MATERIEL ET METHODE
A- Constructions plasmidiques en système
pSFV
a. Le système d'expression pSFV
Le Virus de la Forêt de Semliki se compose d'un
génome ARN + monocaténaire circulaire appelé ARN 42S(+)
qui possède un fort potentiel d'auto-réplication
conféré par ses protéines non structurales dont les
séquences sont situées en amont du promoteur SFV (P26S)
contrôlant les séquences codant les protéines structurales.
L'utilisation du SFV comme vecteur d'expression consiste à remplacer les
séquences des protéines structurales par un gène
d'intérêt. Ce vecteur nécessite une linéarisation et
une transcription in vitro puisqu'il ne possède pas de
promoteur eucaryote, ainsi l'ARN 42S(+) obtenu est transfécté
dans des cellules permissives (telles que les BHK-2 1 qui permettent une
expression satisfaisante de ce vecteur). Les protéines non structurales
traduites par les ribosomes, s'assemblent et vont fixer l'ARN 42S(+) en 3' et
synthétiser un ARN 42S de polarité négative (ARN 42S(-))
qu'elles ensuite vont lier en 5' afin de former un nouvel ARN 42S(+) qu'elles
vont à son tour fixer en 3' et produire un nouvel ARN 42S(-). Ceci va
aboutir à l'accumulation d'ARN 42S(-), matrice pour la synthèse
de la protéine d'intérêt, et les protéines non
structurales se désassemblent et fixe alors le promoteur SFV (P26S) afin
de transcrire le gène cloné qui sera alors traduit. Finalement on
obtient une production élevée de protéine
d'intérêt.
b. Les constructions vectorielles
A mon arrivée, l'équipe avait déjà
cloné spécifiquement la protéine non structurale NS4B de
la souche JFH-1 du VHC dans le système SFV et disposait de deux
constructions contrôles SFV. Ainsi, 4 constructions étaient
disponibles. (Figure I)
La construction PSFV-NS4B/HA, contenant la protéine
NS4B du VHC avec une étiquette HA (oligopeptide issu de
l'hémagglutinine du virus de la grippe, séquence PYDVPDYA). En
effet, du fait de l'absence d'anticorps dirigés contre la
protéine NS4B de la souche JFH-1 nous avons choisi de marquer cette
protéine en C-terminale avec une étiquette HA. Toutefois, la
présence de l'épitope HA pouvant modifier la topologie
membranaire de la protéine, une autre construction sans étiquette
nommé pSFV-NS4B avait été générée
afin de préserver l'ultrastructure membranaire des cellules exprimant la
protéine NS4B native. Le vecteur pSFV-âgal, qui contient le
gène codant la â-galactosidase (enzyme cellulaire cytosolique et
ubiquitaire) constitue un
témoin négatif de transfection. Enfin un vecteur
pSFV1-C191 contenant le gène codant la protéine de capside du
VHC, ayant la propriété de s'auto assembler pour former des
pseudo-particules visualisable en microscopie électronique (Blanchard
et al, 2003 [11]), est utilisé comme témoin positif.
pSFV-NS4B/HA
11893 N
pb
pSFV- -gal
pSFV_C191
pSFV-NS4B
13078
11869
1 1572
pb
pb
pb
Protéines non-tructurales du pSFV
Insert cloné dans le pSFV
NS1 NS2 NS3 NS4 NS4B
NS1 NS2
NS1 NS2 NS3 NS4 C191
S1 NS2
NS3 NS4 NS4B HA
NS3 NS4 -gal
pSFV 11O33 pb
NS4B 836 pb
NS4B-HA 860 pb
-gal 2045 pb
C191 539 pb
Témoin (+)
Témoin (-)
Figure I. Représentation schématiques des
constructions vectorielles réalisées.
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