Chapitre 2. Matériels et méthodes
2.1 Partie bactériologique
2.1.1 Matériels biologiques
Des prélèvements nasaux ont été
effectués au niveau du service néonatal du CHU de Tlemcen par
technique d'écouvillonnage, puis acheminés au laboratoire de
microbiologie pour être incubés 24H à 37C° dans du
bouillon Giolitti Cantoni en présence de 5 gouttes de Téllurite
de potassium.
L'isolement et la purification de souches ont été
assistés et dirigés par Monsieur REBIAHI au niveau du laboratoire
de Microbiologie du nouveau pole de l'université de Tlemcen.
2.1.2 Méthodes biologiques
La purification s'effectue par repiquage sur bouillon et
gélose de Chapman.
2.1.2.1 Coloration de Gram
Elle permet de mettre en évidence les
propriétés de la paroi bactérienne. L'avantage est de
donner des résultats rapides.
Elle nécessite 2 étapes :
Un frottis : fixation à la chaleur
Sur une lame on a déposé une goutte d'eau , on a
ajouté une goutte de la colonie isolée à l'aide d'une anse
de platine , étaler et fixer à la chaleur environ 10 à 15
min à 40°c .
La coloration
La lame séchée était posée sur le
portoir reposant sur un bac de coloration.
1. Violet de gentiane ou cristal violet 30 sec à 1 min.
Rincer à l'eau.
2. Mordançage au Lugol. C'est un mordant permet la
fixation 20 sec.
3. Rincer à l'eau.
4. Décoloration à l'alcool (méthanol) sur
une lame inclinée 5 à 10 sec.
5. Rincer à l'eau.
6. Recoloration à la safranine ou la Fushine 30 sec
à 1 min.
7. Laver la lame et la sécher sur une platine chauffante
à 40°c 10 minutes.
Observation sur microscope
On a observé que c'est des cocci à G+
assemblés en amas formant grappe de raisin.
2.1.2.2 Ensemencement sur Chapman
- C'est un milieu de culture sélectif (critère de
classification).
- L'ensemencement était fait par la technique
d'épuisement. - Les staphylocoques se développent rapidement
à 37°c.
- La plupart des souches élaborent un pigment jaune
doré.
2.1.2.3 Coagulase libre
L'activité de la coagulase de staphylococcus
aureus sur le plasma humain a été prise comme un
critère principal pour différencier les espèces de genre
staphylococcus à coagulase positif des autres espèces du genre
staphylococcus à coagulase négatif (SCN).
Principe
Le principe de ce test est de mettre en contact du plasma
oxalaté à une culture bactérienne sur un bouillon Cur-
Cerveau.
Technique
Ajouter 0,5 ml du plasma dans un tube contenant 0,5 ml de culture
BHIB additionnée de la souche à testé ensuite
homogénéiser et incuber a 37°C pendant 24h, le
résultat positif se traduit par la formation d'un caillot sur le fond du
tube, le mélange est observé d'heure en heure car le coagulum
peut être suivi d'une redissolution du caillot provoquée par la
fibrinolyse (Denis et al ; 2007).
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