière de la transmission des éléments transposables entre les individus :

L'introgression, la polyspermie et divers vecteurs sont trois mécanismes estimés d'être à l'origine du transfert horizontal. L'introgression est la possibilité de l'hybridation des deux espèces dont l'un des sexes est fertile ; aussi une grande partie du matériel génétique d'une espèce peut être transmis à l'espèce jumelle. La polyspermie est la

fécondation d'un oeuf par deux spermatozoides d'espèce différentes, cela n'ai été jamais clairement démontré. Les vecteurs qui peuvent participer dans ce type de transfert sont les parasites et parasitoïdes, les baculovirus, les éléments transposable et des bactéries comme les rickettsies (In Halaimia Toumi, 2006).

I. Définition et Découverte:

Les éléments mariner sont des transposons de la classe 2 appartenant à la super famille des Tc1/maT/MLEs et à la famille des MLEs (pour mariner like elements). Ils sont très largement répandus dans les génomes des eucaryotes; ils sont dits "des ubiquistes". Le premier élément mariner était découvert par Jacobson et Hartl (1985) dans le génome de la mouche Drosophila mauritiana parce qu'il y avait causé une mutation qui était exprimé par une couleur mutée des yeux suite à l'expérimentation suivante: (Hartl, 2001)

Drosophila simulans × Drosophila mauritiana
Une première génération hybride, fertile et non mutée
Croisement entre les individus de la 1^ère génération

Une 2^ème génération présentant une mutation instable dans les couleurs des yeux

Clonage de l'allèle wpch
Observation d'une séquence étrangère insérée dans l'allèle qui était nommée mariner

Figure 6 : Résumé des expériences conduisant à la découverte du transposon mariner
(D'après Hartl, 2001)

I.1. La nomenclature des MLEs:

Les transposons mariner suivent actuellement la nomenclature suivante:
· Xymarz:

Exemple: le 1^er élément mariner qui a été découvert est appelé: Dmmar1 pour Drosophila mauritiana mariner n°1 (Halaimia.Toumi et al; 2004).

II. Structure et fonctionnalité des éléments Tc1/mariner : II.1. Structure générale des MLEs et TLEs:

Un MLE ou TLE typique est une séquence d'une taille comprise entre 1300 et - 4000 pb, elle est constituée d'un seul ORF (dépourvu d'intron ou avec un ou plusieurs introns) codant la transposase (environ 345 aa). (In Augé gouillou, 2003; In Toumi, 2001- 2002; Halaimia Toumi et al, 2004).Cet ORF est bordé par deux ITRs d'une taille comprise entre 19-750 pb, les 5' ITR et 3' ITR sont séparés de l'ORF par une séquence non traduite appelée UTR (UnTranslated Region), (figure 6.1) (In Halaimia Toumi, 2006).

ITR: répétition terminale inversée (Inverted Terminal Repeat) UTR: région non traduite (UnTranslated Region)

II.1.1. Les mariner- like elements ou MLEs: II.1.1.1. Structure nucléique:

La majorité des éléments mariner décrits jusqu'ici sont d'environ 1300pb dont le gène de la transposase (ORF) est d'environ 1050pb (Figure 6.2), la taille des ITRs varie de 19pb (comme dans le cas de l'élément Acmar1 de l'abeille apis cerana) à 69pb (élément Ahmar1 du lépidoptère Adoxophyes honmai) (In Halaimia Toumi, 2006). D'une manière générale, les MLEs présentent une homogénéité structurale plus que celle des TLEs à l'exception de l'élément Mcmar1, isolé du nématode meloidogyne chitwoodi qui porte des ITRs de 355pb et un ORF qui code pour une transposase de 350 aa (In Augé Gouillou, 2003).

II.1.1.2. Structure protéique:

La transposase active des MLEs est un polypeptide de 350aa organisé en deux domaines (In Toumi, 2001-2002; In Halaimia Toumi, 2006), un domaine N terminal responsable de la liaison de la protéine aux ITRs et un domaine C terminal doué d'une activité catalytique permettant la transposition (In Augé Gouillou, 2003). Ce domaine est caractérisé par la présence d'une triade catalytique D,D(34)D dont le premier et le second acide aspartique (D) est localisé à proximité des positions 158 et 250 respectivement et le dernier est séparé du second par 34 acides aminé (In Toumi, 2001-2002).

Ces deux domaines comprennent des motifs qui semblent indispensables à la transposition:

II.1.1.2.1. Les motifs caractéristiques du domaine N-Terminal:

5. Un motif WVPHEL relativement conservé et paraît impliquer dans un phénomène de trans-dimérisation des molécules de la transposases (In Augé Gouillou, 2003).

II.1.1.2.2. Les motifs caractéristiques du domaine C-Terminal:

Outre que la triade catalytique D,D(34)D, ce domaine comporte un motif YSPDLAPD très conservé dont le dernier D de ce motif correspond au dernier D de la triade catalytique (figure 6.3) (In Halaimia Toumi, 2006).

La transposase est une phosphoryletransférase dont activité catalytique (de la triade D,D(34)D) requiert des cations divalents qui est le magnésium, les trois résidus acides sont associés dans une poche catalytique capable de contenir le ou les cations, la présence du magnésium apporte des charges positives permettant le recrutement des groupes nucléophiles impliqués à chaque coupure de brin d'ADN. Le motif DDD est une signature qui spécifie les éléments mariner tandis que les TLEs sont spécifiés par une triade DDE (E pour le glutamate) (In Augé Gouillou, 2003).

Figure 6.3 : Structure générale de la transposase des MLEs (ici la transposase de Mos1)
(modèle d'après Halaimia Toumi, 2006)

Taille de	MLEs				TLEs
ORF	1050				1050#177;90
ITR	19-69 Mcmar1	à	l'exception	de	24-756
UTR					150-1300 en 5' 100-2200en 3'
Taille totale	1300				1500-4700

Selon leurs structures protéiques, ils se distinguent dans: (voir tableau 3)
Tableau 3: les différences protéiques entre les MLEs et les TLEs

Domaine D Terminal	MLEs	TLEs
HTH	Un seul motif	Deux motifs
Les hélices á	Huit hélices á	Deux hélices dont chacune est associée à un HTH
Les motifs conservés	WVPHEL	WVPHEL

Dans le domine C terminal les deux éléments se diffèrent dans la triade catalytique qui est D.D(34)E chez les TLEs (Figure 6.4)

Figure 6.4 : Structure de la transposase des TLEs (ici la transposase de Sleeping
Beauty) (In Halaimia Toumi, 2006)

III. Fonctionnalité des MLEs : III.1. Les MLEs actifs :

Le premier élément reconnu comme un MLE actif est Mos1 (pour mosaic) qui était isolé par Jacobson et Hartl en 1986, (Hartl, 2001) à partir du génome de Drosophila mauritiana, un autre élément appelé Himar est construit à partir d'un élément muté isolé de la mouche Haematobia irritans, un troisième élément Famar1 était découvert chez le perce-oreille Forficula auricularia. (In Halaimia Toumi, 2006)

III.1.1. Le mécanisme de transposition des MLEs :

Tous les MLEs et aussi les TLEs transposent via un mécanisme de type « coupercoller » homologue à celui décrit chez quelques IS et Tn, ce mécanisme est constitué par trois étapes principales :( figure 6.5)

Figure 6.5: Schéma du mécanisme de transposition des MLEs (Modèle d'après Augé
Gouillou, 2003)

III.1.1.1. Liaison aux ITRs :

La liaison aux ITRs est assurée par le domaine N-Terminal (plus précisément par les HTH, l'hélice á₁ et á₂) qui reconnait spécifiquement chaque ITR, cette liaison aboutit à la formation d'une structure nucléoprotéique active qui est << le transpososome >>.

Deux types de dimérisation protéine-protéine peuvent avoir lieu lors de la formation des complexes ITR/transposase :

1- Interface de dimérisation << Cis >> : C'est la liaison de deux monomères de transposase côte à côte sur une seule molécule d'ADN, cette interface est localisée dans les premiers 20 aa.

2- Interface de dimérisation << trans >> : la liaison de deux molécules de transposases liées à deux molécules d'ADN différentes.

Ainsi, la région de la transposase située entre les aa 116-143 et qui comprend le motif WVPHEL est directement impliquée dans le passage d'une conformation cis à une conformation trans et la stabilité de cette dernière.

La transposase se lie aux ITRs au niveau d'une séquence cible palindromique aboutissant à la formation d'un complexe appelé cis-SE (Single End Complex 2), trois voies principaux sont proposées pour la destination de ce complexe :

1' La dissociation d'un monomère de transposase du complexe SEC-2 conduisant à la formation d'un complexe SEC1. (SEC1 : une molécule de transposase liée à un ITR, SE : 2 molécules de transposase liées à un ITR.)

1' Un monomère du complexe SE subit une modification conformationnelle caractérisée par l'acquisition d'une nouvelle conformation plus stable dite << Trans-SE >> dont les deux monomères possèdent une interface cisdimérisation libre. Un monomère du trans dimère peut recevoir un autre ITR en formant le complexe PEC1 (Paired End Complex 1). Enfin via les interfaces de dimérisation libres les deux transposases de ce complexe sont susceptibles de se lier à deux autre transposases pour former le complexe synaptique final dit PE.

1' Le complexe final PE résulte directement de la dimérisation de deux complexes cis-SE (Figure 6.6) (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 6.6: Représentation schématique des différents complexes transposase/ITR
SEC: Single End Complex. PEC: Paired End Complex
(Modèle in Halaimia Toumi, 2006).

Les tests in vitro utilisant une protéine recombinante montrent qu'elle nécessite la présence des cations divalents (Mg⁺², Mn⁺², ou Ca²⁺) et un Ph élevé (autour du 9) et que la liaison Tnp/ITR est hautement spécifique parce que la transposase Mos1 ne se lie que sur ses propres ITRs ce qui explique l'absence d'un phénomène de transposition croisée (la transposition in trans). Les ITRs du Mos1 sont imparfaits parce que la séquence de l'ITR5' diffèrent de celle de l'ITR3' en 4 positions sur 28pb (position 1, 16, 18 et 26). Il a été démontré que les positions 1, 18 et 26 sont des contacts stabilisants entre la transposase et l'ITR parce qu'ils ont un faible impact sur la qualité et la quantité de la transposition, en revanche une forme mutée d'un ITR dans la position 16 a conduit à une perte de 90% la liaison Tnp/ITR ce qui suggère qu'elle est un point d'ancrage de la transposase sur l'ITR (In Augé Gouillou, 2003).

III.1.1.2. L'excision de l'élément :

Les coupures réalisées par les transposases des MLEs et ceux des TLEs aux bornes des ITRs pour faire libérer l'élément sont assurées par la poche catalytique démontrée qu'elle est très importante dans la catalyse par mutagénèse dirigée, chez de nombreux transposons bactériens apparentés aux MLEs et TLEs. En effet, chez les MLEs cette étape se déroule en deux phases (figure 6.7).

Figure 6.7 : Les étapes de l'excision d'un élément de type mariner (D'après Augé
Gouillou, 2003)

Le comportement de la transposase mariner dans le processus de l'excision est semblable à celui des protéines RAG1/RAG2 impliquées dans la recombinaison V(D)J permettant l'assemblage des gènes pour la production des immunoglobulines. Des structures en boucles comme celles observées dans ce système ont été recherchées après excision de l'élément, cependant la présence des boucles n'a pas pu être établie ainsi que la structure de l'intermédiaire de transposition (In Augé Gouillou, 2003 ; in Halaimia Toumi, 2006). En général plusieurs solutions sont envisageables :

" L'intermédiaire de transposition présente une forme linéaire avec des extrémités libres comme le cas du transposon Tn7.

" Il est également linéaire mais avec des extrémités en « hairpin » comme dans IS10, IS50, au moment de l'insertion ces structures vont être résolues par la transposase.

" L'intermédiaire de transposition est circulaire où les ITRs sont en position TêteBêche et associées par une jonction de quelques paire de bases (le cercle est résolu par la transposase avant l'insertion).

Les produits de l'excision des TLEs et des MLEs se ressemblent, alors que la chronologie des étapes semble légèrement différente, les TLEs ont également faits l'objet de travaux pour identifier la structure de leur intermédiaire de transposition, mais les résultats sont paradoxaux, par exemple :

L'élément Tc1 a un intermédiaire de transposition qui est soit linéaire, soit circulaire selon les auteurs. Enfin la structure de l'intermédiaire de transposition dans la famille Tc1/mariner reste donc à établir (In Augé Gouillou, 2003).

III.1.1.3. La réinsertion de l'élément dans son site cible :

Au cours de cette étape le transposon est transféré par la transposase dans un site accepteur du génome hôte. Ce site est caractérisé par la présence d'un dinucléotide TA dupliqué lors de l'insertion, les mécanismes moléculaires intervenants pendant cette étapes sont encore inconnus. (In Halaimia Toumi, 2006).

Mariner est le parasite génétique le plus ubiquiste connu chez les eucaryotes, cette propriété explique l'intérêt fondamental de l'étude des MLEs ainsi que les perspectives de valorisation biotechnologique et médicale d'un tel modèle biologique.

III.1.2.1. L'intérêt fondamental :

Les MLEs peuvent jouer un rôle dans la plasticité des génomes hôtes, en favorisant les réarrangements chromosomiques par exemple : chez la drosophile les changements de place des transposons étaient essentiellement associés à des réarrangements chromosomiques qu'à de la transposition. Sous cette hypothèse, toutes les copies même inactives participent majoritairement dans l'évolution des génomes. Présents dans de nombreux génomes eucaryotes et souvent avec un nombre élevé de copies en grande partie inactive, les MLEs pourraient être des acteurs importants de la plasticité des génomes eucaryotes. La présence des copies active favorise et renforce leur impact sur les génomes en affectant directement la régulation de l'expression des gènes comme dans le cas de Dmmar1. Un exemple du rôle possible des MLEs dans la recombinaison a d'autre part été illustré dans le génome humain par : la maladie de Charcot-Marie Tooth qui est due à un crossing-over inégal sur le chromosome 17p, un élément mariner a été identifié à proximité du point de recombinaison et les auteurs suggèrent que la recombinaison pourrait avoir été favorisé par une cassure de l'ADN due à la transposase. Il semble que les éléments mariner aient, ou ont eu, la capacité de se perpétuer en colonisant de nouveaux génomes, suite à des transferts horizontaux, alors les MLEs pourraient jouer un rôle dans l'évolution des génomes.

III.1.2.2. L'intérêt appliqué :

Grâce à leurs ubiquité et activité, les éléments mariner offrent les bases intéressants d'un vecteur de transfert d'ADN. Une transposase hyperactive dérivée de l'élément Himar1 a été obtenue par ingénierie moléculaire, démontrant qu'il est possible d'améliorer les MLEs naturels peu efficaces en transposition. Ainsi de nombreuses publications décrivant l'obtention, grâce à mariner des organismes ou de lignée de cellules transgéniques chez les protozoaires, les insectes, les poissons et les oiseaux

confirment que mariner est un bon candidat pour transférer l'ADN exogène chez les eucaryotes (In Augé Gouillou, 2003 ; in Halaimia Toumi, 2006). Par exemple chez la souris, il est possible de transfecter des cellules souches avec un élément mariner modifié (le gène d'intérêt flanqué par des ITR d'un élément mariner), les cellules transformées seront par la suite transplantées dans une femelle, et le gène d'intérêt sera exprimé dans la génération suivante.

Figure 6.8 : Les différentes étapes de la transgénèse à l'aide de mariner chez la souris
(d'après Halaimia Toumi et al., présentation GBM ).

Plusieurs éléments mariner ont été découverts mais la majorité d'entre eux sont inactifs parce qu'ils accumulent des mutations ponctuelles ou des délétions.

Ainsi il existe 9 transposons potentiellement actifs, c'est-à-dire que leurs ORFs sont
complets mais leur activité de transposase n'a pas été démontrée. Ces éléments sont

Tableau 4 : Quelques éléments mariner potentiellement actifs (In Halaimia Toumi,
2006).

Elément	Espèce hôte
Ccmar1	Ceratitis capitata
Crmar1	Ceratitis rosa
Momar1	Metaseuilis occidentalis
Mcmar1	Meloidogyne ^chitwoodi
Tvmar1	Trichomonas vaginalis
Mdmar1	Musca domestica
Bgmar1	Blatella germanica
Mbomar	Messor bouvieri

La caractérisation d'un transposon se fait en suivant 4 étapes principales : III.3.1. Recherche des éléments mariner à partir de l'ADN génomique par PCR :

III.3.1.1. Extraction de l'ADN génomique: L'ADN est extrait à partir des organismes entiers et de tissus congelés à -80°C ou dans l'azote liquide. L'échantillon sera broyé dans du tampon de préservation. Les protéines et les débris cellulaires peuvent être éliminés par un traitement au phénol/chloroforme. Les acides nucléiques seront ensuite précipités à -80°C par de l'acétate de sodium et de l'éthanol absolu. Un traitement à la RNAse A et une ultracentrifugation sur gradient de Chlorure de Césium permettent d'achever la purification. Après ultracentrifugation, l'ADN peut être récupérer

sous rayonnement ultraviolet. Le Bromure d'Ethidium est ensuite éliminé par des lavages successifs à l'isopropanol saturé par une solution de NaCl. L'ADN se précipite par addition de l'eau ultra pure et de l'isopropanol pendant 2 heures à -20°C. Après centrifugation, le culot sera repris dans l'acétate de sodium et l'ADN sera reprécipité en ajoutant de l'éthanol absolu pendant 2 heures à -80°C. Après centrifugation 15 minutes à 15000g, le culot d'ADN doit être lavé avec de l'éthanol 70°C (In Halaimia Toumi, 2006).

III.3.1.1. PCR: Après extraction de l'ADN génomique d'un organisme, les transposons mariner seront recherchés par PCR (Polymerase Chain Reaction ou l'amplification en chaîne par polymérase) (In Halaimia Toumi, 2006). Inventée par Kary Mullis (prix Nobel de Chimie 1993), cette technique est utilisée pour amplifier une séquence d'ADN cible en utilisant une paire d'amorces d'oligonucléotides, chacune complémentaire à une extrémité de la séquence cible. Celles-ci subissent une élongation par une ADN polymérase thermostable (la Taq polymérase), dans un cycle de réaction à trois étapes : dénaturation, hybridation de l'amorce et enfin polymérisation (Figure7) (In Turner et al., 2002). Les amorces utilisées pour la recherche de ce type du transposon sont les amorces de Robertson décrites en 1993 et qui correspondent aux motifs conservés des transposases mariner (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 7 : Les différentes étapes de la technique PCR (D'après www.inrp.fr)

III.3.2. Hybridation des éléments par la technique de Southern Blot : Elle est utilisée
pour confirmer s'il existe vraiment des transposons dans le génome d'intérêt ou non.
Cette technique fut inventée par Southern (1975-1979b) est basée sur le transfert des

acides nucléiques sur une membrane pour le repérage des séquences complémentaires à une séquence spécifique d'ADN ou d'ARN appelée sonde, la membrane d'hybridation est placée en sandwich entre le gel et un papier absorbant qui assure l'entraînement de solution-tampon à travers le gel (Figure 8) (In Primose et al., 2004). Les sondes utilisées pour le repérage des transposons mariner sont des transposons mariner apparentés car ils présentent un taux d'homologie très importants (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 8 : Schéma démontrant le principe de Southern Blot (D'après Griffiths et al. 2004)

III.3.3. Séquençage par la méthode de Sanger : Les fragments obtenus par les techniques précédentes seront envoyés au séquençage, une des méthodes de séquençage la plus utilisée est celle de Sanger. Cette méthode fait intervenir une étape de dénaturation des deux brins, une hybridation avec une amorce marquée radioactivement et une élongation par une ADN polymérase en présence de didésoxyribonucléosides

triphosphate (ddNTP). Ces molécules peuvent être normalement incorporées dans un brin d'ADN en élongation grâce à leur extrémité 5' triphosphate mais ne peuvent pas former de liaison phosphodiester avec le nucléoside triphosphate suivant. Lorsqu'une faible quantité d'un ddNTP est présente (ddATP par exemple) en plus des quatre dNTP nécessaires pour la polymérisation (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), plusieurs fragments marqués sont générés. Ils correspondent tous à des fragments portant un résidu ddATP à l'extrémité 3'. En répétant l'expérience pour les autres ddNTP et en séparant les différents fragments d'ADN de chaque réaction de polymérisation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (séparation selon la taille des séquences), la séquence du fragment d'ADN de départ peut être déduite. Aujourd'hui, des séquenceurs automatiques de l'ADN existent sur le marché. Ils sont capables d'effectuer l'électrophorèse et de déterminer directement la séquence nucléotidique par une lecture d'un ou de plusieurs fluorochromes (Figure 9) (In Primose et al., 2004).

Figure 9: Le séquençage selon la méthode de Sanger. (a) : l'addition d'une amorce marquée et ddNTP et poursuit de l'élongation. (b) : les fragments résultants des différentes réactions sont séparés par éléctrophorèse. (c) : le gel de séquençage de Sanger (d'après Griffiths et al., 2004)

III.3.4. Analyse des séquences in siico : Les séquences obtenues seront analysées in silico par des logiciels de traitement de séquences spécifiques. Ces derniers comparent les nouvelles séquences par rapport aux autres séquences existantes dans la base des données, ainsi ils permettent la recherche des motifs caractéristiques. Par exemple, l'analyse d'un élément mariner issu d'un organisme des sources hydrothermales océaniques (l'élément Alvcmar du ver Alvinella caudata) a montré la présence des motifs conservés WVPC(R/X)NL et YSPDL(A/T)(P/H) au lieu des motifs WVPHEL et YSPDLAP définis par Robertson 1993. Ainsi ces analyses ont permis la mise en évidence de deux codons start, cette remarque permet d'émettre l'hypothèse que ce transposon peut coder pour deux isoformes différentes de la transposase (Figure 10). Cette transposase ressemble aux autres transposases des éléments mariner dans la triade catalytique D.D(34)D, le premier D se trouve au niveau d'un motif conservé DETWV, le second est localisé dans le motif HDN et le dernier se trouve juste après le motif YSPDL(A/T)(P/H). De plus, elle présente un feuillet â dans leur domaine N-terminal, et des hélices « HTH », enfin un signal potentiel de localisation nucléaire NLS a été observé dans la région C-terminal (Figure11) (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 10 : Structure nucléique de l'élément Alvcmar (D'après Halaimia Toumi,
2006)

CGGTTAGGACTGGTTCTGAC AWG TTC ACA AGC AGC GCC GCT CCG CTC CCT CGC TCC CTC 130 X F T S S A A P L P R S L 13

D R V E A M I M E	N	R R V K V E E I	121
Hélice á

CTG TTC CGC CAG CTC AAG TCC TCG TTG CGG GGG CGG AGG TTC GAC GAC GAT GAT 1102 L F R Q L K S S L R G R R F D D D D 337

GAG GTC AAG GAG GCT GTG ATG ATG TGG TTG GAG GAG CAG TCG GAA TCC TTC TGG 1156 E V K E A V M M W L E E Q S E S F W 355

CTG GCA GGA ATC CAG AGC CTT CGC GAC AAG TGG TTC AAG TGT ATT CAA GTC AAG 1210 L A G I Q S L R D K W F K C I Q V K 373

GGT AAT TAC ATT GAA AAA TGATGTGGTTATCATTTTCATTCCTCCGAAATAAAATACATACCGAA 1275 G N Y I E K * 379 TTGCAGAACTTTCTGACCGCCCCTCGTA

III.2.1.4. Analyse fonctionnelle d'un transposon de type mariner :

L'étude fonctionnelle des différentes transposases mariner peut être réalisée selon deux stratégies : les tests de transposition in vitro, et les tests de transposition in vivo.

III.2.1.4.1. Tests de transposition in vitro :

Ces tests permettent l'analyse et l'interprétation des différentes étapes de la transposition indépendamment chacune de l'autre (voir figure 6.5 page 63). Pour réaliser cette approche il est obligatoire de produire la transposase, cette étape nécessite le clonage d'un transposon dans une bactérie. Il doit être véhiculé par un vecteur d'expression en se liant en aval d'un promoteur fort. Le vecteur et le gène codant la transposase seront clivés par la même enzyme de restriction pour assurer la complémentarité des bases. Le plasmide pMAL est largement utilisé, Il est caractérisé par la présence d'un gène de la résistance à l'ampicilline (Permettant une sélection) et permet la production de la transposase sous une forme fusionnée avec la MBP "Maltose Binding Protein" (Figure 12). L'expérience permettant la production des transposases est citée ci-dessous:

1' Préparation du gène codant la transposase en le fusionnant avec le gène de la MBP porté par le plasmide pMAL de sorte qu'il soit insérer en aval d'un promoteur inductible (Figure13).

v' Sélection des bactéries transformées selon leur résistance à l'antibiotique.

v' Culture des bactéries dans un milieu nutritif et l'induction de l'expression de la transposase par l'IPTG (l'IsoPropyl-B-D ThioGalactopyranoside).

v' Extraction des protéines recombinantes par la lyse des parois bactériennes en utilisant les lysosymes, puis centrifugation pour l'élimination des débris cellulaires et enfin le dosage des protéines obtenues.

Figure 12 : Expression de la transposase fusionnée à la MBP par le plasmide
pMAL.

v' La transposase fusionnée sera purifiée par la chromatographie d'affinité : la fixation des protéines s'effectue sur une résine amylose, l'élution sera réalisée par le maltose (Figure 12).

v' La technique SDS-PAGE donne une estimation sur la taille des protéines fusionnées, par exemple la transposase fusionnée d'Alvcmar mesure 80KDa sachant que la MBP seule mesure 40KDa, alors la transposase d'Alvcmar peut mesurer 40KDa (Figure 14) (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 14: Analyse de la production des protéines sur gel SDS -PAGE (d'après
Halaimia Toumi, 2006)

- Surnageants récupérés après la purification de la MBP (2), Transposase A (5).

Figure 13 : Le clonage du gène de la transposase mariner ligué avec le plasmide
pMAL dans une bactérie ( perso.univ-lyon2.fr)

La production de diverses transposases mariner a révélé l'existence de plusieurs versions tronquées, en effet, Erwan et al. (2005) ont montré pendant la production d'une transposase IS911 la présence de plusieurs formes tronquées. Une de ces formes s'est avérée un inhibiteur pour la transposition, alors le phénomène de la transposition est vraisemblablement limité si des transposases tronquées sont disponibles. (In Halaimia Toumi, 2006).

III.2.1.4.1.1. Analyse de la liaison des transposase de type mariner aux ITRs :

Ce test sera assuré par une technique appelée l'analyse de retard sur gel (In Halaimia Toumi, 2006), cette technique mis en évidence la liaison d'une protéine à une séquence d'acide nucléique marqué, la migration des complexes ADNmarqué/protéine, sur un gel de polyacrylamide non dénaturant, sera retardée par rapport à celle de l'ADN seul (In turner et al., 2002) (Figure 15). Cette technique est basée sur l'incubation de la transposase mariner indépendamment avec les ITR3' et 5' marqué avec du dATP (ãP ³²), soit par le marquage de l'ADN double brin en effectuant une phosphorylation avec la T4 nucléotide kinase, ou par le marquage des ITRs monocaténaires puis leur hybridation pour l'obtention d'une structure bicaténaire. Les complexes ITR3'/Tnp, ITR5'/Tnp, seront formés dans un milieu contenant du tampon de colonne, glycérol (pour le maintien de la stabilité), de l'ADN du sperme de Saumon (compétiteur non spécifique), tous ça en présence ou absence d'EDTA (chélateur de cations) et de Mg²⁺. La séparation sera réalisée sur un gel composé de deux gels de polyacrylamide superposés : un gel de séparation au dessus d'un gel de résolution, la migration doit s'effectuer à des températures adaptées aux conditions de vie des organismes hôtes (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 15 : Principe de la technique de retard sur gel (d'après Halaimia Toumi,
2006)

Figure 16 : Analyse de la liaison de la transposase
Mos1 (d'après Augé Gouillou et al., 2005)

En effet, il a été montré par Augé-Gouillou et al, 2001 que la transposase de Mos1 reconnaît et se fixe spécifiquement à ses ITRs en présence de cations Mg²⁺. Ces auteurs ont observé aussi que l'ajout d'EDTA, qui chélate les ions Mg²⁺ dans le milieu réactionnel au cours des expériences de retard sur gel diminue légèrement le taux de liaison Tnp/ITR, ce qui suggère que la transposase Mos1 utilise les ions Mg²⁺ dans la catalyse. De plus, ils ont pu visualiser les

différents complexes formés par la transposase Mos1 grâce à la technique du retard sur gel (Figure 16).

III.2.1.4.1.2. Test de spécificité de liaison des transposases de type transposase mariner aux ITRs :

Le principe de ce test est la vérification de la spécificité de la liaison d'une protéine à son ligand, dans ce cas, de la transposase mariner aux ITR3' et 5'. Cette vérification peut être réalisée par l'addition d'ADN compétiteur dans le milieu réactionnel (Figure 17). Sur un gel de polyacrylamide homologue à celui de l'analyse de retard sur gel, cette spécificité sera analysée c'est-à-dire s'il existe une spécificité, le même profil de migration sera obtenu en présence ou absence d'un ADN compétiteur, pour la confirmation, la transposase doit être incubée avec un ITR radioactif et un autre non radioactif mis en excés ; alors en cas de spécificité, la fixation de la transposase avec l'ITR froid sera plus importante qu'avec l'ITR radioactif. (Figure 17). Un exemple d'une telle spécificité est fournit par l'élément Bytmar issu du crabe Bythograea thermydron qui provient des sources hydrothermales océaniques, le test de spécificité de sa transposase a montré une spécificité satisfaisante à ses ITR car le profil de migration n'a pas été changé au cours de l'addition de l'ADN compétiteur non spécifique, aussi la réaction a été légèrement déplacée en présence des ITR non radioactif (Figure 18) (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 17 : Schéma explicatif du principe de l'analyse de spécificité : Dans le premier cas la transposase est incubée avec l'ITR radioactif, dans le deuxième cas la transposase est incubée avec l'ITR radioactif et un ADN compétiteur mis en excès et dans le troisième cas la transposase est incubée avec de l'ITR radioactif et de l'ITR non radioactif mis en excès. (D'après Halaimia Toumi, 2006).

Figure 18 : Analyse de la spécificité de la fixation de la transposase Bytmar avec leurs ITRs (Conditions expérimentales 30°C-2h)

3 : Tnp + ITR marqué + ITR non marqué mis en excès (D'après Halaimia Toumi, 2006).

Pour l'analyse des phénomènes de coupure, un test de coupure peut être réalisé. La transposase mariner sera mise en contact avec 3 plasmides contenant un pseudotransposon indépendamment, le premier porte à ses extrémités des ITR3' et 5' (appelé construction 5T3), le deuxième porte à chaque extrémité un ITR5' (construction 5T5) et le troisième porte à chaque extrémité un ITR3' (construction 3T3). Chaque construction sera additionnée à un milieu réactionnel permettant sa coupure par la transposase. L'ADN coupé sera ensuite analysé dans un gel d'agarose. 3 formes plasmidiques seront attendues (Figure 19) :

Figure 20 : Analyse en test de coupure de la transposase Alvcmar avec la construction 5T5. M : marqueur de Taille, T1 : témoin de linéarisation, T2 : témoin de test de coupure, t0h à t6h : les incubations faites en cinétique de temps 0h à 6h (D'après Halamia Toumi, 2006)

Dans le cas de la transposase d'Alvcmar, ce test a montré une spécificité assez satisfaisante. Ceci a été confirmé par la dominance de la forme linéaire avec la construction 5T5, en plus les trois formes plasmidiques ont été observées avec une hétérogénéité des pourcentages avec les deux autres constructions (Figure 20) (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 21 : Test de transposition in vivo : Un plasmide permettant l'expression de la transposase (pMAL ou pBAD Tnp) et un plasmide portant un mini-transposon constitué du gène de résistance à la tétracycline (rectangle mauve), sans son promoteur (pBC Tet) sont cotransformées dans une bactérie (rectangle bleu) (1). La transposase (rond noir) se fixe sur les ITR (flèches roses) du mini-transposon (2) et permet l'excision du minitransposon (3) qui se réintegrera soit dans un plasmide, soit dans l'ADN génomique (4) (D'après Halaimia Toumi, 2006).

III.2.1.4.2. Les tests de transposition in vivo :

Ces tests ont pour objectif l'obtention de réponses directes concernant l'activité ou non d'une transposase de type mariner. Ces tests sont réalisées à l'aide des bactéries co-transfomées par deux plasmides ; un plasmide contenant un pseudotransposon et un autre portant le gène de la transposase. Si la transposase est active, elle peut exciser et réinsérer le pseudotransposon. En cas où, la réinsertion est effectuée en aval d'un promoteur, des événements de transposition peuvent être détectables par un système de sélection spécifique (In Halaimia Toumi, 2006). (Figure 21).

Figure 22 : Les différents étapes permettant la construction de vecteur porteur de
gène da la transposase (D'après Halaimia Toumi, 2006).

Etape 4 : Clonage dans un vecteur d'expression préalablement digéré à l'aide des
enzymes E1 et E2

Selon la figure, les bactéries résistantes à la tétracycline résultent de la transposition du gène de la tétracycline en aval d'un promoteur, pour effectuer ce test, il faut passer par les étapes suivantes :

III.2.1.4.2.1. Construction des vecteurs permettant l'expression de la transposase mariner : (Figure 22)

Un plasmide pMAL c2 : (déjà décrit dans la partie ) Il permet l'expression de la transposase en fusion avec la MBP via un promoteur lacI inductible à l'IPTG, la transposase sera produite sous une forme fusionnée ce qui facilite sa purification par une réaction d'affinité, ce vecteur porte un gène de résistance à l'ampicilline

Un plasmide pBADR : Il permet l'expression de la Tnp via un promoteur inductible à l'arabinose et possède aussi un gène de résistance à l'ampicilline.

Les deux vecteurs seront digérés par des endonucléases de restriction, et le gène de la transposase sera amplifié par PCR, des nucléotides seront additionnés aux amorces de polymérisation afin de reconstituer des sites d'enzymes de restriction aux extrémités 5' et 3', ces sites correspondent aux sites de restrictions connus par les enzymes utilisées pour la digestion des deux vecteurs. Enfin le gène de la transpsase sera inséré dans les vecteurs d'expression par ligation en utilisant une DNA ligase. (In Halaimia Toumi, 2006).

III.2.1.4.2.2. La construction de plasmide pBC KS(+) contenant le pseudo transposon :

Le pseudo-transposon est le gène de la résistance à la tétracycline (Tet^R) sans son promoteur, flanqué par un ITR en position 5' et 3'. Les ITRs double brin peuvent être produits par hybridation d'un ITR simple brin up et un ITR simple brin down, et c'est en ajoutant des oligonucléotides qui constituerons après hybridation des sites de restriction, ces derniers permettent le clonage des ITRs dans le plasmide pBC KS(+) (Figure 23), trois constructions différentes peuvent être constituées dont chacune contient une combinaison des ITRs différents (Figure 24), les ITRs à insérer seront digérées par les mêmes enzymes de restrictions utilisées pour la digestion du vecteur (In Halaimia Toumi, 2006).

Figure 23 : Les différentes étapes de construction du vecteur pBC KC (+) porteur du
pseudotransposon. (D'après Halaimia Toumi, 2006)

Figure 24 : Les différentes constructions de pBC porteur de pseudo-transposon réalisées
(D'après Halaimia Toumi, 2006)

III.2.1.4.2.3. Réalisation des tests de transposition in vivo :

Les bactéries co-transformées par les deux plasmides construits précédemment seront mises en culture, puis sélectionnées sur des boites LB-tétracycline. Dans les clones contenant le plasmide pMAL, la transcription de la trasposase sera induite par l'IPTG, tandis que celle des clones contenant le plasmide pBAD sera induite par l'arabinose. Le taux de transposition est calculé par le rapport :

Nombre de bactéries sur les boites LB-tétracycline
Nombre de bactéries sur les boites LB

Les clones qui présenteront une résistance à la tétracycline seront analysés par extraction de leurs plasmides et ses linéarisations à l'aide d'une enzyme de restriction pour la vérification de l'existence d'un tel évènement de transposition. La résistance à la

tétracycline peut être expliquée par le fait que la transposase a effectuée l'intégration du pseudo-transposon en aval d'un promoteur qui doit être du côté du codon ATG du gène de la tétracycline (In Halaimia Toumi, 2006).

Augé Gouillou et al., (2001) ont mis en évidence une activité de transposition in vivo avec la transposase Mos1, le taux de cette transposition était variable avec les constructions utilisées dont la construction 3T3 a manifesté le meilleur taux (3.2×10^-5). Ils ont également montré que la transposition était inter-plasmidique car la transposition dans le génome bactérien n'a pas été observée (Figure 25) (Augé Gouillou et al., 2001).

Figure 25 : Une représentation schématique de la transposition inter-plasmidique obtenue avec la transposase Mos1 au cours des tests de transposition in vivo, la transposase assure le transfert du pseudo-transposon en l'insérant dans son site cible qui se duplique au cours de l'insertion et qui est porté par le gène du chloramphénicol. (d'après Augé Gouillou et al., 2001).

Conclusion et perspectives

Le rôle des éléments transposables est de deux aspects distincts. Un premier aspect évolutif parce qu'ils contribuent d'une façon très significative dans la plasticité et l'évolution des génomes. Ils participent également à la création des nouveaux gènes donc à la création de nouvelles fonctions. Le deuxième aspect est orienté vers les domaines d'application de ces éléments dans les biotechnologies. Il s'est avéré que les propriétés des différents éléments leur confèrent l'aptitude d'être des bons candidats en vectorologie.

Une des familles des transposons s'avère de plus en plus intéressante comme des outils très convenables aux applications en biotechnologie et en thérapie génique, elle est la famille mariner. Sa découverte permet d'envisager la mise au point d'un système de transgénèse ubiquiste facile à utiliser (Renault et al., 1999), En effet, la mise en évidence des transposases résistantes à des températures élevées issues des organismes des sources hydrothermales océaniques constituerait un plus pour les manipulations in vivo et in vitro. De toute façon, les transposons mariner sont des transposons dont les différents composants nucléiques et protéiques ne contiennent pas les solutions optimales pour la transposition. Cette propriété permet l'amélioration de ses aptitudes à intégrer de l'ADN exogène par ingénierie moléculaire, soit par modification des ITR pour l'augmentation de l'intégration, ou aussi par modification de la transposase par mutagénèse pour obtenir une activité catalytique plus efficace. L'utilité des transposons mariner dans la transgénèse est conférée par le fait qu'ils assument les étapes les plus importantes permettant le transfert du gène d'intérêt, ainsi in vitro des transposases mariner suggèrent qu'elles n'exigent pas des cofacteurs pour leur catalyse au sein des cellules vivantes (Laraespada, 2003).

amplification of Tourist-like MITEs and a new Superfamily of transposases. Genetics, Vol 98, n°22, 12572-12577.