B- Amplification des vecteurs d'expression recombinant
a. Transformation bactérienne
Cinquante microlitres de bactéries compétentes
(Escherichia coli DH5á rendues chimiocompétentes par le
chlorure de rubidium, 108 bactéries/ml) ont été
transformées par incubation de 30 minutes dans la glace en
présence de 1ìl de plasmide, suivie d'un choc thermique par
incubation de 30 secondes à 42°C. Les bactéries ont ensuite
été étalées sur gélose nutritive LB (Luria
Bertani), contenant 10 mg/mL d'ampicilline et incubées à
37°C pendant 16 heures. Ainsi seules les bactéries
transformées avec les constructions pSFV pourront pousser et former des
colonies puisqu'elles contiennent une cassette de résistance à
l'ampicilline.
b. Maxipréparation classique et vérification
des clones recombinants
Des maxipréparations d'ADN plasmidique
ont ensuite été réalisées sur un clone
bactérien ayant
poussé sur LB pour chaque construction selon
un protocole classique. Une colonie provenant de
chaque construction a
été ensemencée dans 500 mL de milieu LB/ampicilline et
incubée pendant
16 heures à 37°C sous agitation. La
culture bactérienne a été culottée par
centrifugation de 30
minutes à 4 000 g à 4°C
(Centrifugeuse Jouan GR 4.11), et le culot a été resuspendu dans
8 mL de
Tampon Glucose/Tris EDTA (GTE) (Glucose 500 mM, Tris 30 mM [pH 8],
EDTA 10 mM)
contenant 50 mg/mL de lysozyme (Sigma). Après une
incubation de 15 minutes dans la glace, 16
mL de tampon de lyse SDS/NaOH
(SDS 35 mM, NaOH 0,2M) ont été ajouté suivi
d'une
incubation de 5 minutes dans la glace. La lyse a été
arrêtée par adjonction de 12 mL d'acétate de
potassium 3 M. Ce lysat a été incubé 15
minutes dans la glace avant d'être centrifugé 30 minutes
à
4 000 g à 4°C. Un demi volume d'isopropanol a
été ajouté au surnageant préalablement
filtré, et le
tout a été incubé 20 minutes dans
la glace, puis centrifugé 20 minutes à 4 000 g à 4°C.
Le culot a
été resuspendu avec 5 mL de tampon Tris/EDTA (TE)
(Tris/HCl 10 mM [pH 8], EDTA 1mM) et
5 mL de chlorure de lithium (LiCl 0,5 M, Tris/HCl 50 mM [pH
7,5]) incubé 15 minutes dans la glace et centrifugé 20 minutes
à 4 000 g à 4°C. L'ADN présent dans le surnageant a
été précipité à -20°C pendant 30
minutes avec deux volumes d'éthanol absolu, puis centrifugé 30
minutes à 4 000 g à 4°C. Le culot a été
resuspendu dans 2 mL de tampon TE suivi d'une incubation d'une heure à
37°C en présence de 30 j.iL de ribonucléase (10 mg/mL). Le
mélange a été incubé toute la nuit à
37°C avec 40 j.iL de protéinase K (10 mg/mL) (Boerhringer
Mannheim). L'ADN plasmidique a été extrait et purifié par
ajout de 500 j.iL de phénol/chloroforme et centrifugé 10 minutes
à 4 000 g. L'ADN présent dans la phase aqueuse a
été précipité à -20°C durant 30 minutes
avec 300 j.iL d'éthanol absolu en présence de 30 j.iL
d'acétate d'ammonium. Après une centrifugation de 15 minutes
à 16 000 g, le culot d'ADN a été lavé à
l'éthanol 70% et a été repris dans 300 j.iL de TE, et
quantifié par spectrophotométrie (SmartSpec, Biorad) à 260
nm. La présence des inserts a été vérifiée
par digestion enzymatique grâce à XmaI puisque deux sites
de restriction XmaI sont présents de part et d'autres du
gène d'intérêt. Le sens des inserts a été
également contrôlé par une deuxième réaction
enzymatique avec l'enzyme BamHI, qui coupe une seule fois dans
l'insert (à la fin de la séquence NS4B) et une seule fois dans le
vecteur pSFV1 (en amont du site multiple de clonage du pSFV1).
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