Memoire Online - Evaluation bactériologique des eaux de consommation des populations de Ngoa-Ekélé à Yaoundé

? Critères d'inclusion : sont à considérer pour cette étude les éléments suivants, les points d'eau (sources, forages, pompes et puits) de la localité où les populations viennent s'abreuver, tout individu de ladite localité faisant valoir de façon volontaire, son approbation à participer à notre étude.

? Critères d'exclusion : sont exclus de cette étude, les points d'eau dont l'accès est refusé au grand public, toute personne vivant dans la localité mais qui ne consomme pas les eaux de la localité, toute personne d'âge inférieure à 18ans, toute personne faisant valoir son droit de retrait de participation à notre étude qu'importe le moment avant divulgation des résultats et toute personne dont on aurait eu à perdre ses données.

3.3 Modalités de recrutement

Pour cette étude, nous effectuons des descentes en journée au niveau des points d'eau d'intérêt de la localité et nous soumettions le questionnaire à tout individu inclut précédemment qui sera présent lors de notre échantillonnage sur les sites et tout individu de la localité rencontré dans leur domicile pendant nos descentes sur le terrain. Au final nous avons obtenus 53 questionnaires remplis par 53 participants de la localité.

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Matériel : Solution hydro alcoolique, récipient d'eau, marqueur, papier, stylo, glacière contenant des glaçons

Après s'être nettoyé les mains, le récipient est tenu de telle sorte que l'eau de source puisse s'écouler dans ce dernier jusqu'à ce qu'il soit rempli. Par la suite, ce récipient est fermé hermétiquement et étiqueté pour être rangé dans une glacière. La figure ci-après représente notre premier point d'échantillonnage de la localité.

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Matériel : savon, solution de décontamination, une éponge, récipient d'eau, marqueur, papier, stylo, glacière contenant des glaçons

Après avoir décontaminé le saut qui sert à recueillir l'eau au niveau du site ainsi que nos mains, l'eau est recueillie dans le puits à l'aide de ce saut et par la suite, elle est transvasée dans notre récipient que nous fermions hermétiquement. Pour clore, l'étiquetage de l'échantillon est effectué et il est rangé dans la glacière. Les figures ci-après représentent nos points d'échantillonnage complémentaires à la source.

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a. PRESENTATION DU MATERIEL ET CONSOMMABLES, DES REACTIFS ET DES EQUIPEMENTS UTLISÉS POUR L'ANALYSE

Pour l'analyse de nos échantillons, nous avons eu recours à l'usage du matériel, consommables, réactifs et équipements consignés dans ce tableau.

Tableau 4 : Présentation du matériel, consommables, réactifs et équipements pour

Matériel et consommables	Réactifs	Équipements
Stylo	Eau distillée	Distillateur
Papier format	Milieux EMB, BEA, Eau	Autoclave
Marqueur permanant	peptonnée, Sélénite,	Incubateur
Burette graduée	Hektoen, Kliger	Réfrigérateur
Ballon à fond plat	Violet de gentiane	Balance
Boites de pétri	Lugol	Vacupum
Tube en verre de culture	Alcool-acétone	Microscope
Membranes filtrantes	Fuschine	Ordinateur
Échantillon d'eau	Huile à immersion	Minuteur
Pince	Disques d'oxydase
Bec bunsen	Péroxyde d'hydrogène
Gaz	Galérie miniaturisée API 20^E
Anse	Huile de paraffine
Pipette pasteur	Chlorure ferrique
Lame porte-objet	VP1-VP2
Papier absorbant	Réactif de KOVACK'S
Tubes à hémolyse	Solution de décontamination
Conteneurs de déchets

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C'est la technique de concentration la plus utilisée au laboratoire pour ce qui est de l'analyse des eaux. Le plus généralement, on procède à une filtration sur membranes en esters de cellulose, de porosité 0,22 ìm ou 0,45 ìm, susceptibles de retenir les bactéries. Après filtration de l'eau à étudier, la membrane est déposée sur un milieu gélosé approprié. Ceci permet aux colonies de coliformes de se développer préférentiellement au cours d'une incubation de 18 à 24 heures, et sous un aspect suffisamment caractéristique pour autoriser un diagnostic présomptif. Celui-ci peut d'ailleurs être confirmé par des repiquages judicieux. Son domaine d'application privilégiée est les eaux claires ne contenant pas de matières en suspension susceptibles de colmater : eaux d'alimentation, de surface et de baignade claires. (L'analyse de l'eau - 10e éd. - Jean Rodier,Bernard Legube,Nicole Merlet, s. d.)

Le dispositif dans son ensemble comporte les éléments suivants : Un entonnoir-réservoir cylindrique ou conique, en acier inoxydable ou plastique à usage unique, de taille variable généralement de 50 à 500 mL, gradué. Ce réservoir est destiné à être appliqué exactement sur la surface plane, cylindrique, du support métallique lui servant de base. Un support métallique formant une sorte de cuvette conique dont le bord supérieur reçoit une plaque poreuse (généralement de 50 mm de diamètre) destinée à supporter une membrane filtrante de même diamètre. La partie inférieure de la cuvette est prolongée par un tube creux, muni d'un robinet, permettant le passage d'une aspiration par trompe à vide et l'évacuation du liquide filtré. Un dispositif d'assemblage des deux pièces précédentes, variable selon le modèle d'appareil (collier de serrage, pince amovible, clip, etc.) permet de solidariser réservoir et support et d'assurer l'étanchéité, en évitant toute fuite du liquide contenu dans le réservoir. Un matériel de liaison supportant l'ensemble de cet appareil de filtration et le reliant à un dispositif d'obtention du vide. Dans sa version la plus simple, représentée sur le schéma, il consiste en une fiole à vide en verre, de capacité suffisante pour éviter des vidanges trop fréquentes de l'eau filtrée (5 litres par exemple), reliée à une trompe à eau ou une pompe à vide par l'intermédiaire d'un flacon de garde, muni d'un manomètre. Dans des dispositifs plus complexes, la fiole à vide est remplacée par une rampe supportant plusieurs appareils de filtration. La face supérieure du support métallique et la plaque poreuse au contact avec la

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face supérieure de la membrane sont généralement stérilisées à la flamme. Le réservoir peut être stérilisé de la même façon. Directement au contact des eaux analysées, son flambage doit être particulièrement soigné ; le refroidissement est alors relativement long, d'où l'avantage des entonnoirs à usage unique. Les membranes filtrantes utilisées sont généralement constituées par des esters de cellulose ; le diamètre des pores est généralement de 0,45 ìm (parfois de 0,22 ìm). Un quadrillage en surface facilite les dénombrements bactériens.

Flamber la face supérieure (plaque poreuse) de l'appareil. Fermer le robinet du support et mettre en marche la pompe à vide. Prélever une membrane stérile en la saisissant par son bord extérieur, avec une pince flambée et refroidie ; la déposer sur la plaque poreuse. L'entonnoir-réservoir flambé et refroidi est placé au-dessus de la membrane. Installer le dispositif de fixation (dans certains modèles d'appareils, ce dispositif, toujours prévu, est inutile, l'adhérence du réservoir sur la membrane étant suffisante). Agiter soigneusement le flacon d'eau à analyser et verser l'eau, stérilement, dans le réservoir jusqu'au repère (50 ou 100 mL selon l'appareil et selon le type d'analyse pratiquée). Ouvrir le robinet du support suffisamment pour laisser l'eau s'écouler lentement sous l'action du vide. Si le contenu du réservoir correspond à la prise d'essai nécessaire, rincer avec de l'eau stérile (40 à 50 mL) dès la filtration terminée. Sinon, fermer le robinet à ce moment-là, remplir à nouveau le réservoir avec de l'eau à analyser, et rincer lorsque tout l'échantillon a été filtré. Dès que la membrane paraît sèche, fermer le robinet, enlever le dispositif de fixation et, avec la pince à creuset, le réservoir. Prélever la membrane avec une pince flambée en la saisissant par son extrême bord, et l'introduire sur le milieu de culture choisi ou lui faire subir le traitement selon la méthode utilisée parmi celles qui seront décrites ultérieurement. Lorsque le volume d'échantillon à filtrer est important, et que la teneur en matières en suspension n'est pas négligeable, la membrane peut être colmatée avant l'utilisation complète de la prise d'essai nécessaire à analyser. Plusieurs membranes devront donc être successivement utilisées. Remarques - Un matériel permettant de filtrer au lieu même de prélèvement l'échantillon à étudier est commercialisé. La membrane peut alors être placée sur un milieu de transport et transférée après retour au laboratoire sur un second milieu constituant le milieu d'inoculation définitif. - La membrane peut également être immédiatement placée sur le milieu définitif et aussitôt incubée dans les conditions particulières pour sélectionner les catégories de germes que l'on veut étudier. Utiliser pour cela, des incubateurs pouvant fonctionner dans un véhicule.

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La membrane après la filtration peut être déposée sur la surface d'une gélose. Les bactéries retenues à la surface sont nourries à travers la membrane par les pores de celle-ci. Dans le cas des eaux d'alimentation ou des eaux de surface de bonne qualité, il n'y a généralement aucune difficulté à filtrer 100 mL. La sensibilité est donc, dans ce cas, 100 fois supérieure à celle obtenue normalement par incorporation en gélose, 20 fois à celle-ci lorsque l'inoculum peut exceptionnellement être porté à 5 mL. Pour de telles eaux, des volumes plus importants peuvent souvent être filtrés. Les avantages de cette méthode sont : absence de choc thermique, différenciation plus aisée des colonies, possibilité de repiquage. En outre, la filtration permet de séparer les bactéries du milieu analysé, donc des éventuels inhibiteurs contenus dans ce milieu. Néanmoins, il n'est pas possible, sur la surface des membranes (généralement de 50 mm de diamètre), de dénombrer valablement plus de 80 à 100 colonies car, au-delà, les phénomènes de confluence et surtout de compétitions sont considérés comme importants. Il convient donc dans ce cas d'effectuer des dilutions. De plus, la présence abondante de matières insolubles dans l'échantillon filtré (fin dépôt minéral, plancton, etc.) peut colmater les pores, faire obstacle au passage des nutriments et donner ainsi des résultats erronés par défaut. Le support utilisé pour la membrane peut être soit une gélose pour isolement, le plus souvent sélective en vue de la mise en évidence de germes ou de groupes de germes déterminés ; soit un tampon absorbant imprégné de solution nutritive. Le dépôt de la membrane sur la gélose ou le tampon absorbant doit être fait avec le plus grand soin, sans permettre à des bulles d'air de séparer en quelque point que ce soit la membrane de son support. Pour cela, saisir la membrane par une pince à son extrême bord, la mettre en contact par l'extrémité opposée avec le support nutritif ; puis la dérouler, en quelque sorte, sur celui-ci, ce qui assure progressivement le contact. L'expression des résultats se fait sous forme d'un nombre d'unités formant colonies (UFC).

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c. ALGORITHMES DE RECHERCHE DES COLIFORMES, DES ENTEROCOQUES ET DES SALMONELLES

Mise en culture de la
membrane filtre de
notre échantillon dans
milieu EMB à 37°C
pour 24h

Réalisation test de
catalase et test
d'oxydase, obtention
catalase+ et oxydase-

Mise en culture de la
membrane filtre de
notre échantillon
dans le milieu BEA à
37°C pendant 24h

En cas de croissance,
on note le virage du
milieu au noir et le
Gram présente des
cocci Gram+ en
chenette

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Mise en culture de la
membrane filtre de notre
échantillon dans le milieu
eau peptonnée pour le
préanrichissement à 37°C
pendant 24h

Mise en cuture du
bouillon d'enrichissement
dans le milieu Hektoen
par la méthode des
quadrans, isolement de
colonies à 37°C après
24h

Identification des
salmonelles par mise en
culture de l'inoculum à
l'aide du milieu Kliger à
37°C pour 24h

Lorsque les échantillons parviennent au laboratoire, la prise du pH, la description de la couleur et de la turbidité sont réalisées. Par la suite, la filtration des échantillons (eaux) est réalisée grâce au dispositif de pompe prévu à cet effet. Chaque échantillon est filtré individuellement selon les proportions indiquées en fonction du germe qu'on souhaite isolé dans un milieu. Ainsi, 100ml d'eau sont filtrés autour de la flamme en ayant au préalable aseptisé tous les entonnoirs à la flamme et la membrane filtrante est déposée dans le milieu EMB pour le dénombrement des coliformes en particulier Escherichia coui. Il en est de même pour la membrane suivante qui est mise dans le milieu BEA pour le dénombrement des entérocoques. Les boites sont étiquetées et mise à l'étuve à 37 °C pour 24h. Puis, 1000ml d'eau sont filtrés pour la recherche des salmonelles et la membrane est introduite à l'aide de la pince dans un tube pour culture contenant de l'eau peptonnée. Le tube est mis à l'étude à 37°C pour 24h. La figure ci-après présente le dispositif de filtration employée pour nos échantillons dans l'environnement de travail.

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Figure 10 : Dispositif de filtration de l'eau dans l'environnement d'analyse

Les milieux de culture sont sortis de l'étuve après 24h d'incubation. La description des colonies avec dénombrement par UFC pour 100ml est réalisée pour chaque milieu de chaque échantillon filtré et renseignée sur la fiche de paillasse. Sur EMB, les colonies sont roses d'aspect visqueux, de taille égale à 5um et d'autres sont rouges de plus petite taille en fonction de chaque échantillon. Sur BEA, les colonies sont de très petite taille, d'aspect noir et transparente pour certaine en fonction de l'échantillon d'eau filtré. Dans le tube de culture, l'on observe le milieu qui est devenu trouble tirant vers le blanc pour certains échantillons. De ce bouillon, 1ml est prélevé et introduit dans un tube de culture contenant du milieu sélénite et remis à l'étuve pour 24h à 37°C. Les figures ci-après présentent les aspects de ces différentes croissances en fonction des milieux.

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Par la suite, des frottis sont réalisés sur lame porte-objet à l'aide de colonies isolées prises individuellement sur dans chaque milieu, additionnées à de l'eau distillée stérile. Ces frottis sont colorés au Gram. La lecture microscopique est effectuée après séchage des lames. Les lames des colonies roses et rouges sur EMB présentes des bacilles Gram-, celle des colonies noires et transparentes prises sur BEA présentes des cocci à Gram+. Les figures ci-après illustrent les lames suite à la coloration de Gram.

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En continuité, des tests de catalase et d'oxydase sont réalisés pour une colonie isolée de chaque échantillon pour chacun des milieux utilisés. Les bactéries possédant une chaîne respiratoire complète sont dotées d'un cytochrome oxydase. La mise en évidence de cette oxydase est effectuée en présence d'une solution aqueuse à 1% de chlorhydrate de diméthylparaphénylène diamine qui forme un complexe violet au contact de cette enzyme. Les colonies sont prélevées à l'aide d'une pipette Pasteur. Placer un disque d'oxydase sur une lame propre et stérile. À l'aide d'une pipette Pasteur (il est strictement interdit d'utilisé l'anse de platine pour ne pas fausser le résultat) une goutte de suspension bactérienne pure est déposée sur " un disque oxydase", celui-ci contient de l'oxalate de diméthyl paraphénylène diamine. Les bactéries oxydase-positives donnent rapidement une coloration violette foncée ; dans le cas contraire, il n'y a pas de coloration.

Certaines bactéries ont la faculté de dégrader le peroxyde d'hydrogène (H2O2). En présence d'une bactérie productrice de catalase, on observe à partir d'H2O2 une libération d'oxygène gazeux selon la réaction : H2O2 donne H2O + 1/2O. La méthode consiste à prélever une colonie du germe à étudier (ex. les staphylocoques pour les Gram + et les entérobactéries pour les Gram -) sur l'extrémité d'une anse de platine que l'on plonge ensuite dans une goutte d'eau oxygénée (à l'aide d'une pipette Pasteur). Le dégagement de bulles gazeuses signe la présence de l'enzyme.(Denis et al., 2012)

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Les tests de catalase effectués sur les colonies roses et rouges sur EMB sont tous positifs et ceux d'oxydase négatifs. Les tests de catalase effectués sur les colonies noires et transparentes de BEA sont tous négatifs et oxydase positifs. Les figures suivantes illustrent des résultats de catalase et d'oxydase de certains échantillons.

Pour clore cette journée, des suspensions bactériennes sont réalisées à l'aide de l'eau distillée stérile et de colonie isolée prise individuellement dans chaque milieu EMB de chaque échantillon à l'aide d'une anse, autour de la flamme. Suivant le principe d'utilisation de la mini galerie APÏ 20^E, après l'avoir étiqueté, la suspension est prélevée à l'aide d'une micropipette et mise dans les 20 puits constituant la mini galerie de façon à remplir jusqu'au bas inférieur de l'orifice d'ouverture, les puits des caractères biochimiques ONPG, TDA, IND, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY et ARA uniquement à l'aide de cette suspension sans bulle d'air. De façon à remplir totalement l'orifice des puits des caractères biochimiques CIT, VP, et GEL uniquement à l'aide de la suspension. De façon à remplir jusqu'au bas inférieur de l'orifice d'ouverture des puits des caractères biochimiques ADH, LDC, ODC, H2S et URE à l'aide de cette suspension à laquelle on rajoutera de l'huile de paraffine jusqu'au niveau du haut supérieur de l'orifice d'ouverture de ces puits afin de créer l'anaérobiose. Les galeries sont ainsi constituées pour chaque colonie sur EMB de chaque échantillon et mises à l'incubateur à 37°C pour 24h. La figure ci-après illustre la mini galerie remplie avant son incubation.

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Les milieux en tube incubés sont sortis après 24h et à l'aide d'une anse, des ensemencements par la technique des cadrans sont réalisés dans des géloses Hektoen pour chaque échantillon à l'aide des bouillons sélénite obtenus. Ces géloses sont étiquetées et mises à l'incubateur pour 24h à 37°C. Les mini galeries sont sorties également après 24h et la lecture est lancée. Pour chaque galerie, une lecture avant révélation est réalisée et au moins trois caractères se doivent d'être positifs pour que la révélation puisse être effectuée, sinon ré-incubation de la galerie à 37°C pour 24h. La révélation est faite pour les caractères biochimiques TDA, IND et VP respectivement à l'aide des réactifs suivants : chlorure ferrique, VP1-VP2 et réactif de Kovack's. La réaction dure 10min pour la TDA, 5min pour IND et VP puis, puis la lecture est réalisée. Cette lecture est basée sur le virement de couleur ou pas observable au niveau du puits de chaque caractère. Les résultats de lecture sont exprimés en positif ou négatif pour chaque caractère, et consignés dans le calepin du kit API 20^E puis, présentés au final après séparation des caractères en groupe de 3 et 2, en un des groupes de chiffre qui constitue le nombre qui permet d'identifier spécifiquement le germe isolé lors de la culture. Cette identification a été réalisé à l'aide du logiciel APIDENT version 2.0 sur un ordinateur de marque DELL. Certaines souches n'ont pas été identifiables. Les figures ci-après illustrent l'aspect des milieux sélénites après incubation, une galerie après incubation et un résultat d'identification fournie par le logiciel APIDENT.

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Figure 18 : Aspect de quelques milieux Sélénite après incubation durant 24h à 37°C

Figure 19 : Aspect d'une micro gallérie API 20E après incubation durant 24h à 37°C

Figure 20 : Résultat d'identification des entérobactéries avec le logiciel APIDENT

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Les géloses Hektoen sont sorties après 24h et des suspensions sont de nouveau réalisées à l'aide des colonies isolées sur ce milieu pour chaque échantillon. Par le suite à l'aide de suspension des différentes colonies isolées sur Hektoen en fonction des échantillons, des ensemencements sont réalisés sur milieu Kliger, milieu solide coulé en pente pour l'identification des germes en partant du suppositoire qu'il s'agisse des salmonelles. À l'aide d'une anse, la suspension d'un échantillon unique est prélevée et une piqure centrale dans le culot de la pente est réalisée puis, au niveau de la pente, des stries longitudinales sont effectuées en sortant du tube. Les tubes sont étiquetés, fermés de moitié et mis à l'incubateur pour 24h à 37°C. Les figures ci - après illustrent le milieu Kliger après ensemencement et l'aspect des colonies sur milieu Hektoen après 24h d'incubation à 37°C.

Les milieux sont sortis après 24h et la description de chacun est effectuée et consignée dans la fiche de paillasse. Principe de la production d'H2S, la mise en évidence de la production d'H2S se fait grâce à la présence de thiosulfate de sodium et de citrate ferrique (fer III). En effet, chez une souche dite H2S +: Le thiosulfate est réduit en anaérobiose en H2S. L'H2S ainsi formé se combine au citrate de fer présent pour former un précipité de sulfure de fer noir. Principe de la lecture de la fermentation des glucides, le milieu de Kligler

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contient 2 glucides: glucose et lactose (10 fois plus de lactose que de glucose). Les entérobactéries utilisent d'abord le glucose et ensuite, éventuellement le lactose. La production de gaz se traduit par l'apparition de bulles au niveau du culot, ou encore par la formation d'une poche qui décolle complètement le milieu du fond du tube. (Denis et al., 2012)

La production de gaz est visible de par la fragmentation de la gélose initialement stable en un bloc lors de l'ensemencement. Certains culots de pente sont à présents jaunes, c'est la marque de l'utilisation du glucose par les bactéries tandis que d'autres reste oranges. Certaines pentes prennent la couleur jaune qui marque l'utilisation du lactose par les bactéries pendant que d'autres demeurent de couleur orange. Aucune production de H2S n'a été observable pour les échantillons testés, du fait de l'absence de points noirs dans le milieu. L'identification des germes isolés pour tous les échantillons testés n'aura permis de détecter des salmonelles dans les échantillons. Les figues ci-après illustrent les milieux Kliger après incubation lorsqu'il y'a utilisation de lactose et glucose par la bactérie.

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Lors de la préparation des milieux de culture employés pour les analyses, les milieux autoclavables ont bien été autoclavés et leurs coulages se sont faits dans les boites de pétri et dans les tubes de culture autour de la flamme. Suite aux préparations des milieux, des tests de stérilité, de fertilité et de spécificité ont été réalisés pour chaque milieu avant utilisation et leur conservation s'est faite entre 2 et 8°C au réfrigérateur pendant deux semaines.

Lors du processus d'analyse, toutes les manipulations effectuées ces jours ont été effectuées dans le respect des principes d'asepsie indiqués pour ces dernières, ce sont : la décontamination de la surface de travail avant et après chaque manipulation, la stérilisation avant passage de chaque échantillon des accessoires du Vacupum pour la filtration et la réalisation de celle-ci autour de la flamme, la stérilisation des tubes où ont été réalisées les suspensions, le travail permanent autour de la flamme pour ne citer que ceux-là. Les algorithmes d'identification des gerles établies ont scrupuleusement été suivis.

L'analyse de nos échantillons a pris forme dès la base sur la méthode de la filtration sur membrane avec dénombrement après incorporation de la membrane en milieu solide et isolement des salmonelles après usage de la membrane filtre en milieu liquide. Cependant, cette méthode ne permet d'isoler que certains germes (coliformes, entérocoques, salmonelles) tout en excluant la possibilité d'en isoler d'autres. Il serait approprié de concilier d'autres méthodes d'analyse pour s'assurer à plus grande échelle d'isoler la quasi-totalité des germes à

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rechercher dans les eaux de boisson, ce sont : la méthode par incorporation en milieu liquide pour l'isolement des bactéries sulfito-réductrices, la méthode utilisant le NPP Pour l'isolement de Vibrio cholerae et bien d'autres.

Les difficultés rencontrées durant cette collecte ont été présentes à plusieurs niveaux, déjà au niveau de l'obtention d'autorisations administratives de collecte pour effectuer la collecte d'échantillon et pour la réalisation des enquêtes auprès des populations de la localité de Ngoa-Ékélé, puis lors de l'achat et rassemblement du matériel du fait de la rareté de

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certains produits. Aussi, quelques difficultés au départ en rapport à l'utilisation du dispositif de pompe, en rapport à l'analyse en elle-même. La plus grande difficulté s'est portée sur l'analyse statistique des résultats de nos analyses.

Comme limites de notre étude, il est à noter qu'elle offre des résultats qui ne donnent pas une connaissance globale sur la qualité bactériologique des eaux de consommation de la ville de Yaoundé et encore moins du Cameroun, du fait qu'elle ne concerne qu'une petite portion de la ville en elle-même. À cela s'ajoute le fait que la recherche, de par les ressources disponibles n'a pu rendre possible l'isolement de toutes les bactéries impliquées dans les survenues maladies d'origine hydrique qui ne cessent d'être des problèmes de santé publique et qui constituent des références qualité pour les eaux. Aussi nous n'avons pu analyser les eaux des points différents des sources et puits de la localité mentionnés dans ce travail, notamment les forages, pompes et rivières du fait qu'il a été impossible de les répertorier.

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3.2 Critères de sélection des participants

3.3 Modalités de recrutement