Méthode de détection des microorganismes dans les aliments

SOMMAIRE

INTRODUCTION 2

I. METHODES DE DETECTIONS DES MICROORGANISMES 2

1.1 La méthode d'isolement ou ACP 2

1.2 La méthode du nombre le plus probable (NPP) 3

1.2.1 Quantification des Escherichia coli dans les eaux 3

1.3 Un test de présence-absence : La méthode Colilert 5

1.4 Test à la membrane filtrante 5

1.5 Mesures du métabolisme 5

1.6 Test Immunologique 6

1.7 Mise en évidence d'enzyme et coenzymes 6

II. CLASSE D'INTERPRETATION DES RESULTATS 6

2.1 Résultats chiffrés 6

2.2 Résultats non chiffrés 6

CONCLUSION 7

INTRODUCTION

La présence de microorganismes dans les aliments peut constituer un danger pour le consommateur. Il est donc nécessaire de mettre en place des voies et moyens pour détecter les microorganismes présents dans les aliments. Les Méthodes de détection sont utilisées soit pour dénombrer, soit pour déceler la présence d'un microorganisme spécifique.

Quelles sont alors les méthodes pour détecter la présence de microorganismes dans les aliments ?

Dans cet exposé, nous allons présenter les différentes technologies qui permettent de détecter les microorganismes dans les aliments.

I - METHODES DE DETECTIONS DES MICROORGANISMES

Les différentes méthodes se basent sur les propriétés physico-chimiques et biochimiques de ceux-ci. Les méthodes usuelles sont :

La membrane filtrante, la méthode du nombre le plus probable (NPP), la méthode d'isolement suivie d'épreuves (sérologique, biochimique), les techniques immunologiques, la mesure du métabolisme, l'utilisation de bactériophase, l'étude des variations du pH ou du potentiel redox, la recherche d'enzymes ou de coenzymes.

1.1 La méthode d'isolement ou ACP

Le principe de la technique est d'arriver à isoler le genre recherché après plusieurs opérations (dilutions successives, utilisation d'un milieu gélosé) et par la suite d'appliquer des tests de confirmation suivant les spécificités du genre étudié (épreuves biochimiques, épreuve sérologiques...).

Pour le genre Salmonella, les opérations suivantes sont à effectuer :

- pré enrichissement : immersion à l'eau peptonnée (EPT), incubation à 37°C (6 à 20h)

- Enrichissement : ensemencement des milieux à partir de l'ETP et mise en incubation soit à 37° soit à 43°C.

- Isolement sur milieu gélosé sélectif : Gélose au rouge de phénol et vert brillant et gélose sélective.

L'épreuve biochimique vérifie l'appartenance au genre Salmonella par la détermination de ses caractères spécifiques. Les méthodes sérologiques quand à elles, se font par épreuve d'agglutination sur lame afin de dégager la formule antigénique de Salmonella.

Pour les bactéries thermorésistantes, le TSC à 43°C donne de bons résultats. La méthode d'isolement s'applique à la quasi totalité des genres bien connu : Staphylocoques, Pseudomonas, Coliformes, Clostridium, Campylobacter....

Filtration sur membrane et incubation :

Filtrer 100mL d'échantillon sur membrane stérile

Placer la membrane sur TTC tergitol

Incuber à (36#177; 2) °C pendant (21 #177; 3) heures

Et pendant (24 #177; 2) heures de plus si les colonies ne sont pas

caractéristiques

Lecture et Confirmation

Les colonies caractéristiques sont les bactéries lactose positives.

A partir de 10 colonies isolées, effectuer les tests de confirmation :

Oxydase et production d'indole

Expression des résultats :

Nombres de coliformes et Escherichia coli / 100mL d'échantillon

Figure 1 : Schéma de la méthode d'isolement ou ACP

1.2 La méthode du nombre le plus probable (NPP)

Le Nombre le Plus Probable (NPP) est une estimation statistique de la densité des microorganismes et des intervalles de confiance sont attachés à cette estimation moyenne.

Selon le centre d'expertise en analyse environnementale (Quebec) de la revue MA. 700- Ecct du 30 Avril 2003, le principe de la méthode NPP (NPP signifie nombre le plus probable) consiste à ensemencer de nombreux volumes ou des dilutions d'un même échantillon dans des tubes de bouillon d'enrichissement et par la suite à confirmer la présence de salmonelles par repiquage des tubes sur gélose sélective.

Chacune des géloses sélectives positives correspond à un tube d'enrichissement particulier. Le nombre le plus probable de salmonelles peut alors être estimé dans une quantité spécifiée d'échantillon à partir du nombre et de la répartition des tubes positifs.

Elle s'applique aux résidus des fabriques de pâtes et papiers, aux composts domestiques ainsi qu'à toutes les matrices solides ou liquides. Cette méthode peut être utilisée également comme test présence-absence dans le cas où seulement la présence de salmonella est requise.

Les résultats sont exprimés avec un intervalle de confiance (95%).

1.2.1 Quantification des Escherichia coli dans les eaux (NF CEN ISO 9308-3 de mars 1999)

Cette méthode miniaturisée pour ensemencement en milieu liquide (Nombre le Plus Probable) vise à quantifier les Escherichia coli dans les eaux de surface et les eaux résiduaires.

L'échantillon à analyser est dilué puis ensemencé dans une série de puits d'une microplaque contenant le milieu de culture déshydraté et les dilutions sont adaptées au niveau de contamination supposé de l'eau prélevée. Les microplaques sont examinées sous rayonnement ultraviolet à 366 nm dans l'obscurité après une période d'incubation de 36 h minimum et 72 h maximum à 44°C #177; 0.5°C. La présence d'Escherichia coli est indiquée par une fluorescence bleue résultant de l'hydrolyse du 4-Méthylumbelliféryl-b-D-glucuronide (MUG) par une enzyme (b-D-glucuronidase) présente chez cette bactérie entérique.

Le Nombre le Plus Probable (NPP) est une estimation statistique de la densité des microorganismes et des intervalles de confiance sont attachés à cette estimation moyenne.

Exemple de calcul :

Dilution	Nombre de tubes positifs
1/2	24 sur 24
1/20	18 sur 24
1/200	05 sur 24
1/2000	01sur 24m/24

Le nombre caractéristique retenu pour l'évaluation de la contamination colimétrique sera 18 - 5 - 1. Avec ce nombre caractéristique, on se réfère à la table de Mac Grady qui définit, pour chaque nombre caractéristique, un indice correspondant à la quantité moyenne de bactéries contenue dans chaque tube de la série la plus concentrée. le nombre probable d'E. Coli dans 100 ml de l'échantillon analysé est obtenu ensuite en tenant compte de la quantité de la suspension mère ensemencée et de la dilution opérée (18.5.1 = 15908 E. coli/100 ml).

Figure 2 : Schéma de la méthode du nombre le plus probable

1.3 Un test de présence-absence : La méthode Colilert

C'est une méthode colorimétrique pour la détection et la numération dans les eaux de boissons des Escherichia coli à â-glucuronidase positive et des coliformes à â-galactosidase positive.

Un volume de 100 ml d'échantillon d'eau est mélangé dans une bouteille stérile avec le milieu de culture Colilert®. Ce mélange est ensuite incubé pendant 24 h à 35 °C. Le milieu de culture Colilert® contient de l'ONPG (ortho-nitrophényl-ß-galactopyranoside) et du MUG (4-méthylumbélliféryl-ß-D-glucuronide). Lorsque des coliformes totaux sont présents dans l'échantillon, l'ONPG est utilisé par l'enzyme ß-D-galactosidase, une enzyme spécifique au groupe des coliformes totaux. L'utilisation de l'ONPG provoque l'apparition d'une coloration jaune dans le milieu de culture. Lorsque E. coli est présent dans l'échantillon, le MUG est utilisé par l'enzyme ß-D-glucuronidase, une enzyme spécifique à E. coli. L'utilisation du MUG amène une fluorescence bleue dans le milieu de culture lorsque ce dernier est éclairé avec une lumière fluorescente d'une longueur d'onde de 366 nm.

Cette méthode permet de détecter la présence de coliformes totaux et fécaux ainsi que de E. coli dans les échantillons d'eau.

1.4 Test à la membrane filtrante

Le principe est d'utiliser une membrane organique ajustée à la taille du genre recherché afin d'empêcher si possible son passage au cour d'une opération de filtrage. Le composé filtré est testé pour observer les variations biochimiques. Elle s'applique aux Coliformes et au Campylobacter.

La technique du filtre à membrane est une technique très reproductible. Il peut être utilisé pour tester des volumes relativement importants de l'échantillon et donne des résultats numériques plus rapidement que la procédure multitubes. La technique de filtration sur membrane est extrêmement utile dans la surveillance de l'eau potable et une variété d'eaux naturelles. Cependant, la technique a ses limites, en particulier lorsque les eaux de tests à forte turbidité ou noncoliforme (fond) des bactéries. Pour ces eaux ou lorsque la technique de filtration sur membrane n'a pas été utilisé auparavant, il est souhaitable d'effectuer des tests en parallèle avec la technique de fermentation en tubes multiples afin de démontrer l'applicabilité et la comparabilité.

1.5 Mesures du métabolisme

Par le dosage des produits du métabolisme on peut établir une corrélation entre les productions du métabolisme et la croissance bactérienne. Nous avons l'exemple de l'acide lactique avec Lactobacillus : la croissance du Lactobacillus est proportionnelle à la production d'acide lactique.

Le métabolisme de la flore totale peut provoquer une variation des propriétés du milieu.

Les mesures répétées de l'impédance, la conductance et la capacitance peuvent renseigner sur la présence de flore qui peut s'avérer utile pour le contrôle d'aliment. Les deux principaux systèmes disponibles sont : L'analyseur Mathus et le bactometer de Bioméreux. Elle S'applique quasiment à tous les genres.

1.6 Test Immunologique

Après traitement, l'échantillon est inoculé à une souris ; on détecte ensuite la présence d'anticorps spécifique dans le sérum de la souris. Dans le cas de Clostridium botulinum, le test est caractérisé par la mort de la souris.

1.7 Mise en évidence d'enzyme et coenzymes

On met en évidence des propriétés spécifiques à la flore étudiée, par des tests positifs négatifs. Pour Clostridium Perfringens, après préparation de l'échantillon, on met en évidence, la lécithinase pour son action sur le blanc d'oeuf (production d'opalescence). La toxine témoigne de la présence d'au moins 10⁶ cellules/g.

Le TSC est un bon milieu gélosique pour la détermination du genre Clostridium sur la base de leur propriété sulfitoreducteur.

Dans AFNOR, NF V08-014, La confirmation de la présence de Staphylococcus aureus (productrice de coagulase libre) repose sur une réaction positive au test de coagulase libre.

II- CLASSE D'INTERPRETATION DES RESULTATS

2.1 Résultats chiffrés

Ils concernent les méthodes de dénombrement des microorganismes présents.

Leur interprétation fait intervenir un taux de qualité

On a :

- Les unités formant colonies (UFC) :

- Le nombre le plus probable (NPP) :

Lorsqu'on a utilisé plus de trois séries de tubes, choisir la plus petite quantité d'échantillon donnant un certain nombre de résultats positifs ainsi que les deux séries de tubes précédents. Multiplier l'indice lu dans la table NPP par le facteur de dilution

utilisé pour obtenir l'estimation du nombre d'organismes présents dans le volume de référence. Elle a pour unité, NPP/g de matière sèche ou NPP/ml

- Le nombre de la flore par ml ou g (/ml ou /g).

- Présence ou absence de flore dans X ml ou g

2.2 Résultats non chiffrés

Ils sont appropriés pour les techniques de détection de présences.

On a comme résultat absence ou présence de flore 

conclusion

Au terme de cette étude, nous pouvons déduire que plusieurs méthodes sont utilisées pour la détermination des microorganismes dans les aliments. Cependant ces méthodes sont spécifiques selon les microorganismes recherchés. Aussi est-il nécessaire d'imposer une réglementation assurant la qualité sanitaire mais aussi marchande des aliments produits.